本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种极度濒危植物贵州大花杜鹃组培繁殖及离体保存方法。
背景技术
贵州大花杜鹃（rhododendronmagniflorum）是杜鹃花科常绿杜鹃亚属云锦杜鹃亚组物种，该物种发表于1985年，是杜鹃花属中具有最大花朵的杜鹃。在最新出版的杜鹃花红色名录《theredlistofrhododendron》中列为极度濒危物种。该种分布在贵州省安龙县龙头大山，单个花朵花冠直径达10cm左右，具有较高的观赏价值。在最新的调查中，该种目前仅找到一个居群，且仅存3株。因种群稀少，自然更新差，急需进行有效的组培繁殖及离体保存，避免物种走向灭绝。目前针对该种的组培繁殖及离体保存方法还未见报道。
技术实现要素：
针对贵州大花杜鹃种群稀少，野外植株濒危这种现象，本发明旨在提供一种贵州大花杜鹃组培繁殖及离体保存方法，保存种质资源，保护濒危物种。
1.一种贵州大花杜鹃的组培繁殖及离体保存方法，其特征在于：
1）外植体选择：取贵州大花杜鹃的新嫩茎段，用自来水冲洗12h后备用；
2）外植体灭菌：取备好的外植体在无菌超净台上，用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3-5遍，用0.1%氯化汞消毒8-9min，使用无菌水冲洗3-5遍；
3）丛生芽诱导：丛芽诱导培养基为改良wpm+2.5mg/l2-ip（2-异戊烯腺嘌呤）+0.8mg/liba，蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6。改良wpm培养基为硝酸铵提高至为700mg/l，其他元素用量保持不变。将经过外植体灭菌过程后得到的茎段，在超净台上，用无菌滤纸吸干表面水分，用无菌刀切割茎段，每段带一个潜伏芽，接种至丛生芽诱导培养基内，暗培养5天后进行光照培养30天以上,培养35-50天，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000lux；
4）壮苗培养：壮苗培养基为改良wpm+0.5mg/l2-ip+0.1mg/liba，蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6；将诱导出的新芽，接种至壮苗培养基内，将瓶苗处于光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000lux；
5）离体保存：离体保存培养基为改良wpm+0.5mg/liba+6mg/lccc，ph5.6，蔗糖28g/l，琼脂6-7g/l，温度为13-18℃，光强度为1500lux-1600lux，光暗时间为10h/14h，培养基为260ml培养瓶灌装65ml培养基；恢复生长分化培养基为改良wpm+1mg/l6-ba+0.05mg/liaa，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000lux；
6）生根培养：将生长至1.5cm~2cm高的芽苗转接至培养基为改良wpm+1mg/liba的培养基中，附加蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6；光强度为2000lux-2500lux，光暗时间为12h/12h；
除离体保存培养基使用260ml培养瓶需灌装65ml外，其余各培养基均使用260ml培养瓶灌装45ml培养基；培养温度除离体保存为13-18℃，其余均为20-23℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1.创新并实现了极度濒危植物贵州大花杜鹃的组培繁殖及离体保存方法；
2.通过组培扩繁，贵州大花杜鹃在半年内增殖系数为60-90倍，极大提高了贵州大花杜鹃的繁殖系数，保护濒危物种，为回归种植提供了大量的种苗。且在该发明中的离体保存培养基中可保存240d以上不转接，极大的延长了转接及保存时间。
具体实施案例：
为了更好地说明本发明的实质，下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案的基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。
实施例1贵州大花杜鹃的组培及离体保存步骤：
步骤（1）：采集外植体并消毒：从贵州大花杜鹃母株上采集开花后刚长出的新发茎段，带3-5个潜伏芽，取外植体在自来水冲洗12h后，在超净工作台上，用75%的酒精消毒30s，用无菌水冲洗3-5遍，用0.1%氯化汞消毒8-9min，使用无菌水冲洗3-5遍；
步骤（2）：丛生芽诱导培养：将消毒后的外植体在超净工作台上切成小段，每段带一个腋芽，斜插入诱导培养基改良wpm+2.5mg/l2-ip+0.8mg/liba，蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6中，暗培养5天后进行光照培养30天,培养35-50天，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500lux-2000lux；
步骤（3）：待丛生芽分化并长至1-2cm时，转接至壮苗培养基改良wpm+0.5mg/l2-ip+0.1mg/liba，蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6中；将瓶苗处于光暗时间为12h/12h，光照强度为1500lux-2000lux；
步骤（4）：将一部分丛生芽苗转接至离体保存培养基中：离体保存培养基为改良wpm+0.5mg/liba+6mg/lccc，ph5.6，蔗糖28g/l，琼脂6-7g/l，温度为13-18℃，光强度为1500lux-1600lux，光暗时间为10h/14h，该培养基每瓶灌装65ml；待需要恢复生长时，将其转接至恢复生长培养基：改良wpm+1mg/l6-ba+0.05mg/liaa，光暗时间为12h/12h，光照强度为1500-2000lux，温度20-23℃，进行恢复生长；
步骤（5）：壮苗培养基及恢复生长培养基内的种苗在瓶内生长至1.5cm~2cm高时，将其转接至生根培养基改良wpm+1mg/liba进行生根，附加蔗糖28g/l，琼脂7g/l，ph5.6，光暗时间为12h/12h，光强度为2000lux-2500lux，温度为20-23℃，生根后进行常规移栽。
实施例2贵州大花杜鹃组培繁殖的培养基筛选实验：
1）基础培养基筛选实验。选用杜鹃常使用的培养基read、wpm、1/4ms、改良wpm进行对比实验，进行无激素茎段存活实验，每组实验接种10瓶，每瓶接种消毒后的外植体茎段1段，进行比较：
结果表明：该种在改良wpm的培养基上生长状态良好，长势较为旺盛，未出现死亡及不萌发现象，因此选取基本培养基为改良wpm，贵州大花杜鹃的组培步骤与实例1相同。
2）离体保存培养基筛选实验。设计温度为两梯度：低温13-18℃及常温20-23℃，设计培养基灌装量为45ml及65ml两梯度，每组实验接种10瓶，每瓶接种3丛大小相对一致的丛生芽，进行正交实验筛选：
结果表明：该种在低温条件13-18℃下离体保存生长状态良好，培养基需有足够的量65ml才能保证延长继代转接周期。