本申请案要求2016年7月29日提交的美国临时申请案第62/368,840号的权益，该临时申请案通过引用整体并入本文。
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发明背景
本发明总体涉及农业、植物生物技术和分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于在转基因植物中进行重组蛋白表达的组合物及其使用方法。
相关技术的描述
农作物生产通常利用具有经修饰的基因组，包括使用分子生物学方法产生的转基因性状的作物。例如，可以将异源基因(也称为转基因)引入植物基因组中。转基因在植物中的表达赋予植物诸如除草剂耐受性或昆虫防治的性状。通过利用异源基因表达元件可以实现转基因在植物中的成功表达。这方面的一个实例是使用与重组蛋白可操作地连接的转运肽，以实现重组蛋白的亚细胞定位，从而增强蛋白质表达或功能。因此需要能够在植物细胞内有效定位重组蛋白的新型转运肽。
技术实现要素：
一方面，本发明提供了一种重组dna分子，其包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。在另一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白包含与选自seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228的序列含至少97％同一性的氨基酸序列。再一个实施方案中，编码转运肽的所述dna序列包含与选自seqidno:54-99和seqidno:267-297的序列含至少97％同一性的核酸序列。还有另一个实施方案中，编码异源除草剂耐受性蛋白的所述dna序列包含与选自seqidno:121-162和seqidno:183-223、seqidno:229-235的序列含至少97％同一性的核酸序列。再另一个实施方案中，所述重组dna分子还包含与编码转运肽的所述dna序列可操作地连接的异源启动子。
另一方面，本发明提供了一种dna构建体，其包含本文提供的dna分子，诸如包含编码转运肽的dna序列的重组dna分子，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性，与异源启动子可操作地连接的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。在另一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白包含选自seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228的氨基酸序列。再另一个实施方案中，所述dna构建体存在于转基因植物、种子或细胞的基因组中。
再一方面，本发明提供了一种转基因植物、种子或细胞，其包含本文提供的重组dna分子，诸如包含编码转运肽的dna序列的重组dna分子，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述植物、种子或细胞耐受至少一种ppo除草剂。在另一个实施方案中，所述ppo除草剂选自：三氟羧草醚(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、唑啶草酮(azafenidin)、唑草酮(carfentrazone-ethyl)、甲磺草胺(sulfentrazone)、氟噻甲草酯(fluthiacet-methyl)、丙炔噁草酮(oxadiargyl)、噁草酮(oxadiazon)、吡草醚(pyraflufen-ethyl)、苯嘧磺草胺(saflufenacil)和s-3100。再一个实施方案中，所述转基因植物、种子或细胞耐受至少第二种除草剂。
另一方面，本发明提供了一种重组蛋白，其以可操作的连接包含：a)转运肽，包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少95％同一性的氨基酸序列；和b)异源除草剂耐受性蛋白。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。再一方面，本发明提供了一种转基因植物、种子或细胞，其包含本文提供的重组蛋白。
再另一方面，本发明提供了一种产生耐除草剂植物的方法，其包括以下步骤：a)用重组dna分子转化植物细胞，所述重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列；并且b)由其再生包含所述dna分子的耐除草剂植物。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白包含选自seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述方法还包括使所述再生植物与其自身或与第二种植物杂交以产生一种或多种后代植物的步骤。再另一个实施方案中，所述方法还可包括选择耐受至少一种ppo除草剂的后代植物的步骤。在某些实施方案中，所述ppo除草剂选自：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑草酮、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺和s-3100。
再一方面，本发明提供了一种产生耐除草剂的转基因植物或种子的方法，其包括使包含本文提供的重组dna分子的植物与其自身或与第二种植物杂交以产生耐除草剂的转基因植物或种子。在某些实施方案中，所述重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列。
再另一方面，本发明提供了一种在植物或细胞中表达异源除草剂耐受性蛋白的方法，所述方法包括使包含重组dna分子的植物或细胞生长，所述重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列，其中所述生长导致所述异源除草剂耐受性蛋白的表达。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。
另一方面，本发明提供了一种控制或防止植物生长区域中的杂草生长的方法，其包括向包含本文提供的转基因植物或种子，诸如包含重组dna分子的转基因植物或种子的植物生长区域施用有效量的至少一种ppo除草剂，所述重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列，其中所述转基因植物或种子耐受所述ppo除草剂。在某些实施方案中，所述ppo除草剂选自：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑草酮、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺和s-3100。
再一方面，本发明提供了控制耐除草剂的杂草生长的方法，其包括：a)在植物生长区域栽培本文提供的植物或种子，例如包含重组dna分子的植物或种子，所述重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列含至少97％同一性的氨基酸序列；并且b)向所述植物生长区域施用ppo除草剂和至少一种其它除草剂，其中所述植物或种子耐受所述ppo除草剂和所述至少一种其它除草剂。在某些实施方案中，所述ppo除草剂选自：三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草灵、乙羧氟草醚、乙氧氟草醚、丙炔氟草胺、唑啶草酮、唑草酮、甲磺草胺、氟噻甲草酯、丙炔噁草酮、噁草酮、吡草醚、苯嘧磺草胺和s-3100。在另一个实施方案中，植物或种子耐受的所述其它除草剂选自：accase抑制剂、als抑制剂、epsps抑制剂、合成生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂、hppd抑制剂、ppo抑制剂和长链脂肪酸抑制剂。在另外的实施方案中，所述accase抑制剂为芳氧苯氧丙酸酯或环己二酮；als抑制剂为磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶或三唑啉酮；epsps抑制剂为草甘膦；合成生长素为苯氧基类除草剂、苯甲酸、羧酸或缩氨基脲；光合作用抑制剂为三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑或脲；谷氨酰胺合成酶抑制剂为草铵膦；hppd抑制剂为异噁唑、吡唑啉酮或三酮；ppo抑制剂为二苯醚、n-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮或嘧啶二酮；或极长链脂肪酸抑制剂为氯乙酰胺、氧乙酰胺或吡唑。
再另一方面，本发明提供了一种重组dna分子，其包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源除草剂耐受性蛋白的dna序列可操作地连接，其中所述转运肽包含与选自seqidno:236-266的序列含至少95％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白具有除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶活性。在另一个实施方案中，所述异源除草剂耐受性蛋白包含与选自seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228的序列含至少95％同一性的氨基酸序列。再一个实施方案中，编码转运肽的所述dna序列包含与选自seqidno:267-297的序列含至少95％同一性的核酸序列。再另一个实施方案中，编码异源除草剂耐受性蛋白的所述dna序列包含与选自seqidno:121-162和seqidno:183-223、seqidno:229-235的序列含至少95％同一性的核酸序列。还有另一个实施方案中，所述重组dna分子还包含与编码转运肽的所述dna序列可操作地连接的异源启动子。
序列简述
seqidno:1-2和seqidno:236是拟南芥白化体(arabidopsisthalianaalbino)和浅绿色(apg6)转运肽的氨基酸序列。
seqidno:3是棉花12g088600tp转运肽的氨基酸序列。
seqidno:4-49和seqidno:237-266是转运肽的氨基酸序列。
seqidno:50-52和seqidno:267是编码apg6转运肽的核酸序列。
seqidno:53是编码棉花12g088600tp转运肽的核酸序列。
seqidno:54-99和seqidno:268-297是分别编码seqidno:4-49和seqidno:237-266的示例性核酸序列。
seqidno:100-119是hemg原卟啉原氧化酶的氨基酸序列。
seqidno:120是来自于糙果苋(amaranthustuberculatus)(苋菜藤子)(wh)的野生型原卟啉原氧化酶的氨基酸序列。
seqidno:121-162和seqidno:229是编码seqidno:100-119的示例性核酸序列。
seqidno:163-182和seqidno:224-228是hemy原卟啉原氧化酶的氨基酸序列。
seqidno:183-223和seqidno:230-235是编码seqidno:163-182和seqidno:224-228的示例性核酸序列。
具体实施方式
提供以下描述和定义以更好地定义本发明并指导本领域普通技术人员实施本发明。除非另有说明，否则术语应根据相关领域普通技术人员的常规用法来理解。
将转运肽与异源蛋白可操作地连接利用转基因植物细胞的蛋白定位系统来实现异源蛋白的亚细胞定位。在异源蛋白易位到细胞器内的过程中在加工步骤中将转运肽从异源蛋白上去除。特定转运肽与特定异源蛋白的组合在植物中表达时，其性质无法预测并且是出乎意料的。例如，亚细胞定位效率和加工(从异源蛋白上去除转运肽)的效率不同并且可受转运肽、异源蛋白或两者的氨基酸序列的影响。这些变量影响异源蛋白的功能和含量，并因此而影响包含异源蛋白的转基因细胞、植物或种子的表型。本领域已知各种转运肽用于转基因植物中，但鉴于亚细胞定位和加工效率的可变性以及新转基因性状的不断开发，需要新型转运肽。
本发明提供了用于有效靶向植物细胞内的异源蛋白的新型、重组dna分子。异源蛋白的有效靶向涉及转运肽和异源蛋白组合的有效亚细胞定位以及由异源蛋白加工转运肽。虽然用于将异源蛋白定位在细胞内的转运肽是已知的，但是任何转运肽和异源蛋白组合的定位和加工程度不同。定位和加工影响异源蛋白的表达水平和功能，并因此而影响包含异源蛋白的细胞、植物或种子的表型。例如，转运肽和除草剂耐受性蛋白组合的无效定位和加工可导致转基因植物的除草剂耐受性差。
本发明通过提供新型重组dna分子克服了这些障碍，所述新型重组dna分子能够通过改善定位和加工而提供有效的蛋白质靶向。本发明的重组dna分子包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码异源蛋白的dna序列可操作地连接。在一个实例中，本发明的重组dna分子包括但不限于包含编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码耐除草剂的原卟啉原氧化酶的dna序列可操作地连接。还提供了使用这些重组dna分子的组合物和方法。
重组分子
如本文所用，术语“重组”是指是基因工程的结果并且通过人为干预产生的非天然dna、蛋白质、细胞、种子或生物体。“重组dna分子”是并非天然存在的dna分子，因此是人为干预的结果，诸如由至少两个彼此异源的dna序列的组合组成的dna分子。重组dna分子的实例是本文提供的dna分子，其编码本发明的转运肽，诸如包含选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列的转运肽，与编码本发明的除草剂耐受性蛋白，诸如包含选自seqidno:100-119、163-182和224-228的序列的原卟啉原氧化酶的dna分子可操作地连接。“重组蛋白”是由于人为干预而产生的蛋白质，其不是天然存在的。重组蛋白的实例是本文提供的蛋白，其包含本发明的转运肽，诸如包含选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列的转运肽，可操作地连接到异源蛋白，诸如本发明的除草剂耐受性蛋白，例如，包含选自seqidno:100-119、163-182和224-228的序列的原卟啉原氧化酶。重组细胞、种子或生物体是包含转基因或异源dna或蛋白质的细胞、种子或生物体，例如包含本发明的异源dna分子或异源蛋白的转基因植物细胞、种子、植物或植物部分。
如本文所用，术语“分离的dna分子”意指dna分子单独存在或与其它组合物以组合存在但不在其自然环境内。本发明的dna分子是分离的dna分子，只要该dna分子不在其天然存在的生物体的dna内的基因组位置即可。例如，包含编码蛋白质的dna序列和异源转运肽dna序列的重组dna分子，当在某种情况下在不是天然存在编码蛋白质的dna序列和异源转运肽dna序列的基因组(诸如转基因植物、种子、植物部分或细胞的基因组)中发现时，认为它是分离的。
如本文所用，术语“基因工程”是指使用生物技术(诸如分子生物学、蛋白质生物化学、细菌转化和植物转化)产生、修饰或生成dna分子、蛋白质、细胞或生物体。因此，基因工程是人为干预的结果。例如，基因工程可用于使用一种或多种分子生物学技术，诸如基因克隆、dna连接和dna合成产生编码包含选自seqidno:4-49和seqidno:236-266的序列的转运肽的重组dna分子，其可操作地连接到编码除草剂耐受性蛋白，诸如包含选自seqidno:100-119、163-182和224-228的序列的原卟啉原氧化酶的dna分子。此类重组dna分子任选地还可包含在植物细胞中有功能的异源启动子。
如本文所用，关于蛋白质的“除草剂耐受性”或“耐除草剂的”是指在除草剂的存在下保持其至少一些活性或功能的能力。例如，如果原卟啉原氧化酶(ppo)在一种或多种ppo除草剂的存在下保持其至少一些酶活性，则它是耐除草剂的。除草剂耐受性可通过本领域已知的任何方法测量。例如，原卟啉原氧化酶的酶活性可以通过酶测定法来测量，其中在一种或多种ppo除草剂的存在下原卟啉原氧化酶产物的产生或原卟啉原氧化酶底物的消耗通过荧光、高效液相色谱法(hplc)或质谱法(ms)进行测量。用于测量原卟啉原氧化酶的酶活性的测定法的另一个实例是细菌测定法，诸如本文所述的生长测定法，由此重组原卟啉原氧化酶在细菌细胞中表达，否则缺乏ppo活性并且测量重组原卟啉原氧化酶补充这种敲除表型的能力。除草剂耐受性可以是对除草剂的完全或部分不敏感性，并且可以表示为对ppo除草剂的耐受性或不敏感性百分比(％)。如本文所用，“耐除草剂的原卟啉原氧化酶”在一种或多种ppo除草剂的存在下表现出除草剂耐受性。
如本文所用，关于生物体、植物、种子、组织、部分或细胞的“除草剂耐受性”或“耐除草剂的”是指施用时生物体、植物、种子、组织、部分或细胞抵抗除草剂作用的能力。例如，耐除草剂的植物可以在除草剂的存在下存活或继续生长。植物、种子、植物组织、植物部分或细胞的除草剂耐受性可以通过将植物、种子、植物组织、植物部分或细胞与合适的对照进行比较来测量。例如，可以通过将除草剂施用于包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(试验植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(对照植物)，然后比较两种植物的植物损伤来测量或评估除草剂耐受性，其中试验植物的除草剂耐受性由损伤率与对照植物的损伤率相比降低来指示。与对照植物、种子、植物组织、植物部分或细胞相比，耐除草剂的植物、种子、植物组织、植物部分或细胞对除草剂毒性作用表现出的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是与野生型植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。可以产生的具有本发明的除草剂耐受性性状的预期植物可以包括，例如任何植物，包括作物植物，诸如大豆(glycinemax)、玉米(zeamays)、棉花(gossypiumsp.)、小麦(triticumspp.)和芸苔属(brassica)植物等。
如本文所用，“hemg敲除品系”意指缺乏hemg活性至其无法在无血红素的生长培养基上生长的程度，或使得相对于包含功能性hemg的其它同基因品系，在没有血红素的情况下其生长明显受损的生物体或生物体细胞(诸如大肠杆菌(e.coli))。例如，鉴于大肠杆菌hemg序列(ecogene登录号eg11485；sasarman等人，“nucleotidesequenceofthehemggeneinvolvedintheprotoporphyrinogenoxidaseactivityofescherichiacolik12”canjmicrobiol39:1155-1161,1993)，可以根据本领域的知识制备例如大肠杆菌的hemg敲除品系。
术语“转基因”是指作为人为干预的结果例如通过植物转化方法人工并入到生物体基因组中的dna分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，“转基因性状”是指因并入植物基因组内的转基因的存在而传递或赋予的特征或表型。作为此类基因组改变的结果，转基因植物是与相关野生型植物明显不同的，并且转基因性状是野生型植物中未天然存在的性状。本发明的转基因植物包含本发明提供的重组dna分子。
如本文所用，术语“异源”是指两种或更多种本质上通常不相关的物质，例如源自不同来源或通常不以任何其它方式存在于自然界中的物质之间的关系。例如，如果通常不一起存在于自然界中或在相同背景下，则dna分子或蛋白质相对于另一dna分子、蛋白质、细胞、植物、种子或生物体可以是异源的。在某些实施方案中，如果两个dna分子通常在不一起存在于自然界中的相同背景下，则第一dna分子与第二dna分子是异源的，并且蛋白质相对于第二可操作连接的蛋白质诸如转运肽，如果此类组合通常不存在于自然界中，则是异源的。在另一个实施方案中，编码与原卟啉原氧化酶可操作地连接的转运肽的重组dna分子相对于在植物细胞中有功能的可操作连接启动子，如果此类组合通常不存在于自然界中，则是异源的。重组dna分子相对于将其插入的细胞、种子或生物体，当其不是天然存在于该细胞、种子或生物体中时也可以是异源的。“异源蛋白”是存在于植物、种子、细胞、组织或生物体中的蛋白质，其中它不天然存在或与其不天然连接的蛋白质可操作地连接。异源蛋白的实例是包含选自seqidno:4-49、236-266、100-119、163-182和224-228的序列的蛋白质，其在它不是天然存在于其中的植物、种子、细胞、组织或生物体中表达，或与未与之天然连接的第二蛋白诸如转运肽或耐除草剂蛋白可操作地连接。在另一个实例中，可以使用分子生物学和植物转化技术将异源蛋白，诸如异源除草剂耐受性蛋白，例如原卟啉原氧化酶引入它不是天然存在于其中的植物细胞中。
如本文所用，术语“编码蛋白质的dna分子”是指包含编码蛋白质的dna序列的dna分子。如本文所用，“编码蛋白质的dna序列”意指编码蛋白质的dna序列。编码蛋白质的dna序列可以是编码蛋白质，例如包含选自seqidno:4-49、236-266、100-119、163-182和224-228的序列的蛋白质的任何dna序列。如本文所用，术语“蛋白质”是指通过肽(酰胺)键连接的氨基酸链，并且包括以生物学功能方式折叠或排列的多肽链和不这样折叠或排列的的多肽链。“序列”意指核苷酸或氨基酸的有序排列。蛋白质编码序列的边界通常由5'末端的翻译起始密码子和3'末端的翻译终止密码子决定。
如本文所用，术语“除草剂耐受性蛋白”是指能够赋予细胞、组织、植物部分、种子或生物体除草剂耐受性的蛋白质。除草剂耐受性蛋白的实例是本领域熟知的，包括但不限于耐草甘膦的5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸合成酶(例如，cp4-epsps、2mepsps)、草甘膦氧化还原酶(gox)、草甘膦n-乙酰转移酶(gat)，耐除草剂的乙酰乳酸合成酶(als)/乙酰羟基酸合成酶(ahas)，耐除草剂的4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)、麦草畏单加氧酶(dmo)、草丁膦乙酰转移酶(pat)、耐除草剂的谷氨酰胺合成酶(gs)、2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(tfda)、r-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(rdpa)、s-2,4-二氯苯氧基丙酸双加氧酶(sdpa)、耐除草剂的原卟啉原氧化酶(ppo)和细胞色素p450单加氧酶。例如，包含选自seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228的氨基酸序列的原卟啉原氧化酶是耐除草剂的蛋白。
如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”和“表达蛋白质”意指通过将dna分子转录成信使rna(mrna)并将mrna翻译成多肽链的过程产生蛋白质，多肽链可能或可能不会最终折叠成蛋白质。编码蛋白质的dna分子可以与dna构建体中的异源启动子可操作地连接，以在用重组dna分子或其部分转化并因此而包含重组dna分子或其部分的细胞中表达蛋白质。如本文所用，“可操作地连接”意指以某种方式连接，使得一个可以影响另一个的功能的两个dna或蛋白质分子。可操作地连接的dna分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以相邻或可以不相邻。例如，启动子与dna构建体中编码蛋白质的dna分子可操作地连接，其中两个dna分子排列成使得启动子可以影响转基因的表达。在另一个实施方案中，两个或更多个蛋白质分子可以可操作地连接。例如，转运肽可以与异源蛋白，例如耐除草剂的蛋白可操作地连接。
在一个实施方案中，本发明的重组dna分子包括编码与转运肽序列可操作地连接的原卟啉原氧化酶(ppo)的dna序列。如本文所用，“原卟啉原氧化酶”或“ppo”意指能够将原卟啉原ix转化为原卟啉ix的氧化酶。此类原卟啉原氧化酶是本领域已知的并且包括，例如如同seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228提供的蛋白质序列。
在另一个实施方案中，本发明的重组dna分子包括编码转运肽序列的dna序列，所述转运肽序列与编码具有耐除草剂的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的异源核酸序列可操作地连接，由此转运肽序列促进将蛋白质分子定位在细胞内。转运肽在本领域中也称为信号序列、靶向序列、靶向肽和定位序列。转运肽的实例是叶绿体转运肽(ctp)、线粒体靶向序列(mts)或叶绿体和线粒体双重靶向肽。通过促进细胞内的蛋白质定位，例如定位到线粒体或叶绿体，转运肽确保蛋白质定位到细胞器以获得最佳酶活性并且可以增加蛋白质的积聚并保护蛋白质免于蛋白水解降解，和/或增强除草剂耐受性水平，从而降低除草剂施用后转基因细胞、种子或生物中的损伤水平。在易位到细胞器中时，转运肽通常从蛋白质上切割下来，也称为加工。转运肽加工可以是完整的(意指完整的转运肽从蛋白质的氨基末端切割下来)，不完整的(意指转运肽的一个或多个氨基酸留在蛋白质的氨基末端)，或导致从蛋白质的氨基末端去除一个或多个氨基酸。来自原卟啉原氧化酶的转运肽的完整加工增加了蛋白质积聚的水平，从而增加了ppo除草剂耐受性并降低了除草剂施用后转基因细胞、种子或生物体中的损伤水平。例如，转运肽可包含本发明的氨基酸序列，例如seqidno:1-49和seqidno:236-266提供的那些氨基酸序列。此类转运肽可以由本发明的核酸序列编码，例如由seqidno:50-99和seqidno:267-297提供的。
本发明的重组dna分子可以完全或部分通过本领域已知的方法合成和修饰，特别是在需要提供用于dna操作的序列(诸如限制酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物优选序列(诸如植物密码子使用或kozak共有序列)或用于dna构建体设计的序列(诸如间隔区或接头序列)的情况下。本发明包括与本文作为seqidno:1-297提供的任何dna分子或蛋白质序列具有至少90％序列同一性，至少91％序列同一性，至少92％序列同一性，至少93％序列同一性，至少94％序列同一性，至少95％序列同一性，至少96％序列同一性，至少97％序列同一性，至少98％序列同一性和至少99％序列同一性的dna分子和蛋白质。如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“序列同一性％”是指在两个序列进行最佳比对时(在比较窗口中，有适当的核苷酸或氨基酸插入、缺失或缺口，总计小于参考序列的20％)，与试验(“受试者”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或蛋白质序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过以下来进行：诸如smith和waterman的局部同源性算法，needleman和wunsch的同源性比对算法，pearson和lipman的相似性搜索方法等工具，以及这些算法的计算机化执行，诸如gap、bestfit、fasta和tfasta，其可作为
如本文所用，“dna构建体”是包含两个或更多个异源dna序列的重组dna分子。dna构建体可用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可以用于载体中进行转化，即将异源dna引入宿主细胞内，产生转基因植物和细胞，并且因而也可以包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质体dna或基因组dna中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化的任何重组dna分子。例如，序列表中列出的dna分子可以作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有与基因表达元件可操作地连接的dna分子，基因表达元件在植物中起作用以影响由该dna分子编码的蛋白质的表达。构建dna构建体和载体的方法是本领域熟知的。dna构建体的组分或包含dna构建体的载体通常包括与可转录的dna序列可操作地连接的一个或多个基因表达元件，诸如以下：用于表达可操作连接的dna的启动子，可操作连接的编码蛋白质的dna分子和3'非翻译区。可用于实施本发明的基因表达元件包括但不限于以下类型元件中的一种或多种：启动子、5'非翻译区、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、3'非翻译区和一种或多种选择标记转基因。
本发明的dna构建体可包括与本发明提供的编码蛋白质的dna分子可操作地连接的启动子，由此启动子驱动异源蛋白分子的表达。可用于实施本发明的启动子包括在细胞中起作用以表达可操作连接的多核苷酸的启动子，诸如细菌或植物启动子。植物启动子是不同的并且是本领域熟知的，包括诱导型、病毒、合成、组成型、时间调控、空间调控和/或时空调控的那些启动子。
在本发明的一个实施方案中，本文提供的dna构建体包括编码转运肽的dna序列，所述转运肽与编码具有耐除草剂的原卟啉原氧化酶活性的蛋白质的异源dna序列可操作地连接，由此转运肽序列促进将蛋白质定位在细胞内。
如本文所用，“对照”意指为比较目的而设计的实验对照。例如，转基因植物分析中的对照植物是与实验植物(即待测植物)相同类型的植物，但不含实验植物的转基因插入物、重组dna分子或dna构建体。可用于和转基因植物比较的对照植物的实例包括：对于玉米植物而言，非转基因lh244玉米(atcc保藏号pta-1173)；用于与转基因大豆植物比较：非转基因a3555大豆(atcc保藏号pta-10207)；用于与转基因棉花植物比较：非转基因coker130(植物品种保护(pvp)编号8900252)；用于与转基因油菜或欧洲油菜(brassicanapus)植物比较：非转基因欧洲油菜品种65037恢复系(加拿大植物育种者权利申请06-5517)；用于与转基因小麦植物比较：非转基因小麦品种samson种质(pvp1994)。
如本文所用，“野生型”意指天然存在的相似但不相同的形式。“野生型dna分子”或“野生型蛋白质”是dna分子或蛋白质的天然存在形式，即自然界中预先存在的dna分子或蛋白质形式。可用于与本发明提供的工程化蛋白质进行比较的野生型蛋白质的实例是来自拟南芥(arabidopsisthaliana)的原卟啉原氧化酶。“野生型植物”是与转基因植物相同类型的非转基因植物，因此在遗传上不同于包含除草剂耐受性性状的转基因植物。可用于比较的野生型植物的实例包括：对于转基因玉米植物而言，非转基因lh244玉米(atcc保藏号pta-1173)；用于与转基因大豆植物比较：非转基因a3555大豆(atcc保藏号pta-10207)；用于与转基因棉花植物比较：非转基因coker130(植物品种保护编号8900252)；用于与转基因油菜或欧洲油菜(brassicanapus)植物比较：非转基因欧洲油菜品种65037恢复系(加拿大植物育种者权利申请06-5517)；用于与转基因小麦植物比较：非转基因小麦品种samson种质(pvp1994)。
转基因植物与除草剂
本发明的一个方面包括含本发明提供的重组dna分子的转基因植物细胞、转基因植物组织、转基因植物和转基因种子。包含重组dna分子的这些细胞、组织、植物和种子对一种或多种ppo除草剂表现出耐受性，并且任选地对一种或多种另外的除草剂表现出耐受性。
用于转化宿主植物细胞以用于本发明的合适方法实际上包括可以将dna引入细胞内的任何方法(例如，其中重组dna构建体稳定整合到植物染色体中)并且是本领域熟知的。用于将重组dna构建体引入植物内的示例性方法包括农杆菌(agrobacterium)转化系统和dna粒子轰击，这两者都是本领域技术人员熟知的。将重组dna构建体引入植物内的另一种示例性方法是通过定点整合的方法将重组dna构建体插入植物基因组中的预定位点。定点整合可以通过本领域已知的任何方法完成，例如，通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、tale-核酸内切酶或rna引导的核酸内切酶(例如crispr/cas9系统)。可以由转化的植物细胞通过植物细胞培养的方法，或者通过从转基因植物获得插条并且使插条生根以建立转基因植物的营养克隆而再生转基因植物。相对于转基因是纯合(即转基因的两个等位基因拷贝)的转基因植物可以通过使含有单个转基因等位基因的转基因植物例如r0植物本身自花授粉(自交)获得，以产生r1种子。产生的r1种子的四分之一相对于转基因将会是纯合的。可以测试由发芽的r1种子长成的植物的接合性，通常使用snp测定、dna测序或允许区分杂合子和纯合子的热扩增测定(称为接合性测定)。
如本文所用，“除草剂”是用于控制、防止或干涉一种或多种植物的生长的任何分子。示例性除草剂包括乙酰coa羧化酶(accase)抑制剂(例如芳氧苯氧丙酸酯和环己二酮)；乙酰乳酸合成酶(als)抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶和三唑啉酮)；5-烯醇丙酮莽草酸3-磷酸合成酶(epsps)抑制剂(例如，草甘膦)、合成生长素(例如，苯氧基类、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用(光合体系ii)抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑和脲)、谷氨酰胺合成酶(gs)抑制剂(例如草铵膦和双丙氨磷(bialaphos))、4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(hppd)抑制剂(例如异噁唑、吡唑啉酮和三酮)、原卟啉原氧化酶(ppo)抑制剂(例如二苯醚、n-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮和嘧啶二酮)、极长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺和吡唑)、纤维素生物合成抑制剂(例如茚嗪氟草胺(indaziflam))、光合体系i抑制剂(例如百草枯(paraquat))、微管装配抑制剂(例如二甲戊乐灵(pendimethalin))和八氢番茄红素脱氢酶(pds)抑制剂(例如达草灭(norflurazone))等。
如本文所用，“ppo除草剂”是靶向和抑制原卟啉原氧化酶(ppo)的酶活性的化学物质，原卟啉原氧化酶催化原卟啉原ix脱氢形成原卟啉ix，其为血红素和叶绿素的前体。抑制原卟啉原氧化酶导致形成活性氧，导致细胞膜破坏并最终导致易感细胞死亡。ppo除草剂在本领域中是熟知的并且可商购获得。ppo除草剂的实例包括但不限于二苯醚(诸如三氟羧草醚及其盐和酯、苯草醚(aclonifen)、治草醚(bifenox)及其盐和酯、氟乳醚(ethoxyfen)及其盐和酯、氟硝基呋喃氟除草醚(fluoronitrofen)、呋氧草醚(furyloxyfen)、氟硝磺酰胺(halosafen)、甲氧除草醚(chlomethoxyfen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen)及其盐和酯、乳氟禾草灵及其盐和酯、乙氧氟草醚和氟磺胺草醚及其盐和酯)；噻二唑类(诸如氟噻甲草酯和噻二唑草胺(thidiazimin))；嘧啶二酮或苯基尿嘧啶类(诸如双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、[3-2-氯-4-氟-5-(1-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-1,2,3,4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(cas登记号353292-31-6，本文称为s-3100)、氟丙嘧草(flupropacil)、苯嘧磺草胺和tiafenacil)；苯基吡唑类(诸如异丙吡草酯(fluazolate)、派芬草(pyraflufen)和吡草醚)；噁二唑类(诸如丙炔噁草酮和噁草酮)；三唑啉酮类(诸如唑啶草酮、苯酰草酮(bencarbazone)、唑草酮(carfentrazone)及其盐和酯和甲磺草胺)；噁唑烷二酮类(诸如环戊噁草酮(pentoxazone))；n-苯基邻苯二甲酰亚胺(诸如吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac)、氟胺草酯(flumiclorac-pentyl)和丙炔氟草胺)；苯并噁嗪酮衍生物(诸如1,5-二甲基-6-硫氧代-3-(2,2,7-三氟-3,4-二氢-3-氧代-4-丙-2-炔基-2h-1,4-苯并噁嗪-6-基)-1,3,5-三嗪-2,4-二酮)；氟哒嗪草酮(flufenpyr)和氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl)；双唑草腈(pyraclonil)；和氟唑草胺(profluazol)。本发明提供的原卟啉原氧化酶和细胞、种子、植物和植物部分对一种或多种ppo除草剂表现出除草剂耐受性。
本发明提供的植物、种子、植物部分、植物组织和细胞对一种或多种ppo除草剂表现出除草剂耐受性。ppo除草剂可以施用于包含本发明提供的植物和种子的植物生长区域，作为防治杂草的方法。本发明提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状，因此对一种或多种ppo除草剂的施用具有耐受性。除草剂施用可以是推荐的商用率(1x)或其任何分数或倍数，例如推荐的商用率的两倍(2x)。根据除草剂和配方，除草率可以表示为克/公顷(g/h)或磅/英亩(lbs/英亩)、酸当量/磅/英亩(lbae/英亩)、酸当量/克/公顷(gae/ha)、活性成分磅数/英亩(lbai/英亩)或活性成分克数/公顷(gai/ha)。除草剂施用包含至少一种ppo除草剂。在除草剂施用时，植物生长区域可以包含或不包含杂草植物。用于区域中防治杂草的ppo除草剂的除草有效剂量在生长季节应该由约0.1x至约30x标记率的范围组成。表1中提供了一些示例性ppo除草剂的1x标记率。一(1)英亩相当于2.47105公顷，一(1)磅相当于453.592克。除草剂比率可以在英制单位与公制单位之间转换：(lbai/ac)×1.12＝(kgai/ha)，且(kgai/ha)×0.89＝(lbai/ac)。
表1：示例性ppo除草剂
除草剂施用可以依次进行或与一种、两种或几种除草剂的组合或任何其它相容除草剂罐内混合。一种除草剂或两种或更多种除草剂呈组合或单独的多次施用可以在生长季节用于包含本发明的转基因植物的区域，用于控制广谱的双子叶杂草、单子叶杂草或两者，例如，施用两次(诸如种植前施用一次和出苗后施用一次或出苗前施用一次和出苗后施用一次)或施用三次(诸如种植前施用一次、出苗前施用一次和出苗后施用一次或出苗前施用一次和出苗后施用两次)。
如本文所用，“杂草”是任何不期望的植物。植物通常可以被认为是对于农业或园艺目的而言不合需要的(例如，苋属物种)，或者在特定情况下可能被认为是不合需要的(例如，处于不同物种(也称为自生植物)的田间的一个物种的作物植物)。
本发明的转基因植物、后代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种附加性状。通过将含有包含本发明提供的重组dna分子的转基因的植物与含有一种或多种附加性状的另一植物杂交，可以引入附加性状。如本文所用，“杂交”意指使两株单独的植物繁殖以产生后代植物。因此两株植物可以杂交产生含有来自每个亲本的所需性状的后代。如本文所用，“后代”意指任何一代亲本植物的子代，并且转基因后代包含本发明提供的并且遗传自至少一种亲本植物的dna构建体。还可以通过用包含本发明提供的重组dna分子的dna构建体共转化针对该附加转基因性状的dna构建体(例如，所有dna构建体作为用于植物转化的相同载体的一部分存在)或通过向包含本发明提供的dna构建体的转基因植物中插入附加性状，或反之亦然(例如，通过对转基因植物或植物细胞使用任何植物转化或基因组编辑的方法)来引入附加性状。此类附加性状包括但不限于昆虫抗性增强、水利用效率提高、产量表现提高、抗旱性增强、种子质量提高、营养品质提高、产生杂种种子和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物测量的。示例性的附加除草剂耐受性性状可包括对一种或多种除草剂的转基因或非转基因耐受性，除草剂诸如accase抑制剂(例如芳氧苯氧丙酸酯和环己二酮)、als抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶和三唑啉酮)、epsps抑制剂(例如草甘膦)、合成生长素(例如苯氧基类、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑和脲)、谷氨酰胺合成抑制剂(例如草铵膦)、hppd抑制剂(例如异噁唑、吡唑啉酮和三酮)、ppo抑制剂(例如二苯醚、n-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮和嘧啶二酮)和长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺和吡唑)等。示例性的昆虫抗性性状可包括对鳞翅目(lepidoptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)、缨翅目(thysanoptera)、双翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)和直翅目(orthoptera)等的一种或多种内的一种或多种昆虫成员的抗性。此类附加性状是本领域技术人员所熟知的；例如，美国农业部(usda)动植物卫生检查处(aphis)提供了此类转基因性状的清单。
用本发明的多核苷酸(诸如表达构建体)转化的细胞，在将此类细胞再生成转基因植物之前或之后，可以选择以确定多核苷酸或其编码的酶活性存在。因此，可以例如通过鉴定包含所述多核苷酸或编码的酶活性，和/或相对于其他同基因对照植物展示出改变的性状的转基因植物来选择包含此类多核苷酸的转基因植物。此类性状可以是，例如对ppo除草剂的耐受性。
含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和后代可以与本领域公知的任何育种方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可以是独立分离的、连锁的，或在包含三种或更多种转基因性状的植物系中为两者的组合。还考虑了与亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，营养繁殖也是如此。通常用于不同性状和作物的育种方法的描述是本领域技术人员熟知的。为了证实植物或种子中转基因的存在，可以进行多种测定。此类测定包括，例如分子生物学测定，诸如southern和northern印迹、pcr和dna测序；生物化学测定，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(elisa和western印迹)或通过酶功能；植物部分测定，诸如叶或根测定；以及，通过分析整株植物的表型。为了分析转基因植物或种子中的转运肽加工，可以对获自转基因细胞、植物或种子的异源原卟啉原氧化酶蛋白进行诸如edman降解测序或质谱分析的测定，并将所得序列数据与原卟啉原氧化酶蛋白的序列数据进行比较。
作为回交转化过程的结果，实现了转基因性状向植物基因型的渐渗。转基因性状已经渗入其中的植物基因型可以称为回交转化基因型、品系、近交系或杂种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可称为未转化基因型、品系、近交系或杂种。
如本文所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。
已经详细描述了本发明，显而易见的是在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，修改、变化和等同实施方案是可能的。此外，应认识到提供本公开中的实例是作为非限制性实例。
实施例
将以下实施例包括在内是为了说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该认识到，以下实施例中公开的技术代表发明人发现会在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当认识到，可以在所公开的具体实施方案中进行许多变化，仍然获得相同或相似的结果而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，显而易见的是，化学和生理学相关的某些试剂可以替代本文所述的试剂，并获得相同或相似的结果。对于本领域技术人员显而易见的所有此类类似替代和修改都被认为是在所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念之内。
实施例1：转运肽的发现
从许多植物序列数据库中挖掘出新型转运肽。使用生物信息学方法和工具，如隐马尔可夫模型(hmm)、pfam数据库和基本局部比对搜索工具(blast)，鉴定数千个预测编码已知会定位到植物细胞中的叶绿体和线粒体的蛋白质(诸如原卟啉原氧化酶和热休克蛋白)的est和基因组序列。然后分析这些序列，并鉴定编码转运肽的序列。鉴定了数千个推定的转运肽序列，并评估了预测效力和对比序列多样性。从这些中，选择60种独特转运肽用于在植物细胞中克隆和实验，为其中一些产生变体(在本文中表示为“_var”)。表2提供了对应于每个转运肽及其变体的蛋白质和核苷酸序列的seqidno。
使用每种预测转运肽的序列合成编码转运肽的重组dna分子。产生dna构建体，其可操作地将每个转运肽与启动子和蛋白质编码序列连接。然后将这些dna构建体用于转化植物原生质体。将原生质体测定法与转化的植物原生质体一起用于在除草剂存在下测试转运肽对可操作连接的除草剂耐受性蛋白的功能活性。然后推进成功的候选物用于植物转化以实现转基因植物试验。
表2.转运肽
实施例2：ppo酶的发现
使用生物信息学方法和新型除草剂细菌筛选系统从微生物序列数据库鉴定出耐ppo除草剂的新型微生物hemg和hemy原卟啉原氧化酶。该筛选系统使用含有ppo除草剂的lb液体培养基中的hemg敲除大肠杆菌菌株的生长测定，以确认酶的原卟啉原氧化酶活性，并鉴定对ppo除草剂不敏感的原卟啉原氧化酶。简言之，用含有推定的原卟啉原氧化酶的细菌表达载体转化hemg敲除大肠杆菌菌株，并在lb液体培养基中培养。向培养基中添加五种不同ppo除草剂之一的纯化结晶形式(三氟羧草醚(1mm)、丙炔氟草胺(0.5mm)、乳氟禾草灵(0.5mm)、氟磺胺草醚(1mm)和s-3100(100μm)，代表三个不同的ppo化学亚类。使重组蛋白表达并测量大肠杆菌生长速率。测量不同变体在ppo除草剂存在和不存在时，在零到二十四小时的选定时间点的生长曲线(od600)。在ppo除草剂的存在下lb培养基中转化的hemg敲除大肠杆菌菌株的生长表明用于转化大肠杆菌的基因编码耐除草剂的原卟啉原氧化酶。表达对所有五种ppo除草剂都很敏感的苋菜藤子(wh)原卟啉原氧化酶(seqidno:120)的hemg敲除大肠杆菌菌株，用作对照以确认该测定可以区分对于每种除草剂的敏感性和耐受性原卟啉原氧化酶。
作为耐除草剂蛋白的原卟啉原氧化酶作为seqidno:100-119、seqidno:163-182和seqidno:224-228提供，并在表3中示出。编码原卟啉原氧化酶的dna序列可以包括5’末端的甲硫氨酸密码子，通常称为起始密码子，或者可以消除该密码子(和任选的几个氨基端氨基酸，例如2至7个)以促进转运肽序列与编码序列的5’末端的可操作连接。可以任选地合成编码原卟啉原氧化酶的dna序列，将其优化用于在单子叶植物或双子叶植物中表达。表3提供了针对在单子叶植物和双子叶植物中表达而优化的每种原卟啉原氧化酶dna序列。
表3.原卟啉原氧化酶
实施例3：原生质体中的转运肽和原卟啉原氧化酶试验
在植物原生质体中对与原卟啉原氧化酶可操作地连接的转运肽进行ppo除草剂耐受性试验。构建植物转化载体，其包含编码与转运肽可操作地连接的h_n90原卟啉原氧化酶的重组dna分子。然后将载体用于转化植物原生质体，评估其对ppo除草剂的敏感性。
产生植物转化载体，其包含(i)与转运肽可操作地连接的固定表达元件(启动子和3’utr)，所述转运肽与h_n90原卟啉原氧化酶可操作地连接。使用这种载体，测试68种转运肽并通过使用相同的原卟啉原氧化酶和每种载体中的其它表达元件来进行直接比较。产生具有相同固定表达元件的对照载体，其包含(i)无任何转运肽的h_n90原卟啉原氧化酶(h_n90对照)或(ii)无转运肽的绿色荧光蛋白(gfp)(gfp对照)。
使用标准方法转化大豆原生质体，并使其在1.0μm浓度的ppo除草剂s-3100的存在下生长。然后测定原生质体的ppo除草剂耐受性，相对于gfp对照进行表示(允许推导相对耐受性评分以实现实验之间的比较)。分两批进行测定，表示为实验1或实验2。测定重复进行四次，对每个转运肽的相对耐受性评分进行平均，并计算标准误差(se)。相对耐受性评分为50或更高的任何靶向肽均被视为在与除草剂耐受性蛋白可操作地连接时对于提供有效的亚细胞定位和加工非常有效，并且40-50的评分表明在与除草剂耐受性蛋白可操作地连接时对于提供有效的亚细胞定位非常好。gfp对照测定的耐受性评分为0，证实大豆原生质体在不存在除草剂耐受性蛋白的情况下不耐受ppo除草剂。h_n90对照测定的耐受性评分为24(实验1，se4)和11(实验2，se4)，而几种转运肽提供了更高的耐受性评分，表明有效的转运肽可以增强植物原生质体的除草剂耐受性。例如，表4中提供了评分为高效靶向肽的adadi_0544和kocsc_9516和被评分为很好的靶向肽的amapa_62652。
表4.原生质体测定结果
实施例4：大豆中的转运肽和原卟啉原氧化酶试验
在转基因大豆植物中测试与原卟啉原氧化酶可操作地连接的转运肽的ppo除草剂耐受性。构建植物转化载体，其包含dna构建体，所述dna构建体包含针对双子叶植物表达优化并编码与转运肽可操作地连接的原卟啉原氧化酶的重组dna分子。然后使用植物转化载体转化大豆，再生植物并评估其对ppo除草剂的敏感性。
编码七种hemg原卟啉原氧化酶h_n10、h_n20、h_n30、h_n40、h_n50、h_n90和h_n100的基因与三十七种不同的转运肽可操作地连接，并克隆到如实施例3中所述的基础植物转化载体中。这容许在每种dna构建体中使用相同的启动子和3'utr元件，对具有三十七种不同转运肽的七种不同hemg原卟啉原氧化酶进行并列比较。使用根癌土壤杆菌(a.tumefaciens)和本领域已知的标准方法，使用这些植物转化载体转化大豆切除的胚(种质a3555)。每种构建体接种四百个外植体。将无菌ppo除草剂溶液用于除草剂耐受性试验。除草剂溶液由0.3g的s-3100在作物油浓缩物(5.0ml)和495ml去离子水中组成。
转化五周后，以20g/ha比率为植物喷洒两次无菌ppo除草剂溶液。对于试验的每种dna构建体，测试四个容器，每个容器具有30-40株单独转化的植物。然后经过处理的小植株每天在喷洒后接受至少15小时的光照，持续四天。在s-3100施用后第四天结束时，对经过处理的小植株进行拍照，并以绿色着色(与光漂白组织相比，绿色着色代表健康的光合植物组织)与损伤的视觉比例进行评分。评分值为0，表示耐受性差、损伤高、绿色着色低；1表示有一定耐受性、平均损伤、中等绿色着色；2表示耐受性良好、损伤低、绿色着色高。表5中呈现了每种构建体的评分，其中n.d.表示未进行分析。结果表明，几种构建体提供了对ppo除草剂的耐受性。
表5.大豆5周时的耐受性评分
然后在转化后大约七周时移植对应于得分为2的构建体的未喷洒容器中的小植株，并使用本领域已知的标准方法使其生长作为r0植物。还使得对应于非耐受性评分为0和1的选定小植物生长以用作阴性对照。r0植物在温室中在长日照苗圃条件下(在80℉下18小时光照，然后在74℉下6小时黑暗)再生长大约四周。在转化后十一周时，为r0植物喷洒两次相同的上述除草剂溶液，最终施用率为20g/ha。对于试验的每种dna构建体，测试15-30株单独转化的植物。基于地上组织损伤的量对除草剂损伤等级进行视觉评分，其中0％是没有可见损伤而100％是植物完全死亡。非转基因对照植物的损伤等级评分高于30％。边缘耐受性为30％的损伤或更低，良好耐受性为20％的损伤或更低，并且优良耐受性被认为是10％的损伤或更低。处理七天后收集评分，并对每种dna构建体的所有植物取平均值。
在十一周时r0植物除草剂耐受性施用的结果证实了在五周时观察到的低百分比损伤等级评分。对于十一周的评价，30％或以上的任何损伤等级均等同于非转基因大豆损伤等级。几种构建体突出显示出对除草剂施用具有非常好的耐受性。例如，具有ppoh_n90(seqidno:110)的apg6(seqidno:1)仅具有3％的损伤，具有ppoh_n30(seqidno:113)的apg6(seqidno:1)或具有ppoh_n40(seqidno:114)的apg6(seqidno:1)各自仅有5％的损伤；具有ppoh_n90(seqidno:110)的转运肽camsa_6215(seqidno:21)仅具有5％的损伤。相比之下，具有ppoh_n90(seqidno:110)的转运肽amacr_2643(seqidno:33)具有50％的损伤评分。表6中提供了数据，其中n.d.表示未进行分析。
表6.大豆11周时的耐受性评分
编码十种hemy原卟啉原氧化酶r2n30、r2n40、r2n40opt、r2n70、r2n90、r2n100、r1n473、r1n533、r1n171、r1n311和r1n33的基因与三十九种不同的转运肽可操作地连接并克隆到如实施例3中所述的基础植物转化载体中。这容许在每种dna构建体中使用相同的启动子和3'utr元件，对具有三十九种不同转运肽的十种不同hemy原卟啉原氧化酶进行并列比较。使用根癌土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用这些植物转化载体转化大豆切除的胚(种质a3555)。每种构建体接种四百个外植体。将无菌ppo除草剂溶液用于除草剂耐受性试验。除草剂溶液由0.3g的s-3100在作物油浓缩物(5.0ml)和495ml去离子水中组成。
转化五周后，对于每种dna构建体，以20g/ha的最终施用率为四个容器(每个容器具有30-40株单独转化的植物)喷洒两次无菌ppo除草剂溶液。然后经过处理的小植株每天在喷洒后接受至少15小时的光照，持续四天。在s-3100施用后第四天结束时，对经过处理的小植株进行拍照，并以绿色着色(与光漂白组织相比，绿色着色代表健康的光合植物组织)与损伤的视觉比例进行评分。评分值为0，表示耐受性差、损伤高、绿色着色低；1表示有一定耐受性、平均损伤、中等绿色着色；2表示耐受性良好、损伤低、绿色着色高。表7中呈现了每种构建体的评分，其中n.d.表示未进行分析。结果表明，几种构建体提供了对ppo除草剂的耐受性。
表7.大豆5周时的耐受性评分
然后在转化后大约七周时移植对应于得分为2的构建体的未喷洒容器中的小植株，并使用本领域已知的标准方法使其生长作为r0植物。还使得对应于非耐受性评分为0和1的选定小植物生长以用作阴性对照。r0植物在温室中在长日照苗圃条件下(在80℉下18小时光照，然后在74℉下6小时黑暗)再生长大约四周。在转化后十一周时，为r0植物喷洒两次相同的上述除草剂溶液，最终施用率为20g/ha。对于试验的每种dna构建体，测试15-30株单独转化的植物。基于地上组织损伤的量对除草剂损伤等级进行视觉评分，其中0％是没有可见损伤而100％是植物完全死亡。非转基因对照植物的损伤等级评分高于30％。边缘耐受性为30％的损伤或更低，良好耐受性为20％的损伤或更低，并且优良耐受性被认为是10％的损伤或更低。处理七天后收集评分，并对每种dna构建体的所有植物取平均值。
在十一周时r0植物除草剂耐受性施用的结果证实了在五周时观察到的低百分比损伤等级评分。对于十一周的评价，30％或以上的任何损伤等级均等同于非转基因大豆损伤等级。几种构建体突出显示出对除草剂施用具有非常好的耐受性。例如，具有r2n30(seqidno:163)的andge_6461(seqidno:26)仅具有7％的损伤。表8中提供了数据，其中n.d.表示未进行分析。
表8.大豆11周时的耐受性评分
编码hemg原卟啉原氧化酶h_n90的基因与44个不同的转运肽可操作地连接并克隆到如实施例3中所述的基础植物转化载体中。这容许在每种dna构建体中使用相同的启动子、除草剂耐受性蛋白和3'utr元件，对不同转运肽进行并列比较。使用根癌土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用这些植物转化载体转化大豆切除的胚(种质ag3555)。对于每种构建体试验四百至4,5000株独立的转基因植物。将无菌ppo除草剂溶液用于除草剂耐受性试验。除草剂溶液由0.3g的s-3100在作物油浓缩物(5.0ml)和495ml去离子水中组成。
转化五周后，以20g/ha的最终施用率为植物喷洒两次无菌ppo除草剂溶液。对于试验的每种dna构建体，进行400至4,5000次重复。然后经过处理的小植株每天在喷洒后接受至少15小时的光照，持续四天。在s-3100施用后第四天结束时，对经过处理的小植株的相对通过率百分比进行评分(定义为相对于喷洒仅含表面活性剂的溶液的对照转基因植物，在视觉上对除草剂施用展示出耐受性的dna构建体的所有独立植物的百分比)。在转化后大约七周时移植未喷洒容器中的小植株，并使其生长作为r0植物。r0植物在温室中在长日照苗圃条件下(在80℉下18小时光照，然后在74℉下6小时黑暗)再生长大约四周。在转化后十一至十二周时，为r0植物喷洒两次相同的上述除草剂溶液，最终施用率为20g/ha。对于试验的每种dna构建体，进行15-45次重复。处理三至七天后收集除草剂损伤等级。对于十一周的评价，记录10％损伤或以下和20％损伤或以下的植物百分比。在试验的除草剂施用率下，表达无任何可操作连接的转运肽的原卟啉原氧化酶h_n90的转基因植物(ppo对照)产生具有20％的损伤或更少的零植物。几种与h_n90除草剂耐受性蛋白可操作地连接的转运肽突出显示出对除草剂施用具有优良或非常好的耐受性。例如，在十一周喷洒时，超过50％的植物在表达与allce_3035(57％)、kocsc_9516(59％)、camsa_6215(69％)、roshy_3269(70％)、adadi_0544(75％)、cucme_3420(80％)、spiol_1551(85％)、cucme_4756(89％)或conca_3910(90％)可操作连接的h-n90时，损伤评分为20％或以下。
表9.大豆5周和11周时的耐受性评分
实施例5：玉米中的转运肽和原卟啉原氧化酶试验
在转基因玉米植物中测试与原卟啉原氧化酶可操作地连接的转运肽的ppo除草剂耐受性。构建植物转化载体，其包含dna构建体，所述dna构建体包含针对单子叶植物表达优化并编码与转运肽可操作地连接的原卟啉原氧化酶的重组dna分子。然后使用植物转化载体转化玉米，并评估再生植物对ppo除草剂的敏感性。
编码原卟啉原氧化酶h_n90的基因与十四种不同的转运肽可操作地连接并克隆到具有多种启动子和3’utr元件的基础植物转化载体中。在每种dna构建体中使用相同的原卟啉原氧化酶容许对不同的转运肽进行并列比较。还产生具有原卟啉原氧化酶h_n90的植物转化载体，没有任何可操作地连接的转运肽(ppo对照)。使用根癌土壤杆菌和本领域已知的标准方法使用这些植物转化载体转化玉米。使再生的r0植物生长，然后筛选以获得在转化后大约10-14周对s-3100(40至80g/ha比率)的施用所表现出的耐受程度。施用除草剂3至10天后在视觉上获得耐受性。相对于对照，根据除草剂处理后植物整个地上部分的损伤百分比对经过喷洒的植物进行评分。对于试验的每种dna构建体，测试10至120株植物并将损伤率取平均值。记录以20％的损伤或更低分数通过的r0植物的百分比。产生50％或更多具有20％或更少损伤的转基因植物的任何dna构建体被认为是高度耐受性dna构建体。产生20％或更多具有20％或更少损伤的转基因植物的任何dna构建体被认为是耐受性dna构建体。在试验的除草剂施用率下(s-3100为40至80g/ha)，表达无任何可操作连接的转运肽，具有xanst_27或allce_3035的原卟啉原氧化酶h_n90的转基因植物(ppo对照)产生具有20％的损伤或更少的零植物。然而，几种转运肽产生表达具有高度耐受性或耐受性的原卟啉原氧化酶h_n90的转基因植物：adadi_0544(41％)、andge_6461(60％)、camsa_6215(60％和41％通过)、conca_3910(36％和45％)、roshy_3269(64％和74％)、spiol_1551(50％和55％)、setit_9796(55％)。表10中提供了数据。
表10：玉米耐受性评分
实施例6：棉花中的转运肽和原卟啉原氧化酶试验
在转基因棉花植物中测试与原卟啉原氧化酶可操作地连接的转运肽的ppo除草剂耐受性。构建植物转化载体，其包含dna构建体，所述dna构建体包含针对双子叶植物表达优化并编码与转运肽可操作地连接的原卟啉原氧化酶的重组dna分子。然后使用植物转化载体转化棉花，并评估再生植物对ppo除草剂的敏感性。
编码原卟啉原氧化酶h_n20和h_n90的基因与四种不同的转运肽可操作地连接并克隆到如实施例3中所述的基础植物转化载体中。这容许在每种dna构建体中使用相同的启动子和3'utr元件，对不同转运肽进行并列比较。使用根癌土壤杆菌和本领域已知的标准方法，使用这些植物转化载体转化棉花。使再生植物生长，然后筛选以获得在转化后大约11至12周对s-3100(20g/ha比率)的施用所表现出的耐受程度。施用除草剂3至10天后在视觉上获得耐受性。相对于对照，根据除草剂处理后植物整个地上部分的损伤百分比对经过喷洒的植物进行评分。对于试验的每种dna构建体，测试10-15次重复并将平均损伤率取平均值。50％或更低的平均损伤评分被认为是除草剂高度耐受性dna构建体，高于50％但低于80％的平均损伤评分被认为是除草剂边缘耐受性dna构建体。80％或以上的平均损伤评分被认为与对照植物无区别。表达与camsa_6215可操作地连接的原卟啉原氧化酶h_n90的转基因棉花植物产生平均损伤评分为38％的除草剂高度耐受性植物。表达与amapa_4787可操作地连接的原卟啉原氧化酶h_n90的转基因棉花植物产生平均损伤评分为63％的除草剂边缘耐受性植物。