专利名称：一株产氢工程菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产氢工程菌及其应用。
背景技术：
十八世纪世界工业革命以来建立的化石能源体系如今正面临着两大挑战1) 化石能源储量日益减小，面临着枯竭的危险；2)化石燃料的燃烧产生了大量污染 物质，特别是C02等温室气体的排放引起的温室效应，给人类赖以生存的环境带来巨 大的威胁。因此，开发可持续发展的可再生清洁能源，逐步替代化石能源是关系国 家能源安全、环境安全及社会稳定和平发展的重要战略课题。
氢能作为极具潜力的未来替代清洁能源之一，是高效的能源载体，具有能量密 度高、清洁、可再生、燃烧产物为水和无污染等特点，是十分理想的可再生能源。 目前，氢气主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的96%)和电解水制氢(占4
未能摆脱对原有的化石能源的依赖。因此，如何利用可再生资源持续地获取 氢气受到人们的广泛的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。生物制氢 具有常温常压反应、条件温和、对环境友好、可利用废弃生物物质为底物等优点， 可以和环境污染治理、减少污染排放相联系，是十分理想的制氢方法。
现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，90年代以来，随着人们对
温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的制氢方法更加引起了人们的广 泛重视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线。前者利用光合细菌或 藻类直接将太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低， 光反应器设计困难等因素，近期内很难推向应用。后者采用的是产氢菌厌氧发酵， 它的优点是产氢速度快、反应器设计简单、且能够和废弃生物的利用相结合，相对 于前者更容易在近期内实现工业应用。
发酵法制氢始于六十年代中期，九十年代受到重视，但进展并不大。九十年代 末到本世纪初，人们意识到发酵制氢更容易在近期内实现产业化，大大增加了暗发 酵制氢方面的科研投入，产生了一批有关培养工艺的基础性研究结果。近年来与废 弃生物质处理相结合的制氢过程的研究大为增加，其中一些达到了中试水平，但主 要集中在反应器类型设计、工艺研究上，且混合培养产氢效率低于纯培养，总的转 化率都不高，这也正是发酵制氢的瓶颈所在。解决发酵制氢瓶颈的关键，是实现技术突破，提高氢气得率。研究表明，仅从工艺的角度，无法从根本上突破产氢效率 低的问题，必须注重高效产氢菌种的研究与开发。
多年以来，暗发酵制氢中应用的产氢菌种主要包括肠杆菌属G^ferote"er)、 梭菌属(67osz^^/Z〃/i7)、埃希氏菌属Cfoc力eric力ia)和芽孢杆菌属CSgci77^s)，其中 尤以肠杆菌属和梭菌属的相关研究最多。梭菌属产氢率最高可达到2. 36mol/mol葡 萄糖，产气肠杆菌属产氢率最高可达3mol/mol葡萄糖(即6 mol/mol蔗糖)[K咖ar， N. and Das， D. Bioprocess Engineering 23， 205-208 (2000)]， [Kumar, N. and Das， D. Process Biochemistry 35, 589-593 (2000)]。以梭菌(67os^rW鹏sp) 为代表的专性厌氧菌发酵产氢的机理为葡萄糖酵解后生成丙酮酸，在形成醋酸过 程中， 一部分电子通过铁氧还蛋白在氢酶作用下形成氢气。 一摩尔的葡萄糖可形成 4摩尔氢气和2分子醋酸。因此，专性厌氧菌发酵产氢的同时，必然伴随醋酸等有机 酸的形成。兼性厌氧产氢菌^ aeroge"e5通过糖解途径和三羧酸循环(TCA)途径产 生NADH和ATP，氢酶通过NADH将质子转换为氢气，产氢理论转换率为l摩尔葡萄糖形 成12mol氢气，远远大于专性厌氧菌的氢得率。因此，￡ se^^e/2es是开发高效发酵 制氢工艺的重要菌种。
随着生物技术的飞速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足提高 产氢效率的需求。发酵制氢的研究需要进入细胞内部，通过对氢酶及其代谢网络的 改造来强化产氢过程。目前在基因库上已经可以获得超过100种的氢酶基因序列 [Paulette M. Vignais， Bernard Billoud， Jacques Meyer. FEMS Microbiology Reviews 25， 455-501(2001)]，但仍有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未被克隆， 寻找更多的氢酶基因是生物制氢研究的重要方向[Kalia， V.C., Lal， S. ， Ghai， R.， Mandal， M. and Chauhan， A. Trends in Biotechnology 21， 152-156 (2003)]。 不同的氢酶具有不同的功能，和其它酶系相比，人们对氢酶的认识还十分有限。
目前，研究的比较清楚的是大肠杆菌的氢酶I、 II、 III和IV的基因，它们都 属于Ni-Fe氢酶，其中氢酶III和IV和产氢有关[Andrews, S. C. ， Berks, B.C., Mcclay， J. ， Ambler, A. ， Quail, M. A. ， Golby， P. and Guest, J. R. Microbiology 143， 3633-3647 (1997)]，而I、 II和吸氢过程相关。梭菌属的氢酶都属于铁氢酶， 三梭菌的铁氢酶已有测序结果，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。已经克 隆到梭菌的铁氢酶基因，并在光合细菌内获得了异源表达，强化了光合菌的产氢过 程。梭菌的铁氢酶基因在大肠杆菌中的表达却没有成功，可能是由于梭菌和大肠杆200810115232.6
说明书第3/12页
菌对于铁氢酶表达的附属基因系统不相同造成的[Yasuo Asada， Yoji Koike， Jorg Schnackenberg， Masato Miyake， Ieaki Uemura， Jun Miyake. Biochimica et Biophysica Acta 1490, 269-278 (2000)]。最近，Mishra J.等通过铁氢酶保守序 列设计的方法从A c乃acae 1IT-BT08中克隆出450bp左右的铁氢酶，并在不产氢的 大肠杆菌中异源表达，验证了其功能，结果显示这个氢酶位于细胞质内[Mishra， J.， Kumar， N. ， Ghosh, A. K. and Das， D. International Journal of Hydrogen Energy 27,1475-1479 (2002) ]， [Mishra，丄，Khurana， S. ， Kumar， N., Ghosh， A. K. and Das， D. Biochemical and Biophysical Research Communications 324， 679—685 (2004)]。产气肠杆菌Eae/Y^朋"的前期研究表明，在其细胞膜上，氢酶与细胞内 产生的NADH作用生成氢气[Nakashimada， Y. ， Rachman， M. A. ， Kakizono， T. and Nishio， N. International Journal of Hydrogen Energy 27， 1399-1405 (2002)]。 因此研究该菌属的氢酶特性、基因及其功能解析，对于实现提高产气肠杆菌产氢得 率的技术突破具有重要意义。
对大肠杆菌产氢过程的研究表明，大肠杆菌可直接利用甲酸，也可以在同化糖 类物质代谢过程中产生的甲酸为底物，在甲酸裂解酶系的作用下，分解甲酸生成C02 禾,。[Akihito Yoshida, Taku Nishimura, Hideo Kawaguchi， 1 Masayuki Inui， and Hideaki Yukawa*. Appl Environ Microbiol. 71:6762 - 6768(2005)]。甲酸产氢 途径是产氢速度最快的途径。
产气肠杆菌是兼性厌氧菌，生长速度快，在厌氧条件下可以产生氢气，且具有 利用底物范围广，生长适应性强等优点，是具有优良工业性状的菌株。已有许多关 于产气肠杆菌产氢的报道，但多是在工艺及培养方面[E. Palazzi， B. Fabiano， P. Perego. Bioprocess Eng. 22:205 - 213(2000).]，有关产氢相关的基因还没有 任何报道。研究表明，产气肠杆菌具有和大肠杆菌相似的利用甲酸产氢的能力 [Tatsuo， K. ， Shigeharu， T. Mar Biotechnol. 7:112 - 118 (2005) ]，而且其具有 吸氢过程，即有吸氢酶的存在[Y. L Ren. ， X. H. Xing. ， C. Zhang. ， and Z. X. Gou. Biotechnol Lett. 27 (14) : 1029-1033 (2005).]。因此克隆产气肠杆菌利用甲酸途 径产氢的基因及吸氢酶基因，对理解其利用甲酸产氢和耗氢的过程，从而利用甲酸 途径生物制氢具有重要的意义。克隆甲酸氢酶基因和吸氢酶基因也是对氢酶基因家 族有益的补充。 发明内容本发明的目的是提供一株产氢工程菌及其应用。
本发明提供的产氢工程菌，是灭活A serog朋esIAM1183中AhycA蛋白得到的 工程菌；所述AhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1。 所述灭活具体可通过同源重组实现。
所述同源重组可采用任何常规方法，如将DNA片段P导入所述￡ aerobe"" I纖183;
所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段M、同源臂T2;所述 同源臂L和同源臂L能与所述AhycA蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述A hycA蛋白；所述DNA片段M为抗生素抗性片段。
所述AhycA蛋白的编码基因是由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA 片段；所述同源臂L是由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述 同源臂L是由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M 为卡那霉素抗性片段。
所述DNA片段P的核苷酸序列具体可为序列表中的序列3。
本发明还保护一种DNA片段P，所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段M、同源臂L;所述同源臂L和同源臂T2能与A3eroge/ es IAM1183的A hycA蛋白的编码基因发生同源重组，灭活AhycA蛋白；所述AhycA蛋白的氨基酸 序列是序列表中的序列1;所述DNA片段M为抗生素抗性片段。
所述AhycA蛋白的编码基因是由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA 片段；所述同源臂L是由序列表中序列4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述 同源臂L是由序列表中序列5所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M 为卡那霉素抗性片段。
所述DNA片段P的核苷酸序列具体为序列表中的序列3。
含有所述DNA片段P的表达盒或重组表达载体或转基因细胞系或重组菌均属于 本发明的保护范围。
本发明以具有高效产氢潜力的产气肠杆菌G5: aeTY^e77e》为出发菌株，通过对 产气肠杆菌(A 3eroge/7M)中的产氢相关蛋白编码基因进行灭活，获得了一株产氢 能力提高的工程菌，该工程菌可应用于生物制氢。本发明对利用产气肠杆菌制氢， 具有巨大的指导意义。
本发明获得的工程菌具有以下优点1) 出发菌株^.3er^"e/2esIAM1183是兼性厌氧菌，在好氧、厌氧条件下均能快 速生长，对环境适应性强；利用其进行生物制氢具有利用底物范围广、利用底物能 力强和产氢较高的优点，是具有潜在应用于工业化生物制氢的优良菌株。
2) 本发明获得的工程菌，除了具有原始菌l)的优点外，还具有底物利用能力 更强，产氢能力进一步提高的特点。
3) 本发明获得的工程菌，利用甲酸能力也更强。 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为工程菌的单抗和双抗筛选图 图2为工程菌的PCR鉴定图
图3为工程菌￡ aarage/ es IAM1183-A的生长曲线0D6。。 图4为工程菌￡ aerc^e/ es IAM1183-A生长过程中的pH变化 图5为工程菌￡ aei^^es IAM1183-A的112生成分析 图6为工程菌E ae2"ge/7es IAM1183-A的0)2生成分析
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用到的引物如下
hycA-Km-fw: CTGCA ATTCGCTGGT TCAGGGCATC ACCCTGTCAA AAGCG
ATAGGCTCCGCCCCCCTGA; hycA-Km-rv: GGCTTAAATCCACCGGCTGGTCGTGTTCCATGGCGTCATA
CAGGTGGCAC TTTTCGGGG; hycA-fw: CTGCAATTCGCTGGT TCAGGGCATC; hycA-rv: GGCTTAAATCCACCG GCTGGTCGTG。 以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下
(1) LB培养基(L—》蛋白胨10g、酵母浸粉5g、 NaCl 10g、琼脂粉15g (固体 培养基时添加)；用于菌种短期保藏和活化培养。
(2) 葡萄糖培养基(L—》:葡萄糖15g、蛋白胨5g、 K2HP04 3H20 14g、 KH2P04 6g、 (NH4)2S04 2g、 MgS04 7H20 0. 2g;用于发酵制氢。
实施例1、产气肠杆菌￡ aeroge"a 1雄1183-A的获得
出发菌株产气肠杆菌(￡ seiY^朋"IAM1183)购自日本东京大学应用微生物研 究所(IAM)菌种库。
对NCBI中的产气肠杆菌基因序列(Genbank NO: EF601125)进行序列分析，设计一对引物hycA-Km-fw和hycA-Km-rv， hycA-Km-fw和hycA-Km-rv的序列如下 hycA-Km-fw:
5， -CTGCAATTCGCTGGTTCAGGGCATCACCCTGTCAAAAGCGATAGGCTCCGCCCCCCTGA-3，; hycA-Km-rv:
5， -GGCTTAAATCCACCGGCTGGTCGTGTTCCATGGCGTCATACAGGTGGCACTTTTCGGGG-3，。
引物中的带划线的序列为产气肠杆菌(Aser^OTes IAM1183)Z/ j^4的同源臂。 通过电转化的方式将pYM-red质粒(于梅，周建光，陈伟，李山虎，黄翠芬， 一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立.生物化学与生物物理进展.2005， 32
(4).)电击到产气肠杆菌(Aae/Y^e/7es IAM1183中，进行氯霉素(24mg/mL)抗 性筛选，从阳性菌株中提取pYM-red质粒进行鉴定，获得了含有pYM-red重组质粒的 产气肠杆菌(￡ aarc^e/7es IAM1183)。
以pET28a质粒DNA为模板，用引物hycA-Km-fw和hycA-Km-rv进行PC財广增，获得 含有卡那霉素标记的线性DNA，将该线性DNA作为打靶载体。通过电转化的方式，将 打靶载体导入含有pYM-red重组质粒的产气肠杆菌05: ae/r^e/ es IAM1183)。将转化 后的菌涂布于含有卡那霉素(50mg/mL)的单抗LB平板上，3(TC培养培养1天；然后 将长出的菌转接入含有含有卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(30mg/mL)的双抗LB平 板上，3(TC培养培养1天。单抗和双抗筛选的结果见图l，图l中左图为单抗筛选的 图，右图为双抗筛选的图。
随机挑取几个双抗培养基上生长的克隆，提取基因组DNA，通过PCR的方法鉴 定打靶载体是否与染色体上的目标位点发生了同源重组，PCR反应所用的一对引物 为hycA-fw禾口 hycA-rv， hycA-fw禾口 hycA-rv的序歹ll如下 hycA-fw: 5， -CTGCAATTCGCTGGTTCAGGGCATC-3，； hycA-rv: 5' -GGCTTAAATCCACCGGCTGGTCGTG-3，。
PCR鉴定结果见图2，图2中，1:《serog朋es IAM1183-A; 2: ￡ aeroge/7es IAM1183 (对照)；3: DNA 2000 marker。由图可见，￡ aeroge/ es IAM1183-A的扩 增产物获得了 1700 bp目标带；A aerc^朋as IAM1183的扩增产物获得了 550 bp 的条带，与预期结果一致。结果表明，获得的克隆中，打靶载体与染色体上的目标 位点发生了同源重组。将发生了同源重组的突变型菌株命名为￡ IAM1183—A。实施例2、工程菌的生长特性及产氢性能测定
在70mL血清瓶中，装20mL葡萄糖培养基，将活化后的工程菌￡ aaroge/7" IAM1183-A进行摇瓶培养；同时将活化后的野生菌进行同样条件的摇瓶培养，作为 对照。具体操作步骤如下
(1) 种子培养采用15ml离心管，LB培养基装液量5ml，从固体平板接种， 培养温度37T:，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。
(2) 厌氧摇瓶培养采用70ml血清瓶厌氧培养瓶，葡萄糖培养基装液量20ral (预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)；种子菌的接种量2.5% (v/v),
培养温度37。C，空气浴摇床转速170rpm。培养24小时。
试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值士标准差表示。 分别收集工程菌和野生菌产生的气体，利用注射器测定生成的气体量；利用分 光光度计(UV-1206， SHIMADZU公司(日本))测定菌体的生长情况；利用pH计 (CHN060(828)， 0RI0N公司(美国))测定pH的变化情况。工程菌和野生菌的OD,的 变化见图3，工程菌和野生菌的培养液的pH变化见图4，工程菌和野生菌的氢气生成 情况见图5，工程菌和野生菌的C02生成情况图6。
工程菌和野生菌的最大比生长速率和菌体最大产氢速率比较见表1。
表1最大生长速率和产氢速率(11=3)
菌株最大生长速率(h—l)最大产氢速率(ml 0Dunit I—1)
￡ seroge/7e51 I AMI 1830. 523 ±0. 034300. 89±15. 34
￡ sero《e/ es IAM1183-A0. 414土0. 001373.15±38. 59
最大产氢速率反映的是单位细胞单位时间的氢气最高产出量。由图3可见，经 过12h的批式培养后，野生菌的细胞密度达到最高(0D6。。为2. 26)，野生菌￡ IAM1183的最大比生长速率高于重组菌，达0.523 h";由图4可见，工程菌和野生菌 的pH变化趋势是一致的，均在发酵过程中产酸而使发酵液呈酸性，pH从初始值6.9 下降到4. 7-4. 9之间；由表1可见，与野生型菌株相比，工程菌A ae/Y^e/7esIAM1183-A 的菌体最大产氢速率有一定程度的提高，是野生型的1.24倍。
实施例3、工程菌的代谢流分析
为确定4r^基因敲除对菌株带来的变化，分别检测野生菌和工程菌细胞内各代 谢通量的分布，具体步骤如下
(1)种子培养釆用15ml离心管，LB培养基装液量5ml，从固体平板接种菌，培养温度37。C，空气浴摇床转速170rpm，过夜培养。
(2) 厌氧摇瓶培养采用70ml血清瓶厌氧培养瓶，葡萄糖培养基装液量20ml (预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)；种子菌的接种量2.5% (v/v)，
培养温度37。C，空气浴摇床转速170rpm。培养16小时。
(3) 厌氧摇瓶培养16h后对代谢产物进行检测。将发酵物离心取上清后，过滤。 利用高压液相色谱测定代谢物的产量和组成。高压液相气谱为(HPLC-10A ， SHIMADZU 公司(日本)。试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值土标 准差表示。
结果表明，工程菌的氢气对葡萄糖的得率达到1.20mo1-氢气，mol-葡萄糖—、 高于野生菌的相应值(1. 16mol-氢气* mo卜葡萄糖—0 ，这说明Z^yd的灭活能有 效增加产氢代谢途径的通量，从而提高细胞产氢得率。同时，工程菌和野生菌的代 谢产物的分布也有一定差异，工程菌中的2， 3-丁二醇、乳酸、琥珀酸和乙醇的得 率均比野生菌有所增加，而上述物质都是依赖胞内NADH而产生的代谢产物，显示出 胞内可利用的还原力的增加，而这是有利于产氢的一个重要条件。工程菌的乙酸和 乙醇产量之和比野生型菌株有一定幅度的提高，表明甲酸产氢途径在产氢过程中被 强化，达到了预期的效果。
表2代谢流分析(n=3)终产物产量 (mol mol—1葡萄糖)
雇1183IAM1183-A
H21. 16±0. 041. 20±0.01
C020. 80±0. 120. 76±0. 06
2， 3-丁二醇0. 04±0.010. 05±0. 01
乳酸1.24±0. 171.32土0. 08
乙酸0. 31±0. 040. 36 ±0. 04
琥珀酸0. 02±0.010. 03±0.01
乙醇0. 34±0. 010. 37±0. 04
生物量0. 07±0. 000. 07 ±0. 00 (C《2Hs0i. 25N。. esPo. i)
碳衡算(%)106±13112±8
试验表明，对靶基因的灭活会引起胞内相应酶活性的变化，进而改变代谢通量， 增加目标产物的产量。本发明所获得的基因工程菌株具有较高的产氢能力，可应用 于发酵制氢。aio〉清华大学
〈120〉一株产氢工程菌及其应用
<130>CGGNARY81400
〈160〉 5
<210〉 1 〈211> 134 〈212〉 PRT
<213> 产气肠杆菌(￡ aero《e/7e5") 〈400〉 1
Arg His Arg Arg Tyr Gin Asp Gin Trp 1 5
Val Gin Gly lie Thr Leu Ser Lys Ala
20 25 Cys Ala Pro Asp Lys Glu Leu Cys Phe
35 40 Val Tyr Val Ala Leu Ala Glu Gly Phe
50 55 Tyr Val Glu Thr Arg Asn Gly Asp Asp 65 70 Thr Leu Ala Ser Asp Gly Thr Val Asp 85
Arg Glu Gin Val Leu Glu His Tyr Leu 100 105
Arg Gin Tyr Cys Asn Ser Leu 10 15 Arg Leu His His Ala Met Ser 30
Val Leu Phe Glu His Phe Gin 45
Asn Asn His Thr lie Glu Tyr 60
Lys Arg Leu lie Ala Gin Ala
75 80 Gly Arg lie Ser Asn Arg Ser 90 95 Ala lie lie Ala Ser Val Tyr 110Asp Arg Leu Tyr Asp Ala Met Glu His Asp Gin Pro Val Asp Leu Ser
115120125
His Leu Ala Leu Ala His
130
<210> 2
〈211〉 405
<212> DNA
<213> 产气肠杆菌(￡ aeiY^朋e5)
<400> 2
cgtcaccgccgctatcaggatcagtggcgccagtactgca attcgctggttcagggcatc60
accctgtcaaaagcgcgtttgcatcatgcgatgagctgcg cgccggacaaagagctgtgc120
ttcgtcctgtttgaacattttcaggtgtatgtcgcgctgg cggaagggttc aac aac c ac180
3cca_tcg3gtELCtacgtcgaaacgcgcaatggtgatgata agcgattgattgctcaggca240
Bcgctggcatccgacggtaccgttgacggccggatca_gc3 accgttcgcgcgaacaggtg300
ctgga^ca/ttacctggccattattgccagcgtctatgacc gtctgtatgaCgCC3tgg犯360
cacgaccagccggtggatttaagccatctggcgctggccc attaa405
〈210〉 3
<211〉 1693
<212〉 DNA
〈213>人工序列
〈400〉 3
ctgcaattcg ctggttcagggcatcaccctgtca肌agcg 3tsggctccgcccccctgac60
gagcatcaca aaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgeicagg120
taccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctc ctgttccgaccctgccgctt180
accggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtgg cgctttctcatagctcacgc240
tgtaggtatc tcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagc tgggctgtgtgcacgaaccc300cccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggt犯ct3tcgtcttgagtcc肌cccggta360
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gtaggcggtgctacagagttcttg卿tggtggcctaactacggctacactaga^gg3ca480
gtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctct540
tgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggUtttttgtttgcaagcagcaga/tt600
acgcgC3g犯肌aaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgct660
C3gtgg咖gaaaactcacgtta^gggsttttggtcatgaacaataaaactgtctgctta720
cataaacagtgtgtteitg3gccatattcaacggga雄gtcttgctctag780
gccgcgattatggatgctgatttatatgggtstEiEiatgggctcgcgataa840
tgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcg3ttgtatggg犯gCCCg3tgcgccagagtt簡
gtttctga^3cstggcaa^ggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagact960
3犯CtggCtg3Cgg33ttt3tgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctga1020
tgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaaga1080
atatcctgattc3ggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgca1140
ttcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggc1200
gcaatcacgaatgaat肌cggtttggttgatgcgagtgattttgstga_cgagcgtaatgg1260
ctggcctgttg犯c朋gtctgcataaacttttgccattctcaccggattc1320
agtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaMtaat1380
aggttgtattgatgttggacgsgtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcct1440
atggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttc1500
tattgataatCCtg8t3tg33taa_a_ttgcagtttcatttgatgctcga_tgagtttttcta1560
agaattaattcalg3gcgg3tacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagggg1620
ttccgcgcacatttccccga犯agtgccacctgtatgacgccatggaacacgaccagccg1680
gtggatttaagcc1693
〈210> 4
<211> 40
<212> DNA <213〉人工序列<400〉 4
ctgcaMtcg ctggttcagg gcatcaccct gtcaaaagcg
<210> 5
<211> 40
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400> 5
ggcttaaatc caccggctgg tcgtgttcca tggcgtcata
权利要求
1、一株产氢工程菌，是灭活E.aerogenes IAM1183中ΔhycA蛋白得到的工程菌；所述ΔhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1。
2、 如权利要求1所述的工程菌，其特征在于所述灭活是通过同源重组实现的。
3、 如权利要求2所述的工程菌，其特征在于所述同源重组是将DNA片段P导 入所述A aeroge/7" I AMI 183实现的；所述DNA片段P自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段M、同源臂T2;所述同 源臂L和同源臂T2能与所述AhycA蛋白的编码基因发生同源重组，灭活所述AhycA 蛋白；所述DNA片段M为抗生素抗性片段。
4、 如权利要求3所述的工程菌，其特征在于所述AhycA蛋白的编码基因是由 序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂L是由序列表中序列 4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T2是由序列表中序列5所示的核苷 酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M为卡那霉素抗性片段。
5、 如权利要求4所述的工程菌，其特征在于所述DNA片段P的核苷酸序列是 序列表中的序列3。
6、 DNA片段P，自上游至下游依次为同源臂L、 DNA片段M、同源臂T2;所述同 源臂L和同源臂L能与￡ aeroge/7" IAM1183的AhycA蛋白的编码基因发生同源重 组，灭活AhycA蛋白；所述AhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列l;所述DNA 片段M为抗生素抗性片段。
7、 如权利要求6所述的DNA片段P，其特征在于所述AhycA蛋白的编码基因 是由序列表中序列2所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂L是由序列表中 序列4所示的核苷酸序列组成的DNA片段；所述同源臂T2是由序列表中序列5所示的 核苷酸序列组成的DNA片段；所述DNA片段M为卡那霉素抗性片段。
8、 如权利要求7所述的DNA片段P，其特征在于所述DNA片段P的核苷酸序列 是序列表中的序列3。
9、 含有权利要求6-8中任一所述DNA片段P的表达盒或重组表达载体。
10、 含有权利要求6-8中任一所述DNA片段P的转基因细胞系或重组菌。
全文摘要
本发明公开了一株产氢工程菌及其应用。本发明提供的产氢工程菌，是灭活E.aerogenes IAM1183中ΔhycA蛋白得到的工程菌；所述ΔhycA蛋白的氨基酸序列是序列表中的序列1。本发明的工程菌可应用于生物制氢，对利用产气肠杆菌制氢具有巨大的指导意义。本发明获得的工程菌具有以下优点对环境适应性强、底物范围广、利用底物能力强、产氢效率高。
文档编号C12N1/15GK101608171SQ20081011523
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者元 卢, 翀 张, 王立言, 赵洪新, 邢新会, 堃 马 申请人:清华大学