一种用于蝗虫微孢子生物制剂的复合助剂的制作方法

本发明属于植物保护领域，具体涉及一种用于蝗虫微孢子生物制剂的复合助剂。

背景技术：

蝗虫微孢子paranosemalocustae(canning1953)是单细胞真核原生动物，为蝗虫等直翅目昆虫的专性寄生的原生动物,主要侵染蝗虫等宿主昆虫的脂肪体(canning1953，1962a，1962b)，引起宿主的慢性病，因而可作为蝗虫种群密度的长期控制因素(henryeta1，1969,1971,1982)加以开发利用。

从1949-1952年，goodwin和steinhaus分别报道了在蝗虫体内发现了“蝗虫微孢子”这种生物体，1953年canning从非洲飞蝗(locustamigratoriamigratorioides)体内分离到这种微孢子，并首次命名为蝗虫微孢子nosemalocustae(canning1953),其后又对其生活史进行了描述。2003年sokolova等，通过超微结构和分子生物系统学的研究，将蝗虫微孢子划入paranosema属，蝗虫微孢子的学名更正为paranosemalocustae(canning1953)。我国从雏蝗体内分离纯化到抗逆性和致病性比较强的菌株作为产品应用推广。

蝗虫微孢子是属于微孢子门microspora、微孢子纲microsporea、微孢子目microsporida、paranosema属的单细胞原生动物,营细胞内寄生生活。典型阶段是休眠期的孢子，孢子内有团孢原质和一根螺旋状盘绕的极丝，当寄主吞食孢子后，在中肠碱性消化液的作用下，孢子内部盘绕的极丝快速外翻，刺穿寄主的围食膜和肠上皮，同时，孢原质通过空心的极丝管注入寄主中肠细胞成为小变形体。一部分变形体就在中肠细胞内发育，而大部分变形体通过血淋巴到达感受性组织。随后经裂殖生殖产生分裂体，而后进入孢子形成期，经过双核产孢体和孢子母细胞阶段，细胞进一步分化，最后形成椭圆形的成熟孢子。

消化道微孢子虫感染是由于成熟孢子被吞入后侵入肠壁细胞所致。其它部位的感染则是微孢子虫经消化道进入虫体后，通过血淋巴循环而到达不同部位。当孢子受到刺激后，其极管伸出，刺入邻近细胞，将其有感染性的孢子质注入新的宿主细胞而使其感染。随着其在宿主细胞内生长、增殖，逐渐向周围细胞扩散或经血循环播散至脂肪体等其它组织器官。

目前的蝗虫微孢子生物制剂由孢子和水组成，蝗虫微孢子浓度为4×10⁷孢子/毫升。

自1985年我国农业部从美国引进蝗虫微孢子，1987年农业部成立了全国蝗虫微孢子防治蝗虫协作组，开始在全国大面积试验示范蝗虫微孢子治蝗，在全国的20个省市自治区蝗区，累计防治面积达到1300多万亩，青海、新疆等地部分采用蝗虫微孢子防治蝗虫的地区迄今没有蝗灾大暴发，可持续防治效果显著，也没有造成任何环境问题。农业部正式登记证号pd20150323，工信部生产许可证号hnp52044-a9385，质量技术监督局产品标准证号q/gzta001-2015。在中国使用面积超过1500万亩，同时在中亚、非洲等地推广应用。与蝗虫微孢子有关的专利有二十余项，如申请号为cn201511021621.9的专利公开了一种蝗虫微孢子虫孢子水悬浮剂及其制备方法；申请号为cn201410530347.7的专利公开了一种防治蝗虫的蝗虫微孢子虫和绿僵菌的超低容量悬浮剂及其制备方法；申请号为cn201410397744.1的专利公开了一种pcr检测蝗虫微孢子虫病的方法等。

然而，现有的蝗虫微孢子生物制剂抗逆性较低，特别是抗高温和紫外线能力弱、对高龄蝗虫的直接致死率较低、致死速度比较慢、体内微孢子增殖能力不强，生产成本较高等不足。

技术实现要素：

针对这些不足，本发明开展了相关助剂的研究，以弥补蝗虫微孢子生物制剂的不足。经过多年的研究和试验，提出了一种用于蝗虫微孢子生物制剂的复合助剂，可以显著增强蝗虫微孢子制剂的抗逆性以及杀虫效率并降低生产成本等，能显著提高防治蝗虫效果且防效稳定。

本发明所提供的用于蝗虫微孢子生物制剂的复合助剂，包括如下成分：碳酸氢钠、糖稀、菜籽油和山梨酸钾。

其中，以质量份数计，碳酸氢钠0.1-0.3份，糖稀10-30份，菜籽油1-5份，山梨酸钾1-3份。

所述糖稀是以白糖为原料制成，其主要成分是麦芽糖、葡萄糖及糊精。

所述糖稀通过包括下述步骤的方法制备得到：将2份水加入锅中烧开，然后加入1份白糖，转成中火熬制成糊状，再转成小火加0.01份醋并搅拌至粘稠状即成。

本发明还提供一种蝗虫微孢子制剂。

本发明所提供的蝗虫微孢子制剂，包括如下成分：蝗虫微孢子、水、碳酸氢钠、糖稀、菜籽油和山梨酸钾。

其中，蝗虫微孢子的浓度为4×10⁷-5×10⁸个孢子/ml，具体可为4×10⁷个孢子/ml。

基于蝗虫微孢子与水的体积100ml，碳酸氢钠的重量为0.01-0.03g、糖稀的重量为1-3g、菜籽油的重量为0.1-0.5g、山梨酸钾的重量为0.1-0.3g。

具体地，基于蝗虫微孢子与水的体积100ml，碳酸氢钠的重量为0.02g，糖稀的重量为2g，菜籽油的重量为0.3g、山梨酸钾的重量为0.2g。

所述糖稀以白糖为原料通过包括下述步骤的方法制成：

将2份水加入锅中烧开，然后加入1份白糖，转成中火熬制成糊状，再转成小火加0.01份醋并搅拌至粘稠状即成。

本发明特定组成及含量的复合助剂显著增强现有蝗虫微孢子生物制剂的抗逆性(抗高温和紫外线能力)以及杀虫效率，提高蝗虫微孢子生物制剂防治蝗虫的效果且使得其防效稳定，另外，本发明的复合助剂生产成本低，易于推广和使用。

附图说明

图1为碳酸氢钠对蝗虫肠道ph的影响。

图2为糖稀对蝗虫微孢子制剂作用的影响。

图3为糖稀对孢子粘着性的影响。

图4为纯微孢子制剂与含菜籽油的微孢子制剂经紫外处理后感病蝗虫死亡率的对比图。

图5为山梨酸钾对蝗虫产孢量的影响。

图6为接种纯微孢子制剂及接种含本发明复合助剂的微孢子制剂后蝗虫的死亡率对比图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述糖稀通过下述方法制备：将2份水加入锅中烧开，然后加入1份白糖，转成中火熬制成糊状，再转成小火加0.01份醋并搅拌至粘稠状即成。

(1)碳酸氢钠对飞蝗肠液ph值的影响测定

材料：三龄蝗蝻、碳酸氢钠、数字微量ph计

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将2×6cm的新鲜麦叶放在0.02％的碳酸氢钠溶液浸润2秒，取出单头饲喂蝗蝻，每个处理20头，重复3次；清水作为对照；三天后取出蝗虫肠道离心(3000rpm)获得肠液，用微量ph计测定肠液的ph值，记录数值，计算平均值，采用单因子方差分析比较其差异。结果如图1。

(2)糖稀对微孢子控制作用的影响

材料：糖稀、三龄蝗蝻、4×10⁷孢子/毫升微孢子液

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将2×6cm的新鲜麦叶放在含有2％的糖稀的微孢子溶液浸润2秒，取出单头饲喂蝗蝻，每个处理20头，重复3次；未加糖稀的微孢子液作为对照；此后饲喂新鲜叶片，每天观察记录蝗虫的死亡数量，直至实验结束，计算平均值，采用单因子方差分析比较其差异。结果如图2。

(3)糖稀对孢子粘着性的影响

材料：糖稀、三龄蝗蝻、4×10⁷孢子/毫升微孢子液

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将20片2×6cm的新鲜麦叶放在含有2％的糖稀的微孢子溶液浸润2秒，取出后用清水冲洗干净，洗涤液收集后高速离心(6000rpm)，得到孢子液，用血球计数板计算孢子浓度和数量，重复3次；未加糖稀的微孢子液作为对照；计算平均值，采用单因子方差分析比较其差异。结果如图3。

(4)菜籽油对微孢子抗逆性的增强作用

材料：菜籽油、三龄蝗蝻、4×10⁷孢子/毫升微孢子液

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将2×6cm的新鲜麦叶放在经过254nm紫外线处理的含有0.3％的菜籽油的微孢子溶液浸润2秒，取出单头饲喂蝗蝻，每个处理20头，重复3次；未经过紫外线处理的加菜籽油的微孢子液作为对照；此后饲喂新鲜叶片，每天观察记录蝗虫的死亡数量，直至实验结束，计算平均值，采用单因子方差分析比较其差异。结果如图4。

(5)山梨酸钾对蝗虫产孢量的影响

材料：山梨酸钾、四龄蝗蝻、4×10⁷孢子/毫升微孢子液

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将2×6cm的新鲜麦叶放在含有0.2％的山梨酸钾的微孢子溶液浸润2秒，取出单头饲喂蝗蝻，每个处理20头，重复3次；未加山梨酸钾的微孢子液作为对照；此后饲喂新鲜叶片，至接种后30天，将蝗虫加入3ml水中研磨并用医用纱布过滤得到孢子液，用血球计数板计算孢子浓度和数量；计算平均值，采用单因子方差分析比较其产孢量的差异。结果如图5。

(6)新型复合助剂对微孢子控制作用的影响

材料：复合助剂、三龄蝗蝻、4×10⁷孢子/毫升微孢子液

复合助剂微孢子液：在100毫升孢子液中加入0.02g碳酸氢钠，充分摇匀后，加入0.2g山梨酸钾，溶解后加入2g糖稀，摇匀，加入菜籽油0.3g,充分搅拌均匀，保存在阴凉处备用，避免日光暴晒。

方案：在28±2℃和rh70％-80％的条件下饲养蝗虫，每天饲喂新鲜麦苗。将2×6cm的新鲜麦叶放在含有1.25％的复合助剂的微孢子溶液中浸润2秒，取出单头饲喂蝗蝻，每个处理20头，重复3次；未添加复合助剂的微孢子液作为对照；此后饲喂新鲜叶片，每天观察记录蝗虫的死亡数量，直至实验结束，计算平均值，采用单因子方差分析比较其差异。结果如图6。

由图6可知：加入复合助剂后，接种微孢子制剂10天、20天和30天后其对蝗虫的致死效果比纯微孢子制剂分别增加了72.2％、76.2％和13.5％，可以较快速致死蝗虫；同时发现，微孢子复合制剂也可以应用于蝗虫的快速应急治理。