一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法与流程

本发明属于甘蔗组培研究技术领域，具体涉及一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法。

背景技术：

甘蔗热带种（saccharumofficinarum）是现代栽培品种（saccharumhybrid）的原始亲本，具有较为原始和简单的基因组结构，科研上作为甘蔗遗传学研究的便利材料而具有重要科研价值；同时具有大茎、高糖分、低纤维的农艺特征，生产上作为果蔗品种而具有重要经济价值。胚性细胞团是植物离体培养中产生的、由大量胚性细胞组成的团块，具有极强的全能性和分化能力。在分子遗传学研究方面，胚性细胞团是最为理想的外源基因受体；在组培快繁等实际应用方面，胚性细胞团具有远超一般愈伤的增殖分化能力和遗传稳定性。建立一套轻简高效的热带种胚性细胞团诱导技术体系，不仅可为相关基础科研提供便利，还有利于提高果蔗组培繁种育苗效率，具有重要的现实价值。

目前，我国对甘蔗胚性细胞团诱导研究还仅限于少数栽培品种。经研究人员努力，新台糖16号、22号，以及桂糖21号、28号等甘蔗栽培品种先后成功诱导获得胚性细胞团，建立了较为成熟的栽培品种胚性细胞团诱导技术体系。出乎意料的是，长期研究过程中发现，按照现有体系进行甘蔗热带种胚性细胞团诱导，几乎完全无法实现。这表明，热带种与现代甘蔗品种间已经具有了极其显著的遗传分化，对于诱导体系产生了截然不同的反应。因此，有必要开发一套专门适用于热带种的胚性细胞团诱导技术体系。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，该方法包括外植体取材、外植体接种与启动培养、继代培养诱导胚性愈伤、光诱导胚性细胞团产生等步骤，实现了甘蔗热带种胚性细胞团的高效诱导。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：

步骤（1），外植体取材：

选择8-10月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精消毒后剥取最内层3片幼叶作为外植体；

步骤（2），外植体接种与启动培养：

将步骤（1）所得外植体切为单层叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2-3周，得到愈伤组织；

所述的启动培养基为ms+2,4-d3.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖15.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（3），继代培养诱导胚性愈伤：

将步骤（2）得到的愈伤组织切成小块后，接种于继代培养基，28℃黑暗培养2-3周后可转化为胚性愈伤；

所述的继代培养基为ms+2,4-d1.5mg/l+复酞核酸0.5mg/l+蔗糖45.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：

将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2-3周后胚性愈伤表面产生大量胚性细胞团；

所述的光诱导培养基为ms+2,4-d1.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖20.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9。

进一步，优选的是，步骤（1）中，选取8-10月龄蔗株顶端生长点以上10cm区段内最内层3片幼叶作为外植体。

进一步，优选的是，步骤（1）中，选取8-10月龄蔗株顶端生长点以上3-8cm区段内最内层3片幼叶作为外植体。

进一步，优选的是，步骤（2）中，叶块宽为2-4mm，长为4-6mm。

进一步，优选的是，步骤（3）中，愈伤组织切成2-5mm见方的小块。

进一步，优选的是，步骤（4）中，光照培养条件为：使用红蓝色led光源，波长分别为660nm、450nm，红蓝光比例为1:1-3:1，总光量子通量密度为300-800μmol/m²·s，日光照时长12-16h，黑暗时长8-12h。

本领域公知，影响植物胚性细胞团形成的因素有很多，如外植体取材时期、接种方式、生长调节剂配比、培养条件等，其中，生长调节剂的配比是最为关键的影响因素。近年来，复酞核酸等新型植物生长调节剂的出现为本研究提供了新的选择。研究过程中更发现，蔗糖浓度这一前人忽视的因素，对甘蔗细胞分化进程调控具有重要影响；而诱导过程中的光照，是促进胚性细胞团形成的关键。综合以上发现，本研究建立了与以往不同的技术体系——诱导过程中使用复酞核酸这一新型植物生长调节剂，不同生长阶段使用不同蔗糖浓度，使用光照而非传统的黑暗诱导条件——最终成功建立了新的，特别适用于甘蔗热带种的胚性细胞团诱导技术体系。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

胚性细胞团是甘蔗科学研究和繁重育苗的理想材料。目前，我国甘蔗胚性细胞团诱导技术体系还仅限于包括上述品种在内的少数栽培品种，甘蔗热带种的诱导技术尚不成熟。虽然栽培品种先后成功建立了胚性细胞团诱导技术体系，但经长期研究发现，按照栽培品种取得的技术体系进行热带种胚性细胞团诱导，效率极其低下，完全无法满足应用需求。这表明，热带种与现代甘蔗品种间已经具有了极其显著的遗传分化，对于诱导体系产生了截然不同的反应。有鉴于此，本发明提供了一套专门适用于热带种的胚性细胞团诱导技术体系。本发明中，使用新型植物生长调节剂复酞核酸，在不同生长阶段使用不同的蔗糖浓度，并在胚性细胞团诱导阶段采用光培养而非常规的暗培养，最终建立了专门适用于甘蔗热带种的胚性细胞团诱导技术体系。本发明的技术方法可大量诱导获得热带种胚性细胞团，可为甘蔗科研和繁种提供稳定高效的胚性细胞团来源。

附图说明

图1为胚性细胞团产生于胚性愈伤表面的图片；

图2为从胚性愈伤表面剥离的黑车里本基因型的胚性细胞团的图片；

图3为从胚性愈伤表面剥离的越南牛蔗基因型的胚性细胞团的图片；

图4为胚性细胞团在空白ms培养基增殖、分化的图片。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

本发明所述甘蔗热带种，为植物分类学意义上的禾本科甘蔗属热带种植物，拉丁名为saccharumofficinarum，包括但不限于拔地拉、越南牛蔗、路打士、黑车里本等基因型，为甘蔗遗传改良重要亲本，并可直接用作水果甘蔗。

本发明所述的无菌镊子、无菌手术刀等为通常意义上的经高压湿热灭菌的镊子和手术刀，没有特殊限制。

本发明所述胚性愈伤是指表面粗糙、干湿适中、淡黄色云耳状的愈伤组织，可在继代培养过程中由普通愈伤诱导获得。

本发明所述胚性细胞团是指在光培养过程中，胚性愈伤表面诱导形成的紧致、干燥、颗粒状的细胞团，具有极强的再生和分化能力。

本发明所述操作过程，应严格按照常规组培规程进行无菌操作，以避免污染。

本发明对于接种密度无特殊要求，但不宜过密，直径9cm的培养皿接种量以不多于25块外植体或愈伤为宜。

光诱导阶段应尽量选择高透光材料培养皿，并单层放置，如需多层放置，则应间隔摆放，以保证受光均匀。

实施例1

一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：

步骤（1），外植体取材：

选择8月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精喷施消毒后入超净工作台，以无菌手术刀切取生长点以上5-10cm内区段，以无菌镊子层层剥除外层叶片，取其最内层3片幼叶，作为外植体；

步骤（2），外植体接种与启动培养：

按照步骤（1）所得外植体，以无菌镊子展为单层，以无菌手术刀切为2×4mm见方叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2周，得到愈伤组织；

所述的启动培养基为ms+2,4-d3.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖15.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（3），继代培养与胚性愈伤诱导：

将步骤（2）得到的愈伤组织以无菌手术刀切为2mm见方小块，以无菌镊子接种于继代培养基，28℃黑暗培养2周；

所述的继代培养基为ms+2,4-d1.5mg/l+复酞核酸0.5mg/l+蔗糖45.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：

将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2周。

所述的光诱导培养基为ms+2,4-d1.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖20.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

光照条件使用红蓝色led光源，波长660nm（红色）和450nm（蓝色），二者比例为1:1，总光量子通量密度为300-550μmol/m²·s，光周期为16h/8h。

实施例2

一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：

步骤（1），外植体取材：

选择9月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精喷施消毒后入超净工作台，以无菌手术刀切取生长点以上2-8cm内区段，以无菌镊子层层剥除外层叶片，取其最内层3片幼叶，作为外植体；

步骤（2），外植体接种与启动培养：

按照步骤（1）所得外植体，以无菌镊子展为单层，以无菌手术刀切为3×4mm见方叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养2.5周，得到愈伤组织；

所述的启动培养基为ms+2,4-d3.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖15.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（3），继代培养与胚性愈伤诱导：

将步骤（2）得到的愈伤组织以无菌手术刀切为3mm见方小块，以无菌镊子接种于继代培养基，28℃黑暗培养2.5周；

所述的继代培养基为ms+2,4-d1.5mg/l+复酞核酸0.5mg/l+蔗糖45.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：

将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养2.5周。

所述的光诱导培养基为ms+2,4-d1.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖20.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

光照条件使用红蓝色led光源，波长660nm（红色）和450nm（蓝色），二者比例为2:1，总光量子通量密度为400-650μmol/m²·s，光周期为14h/10h。

实施例3

一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：

步骤（1），外植体取材：

选择10月龄甘蔗热带种健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精喷施消毒后入超净工作台，以无菌手术刀切取生长点以上10cm区段，以无菌镊子层层剥除外层叶片，取其最内层3片幼叶，作为外植体；

步骤（2），外植体接种与启动培养：

按照步骤（1）所得外植体，以无菌镊子展为单层，以无菌手术刀切为2×5mm见方叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养3周，得到愈伤组织；

所述的启动培养基为ms+2,4-d3.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖15.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（3），继代培养与胚性愈伤诱导：

将步骤（2）得到的愈伤组织以无菌手术刀切为4mm见方小块，以无菌镊子接种于继代培养基，28℃黑暗培养3周；

所述的继代培养基为ms+2,4-d1.5mg/l+复酞核酸0.5mg/l+蔗糖45.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：

将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养3周。

所述的光诱导培养基为ms+2,4-d1.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖20.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

光照条件使用红蓝色led光源，波长660nm（红色）和450nm（蓝色），二者比例为3:1，总光量子通量密度为500-800μmol/m²·s，光周期为12h/12h。

实施例4

一种甘蔗热带种胚性细胞团诱导方法，包括如下步骤：

步骤（1），外植体取材：

选择9月龄健康茁壮蔗株，取其顶端肥厚带以上叶鞘，剥除外层老叶，酒精喷施消毒后入超净工作台，以无菌手术刀切取生长点以上3-8cm内区段，以无菌镊子层层剥除外层叶片，取其最内层3片幼叶，作为外植体；

步骤（2），外植体接种与启动培养：

按照步骤（1）所得外植体，以无菌镊子展为单层，以无菌手术刀切为4×6mm见方叶块，叶背向上接种于启动培养基，28℃黑暗培养3周，得到愈伤组织；

所述的启动培养基为ms+2,4-d3.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖15.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（3），继代培养与胚性愈伤诱导：

将步骤（2）得到的愈伤组织以无菌手术刀切为5mm见方小块，以无菌镊子接种于继代培养基，28℃黑暗培养3周；

所述的继代培养基为ms+2,4-d1.5mg/l+复酞核酸0.5mg/l+蔗糖45.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9；

步骤（4），光诱导胚性细胞团产生：

将步骤（3）所得胚性愈伤转移至光诱导培养基，28℃光照培养3周。

所述的光诱导培养基为ms+2,4-d1.0mg/l+复酞核酸1.0mg/l+蔗糖20.0g/l+琼脂粉5.0g/l，ph为5.8-5.9。

光照条件使用红蓝色led光源，波长660nm（红色）和450nm（蓝色），二者比例为3:1，总光量子通量密度为300-800μmol/m²·s，光周期为16h/8h。

对比例1

对比例1与实施例4的区别在于：步骤（5）的胚性细胞团诱导在黑暗条件下进行，其余皆相同。

对比例2

对比例1与实施例4的区别在于：步骤（5）的的胚性细胞团诱导光源换为普通日光灯管，其余皆相同。

对比例3

对比例3与实施例4的区别在于：所有培养基中均不添加复酞核酸，其余皆相同。

对比例4

对比例4与实施例4的区别在于：所有培养基中蔗糖含量均为常规的30g/l，其余皆相同。

应用实例1

采用本发明实施例4方法进行了不同基因型甘蔗热带种材料的胚性细胞团诱导，均成功获得了胚性细胞团（图1-3），结果如表1所示。

表1不同基因型间胚性愈伤细胞团诱导效率差异

注：愈伤诱导率=发生愈伤的外植体数/接种外植体数*100%；胚性愈伤诱导率=胚性愈伤数/接种愈伤数*100%；胚性细胞团诱导率=产生胚性细胞团的胚性愈伤数/接种胚性愈伤数*100%；表中数字为均值，不同字母表示在p<0.05水平上差异显著，duncan法检验。

表1中显示，在本发明的方法体系中，不同基因型间的遗传差异主要体现在胚性愈伤诱导阶段，而最终的胚性细胞团诱导率在各基因型间差异不明显，且均高于60%，表明本发明的技术方法可一定程度上突破基因型限制，在热带种中具有较高的泛用性。胚性细胞团具有极强的分化能力，在不含任何外源生长调节物质的空白ms培养基上即可增殖生长、分化成苗，如图4所示。

应用实例2

采用本发明实施例4、对比例1-4的方法进行了甘蔗热带种材料黑车里本的胚性细胞团诱导，结果如表2所示。

表2不同技术体系间黑车里本胚性愈伤细胞团诱导效率差异

注：愈伤诱导率=发生愈伤的外植体数/接种外植体数*100%；胚性愈伤诱导率=胚性愈伤数/接种愈伤数*100%；胚性细胞团诱导率=产生胚性细胞团的胚性愈伤数/接种胚性愈伤数*100%；表中数字为均值，不同字母表示在p<0.05水平上差异显著，duncan法检验。对比例1、2的结果显示，光照对甘蔗热带种胚性细胞团的诱导具有关键的促进作用，且红蓝光源效果显著优于普通日光灯。对比例3中，各阶段的诱导率均低于实施例4，表明复酞核酸作为一种新型植物生长调节剂，在热带种胚性细胞团诱导各阶段均能发挥促进作用，对甘蔗组培具有巨大的应用潜力。对比例4的结果与实施例4最为接近，但仍达到显著差异水平，表明在不同诱导阶段使用其各自适宜的蔗糖浓度，可进一步提高诱导效率。综上所述，可见本发明各步骤和参数具有良好的优化协同作用。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。