一种适于多种兰科药用植物批量化生产的方法与流程

本发明属于兰科药用植物的组培技术领域，具体涉及一种适于多种兰科药用植物批量化生产的方法。

背景技术：

兰科植物是全球性最为濒危的植物类群，兰科是国际自然保护联盟(iucn)红色目录中收录受威胁种类最多的科，已成为植物保护中的“旗舰”类群。铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)和霍山石斛(dendrobiumhuoshanense)为兰科石斛，属多年生草本植物，属国家二级保护植物，因其主要成分具有独特的保健与药用价值，被道家养生经典著作《道臧》誉为“中华九大仙草之首”。金线莲〔anoectochilusroburghii(wall.)lindl.〕为兰科开唇兰属多年生草本植物，因药用价值高，被称之为“药王”。白芨(bletillastriata(thunb.)reichb.f)是兰科白芨属多年生草本植物，白芨块茎入药，具有收敛、补肺止血、消肿生肌等广泛的药用价值，此外，白芨植株花色艳丽、花朵形似风铃，极具园艺观赏价值。目前，铁皮石斛、霍山石斛、金线莲和白芨现已成为现代医疗、保健食品等领域的研究热点。

我国大约有350种兰科植物被用于传统的中药材原料，约占我国兰科植物总数的四分之一，许多种类由于过度采集而变得区域性濒危或灭绝。主要原因是兰科植物对生态系统的变化极为敏感，一是由于对传粉者的高度专一性和依赖性，而生境的破坏可能首先影响到传粉者；二是兰科植物和真菌之间具有复杂的相互关系。目前，铁皮石斛、霍山石斛、金线莲和白芨的快速繁殖主要通过原球茎途径进行培养物的大量增殖，原球茎增殖速度快，但存在少量变异。丛生芽增殖途径未经愈伤或者原球茎再分化成芽阶段，可以很好地保持母体性状；因此，必须优化和解决组培繁育方式进行兰科植物规模化生产种苗的问题，对其开发利用和资源保存都具有重要意义。

近年来，科研工作者对兰科药用植物组织培养快速繁殖进行了大量产业化技术研究，尤其是2015年提供一种铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法(授权号zl201510460584.5)，实现了石斛原球茎同步增殖分化壮苗和生根培养等多个程序简化为一步完成的方法，但是采用该发明方法进行大规模工厂化生产时，发现多类影响优质种苗生产的问题。主要问题有：一是基础苗繁殖阶段，原球茎继代次数超过5次，组织内激素含量积累逐渐升高，针头大小的颗粒原球茎长势很猛，逐渐减少分化苗的形成，从而影响生产过程中有效苗的质量和数量，生长情况如图1、图2、图3所示；二是批量化生产阶段，不携带有颗粒原球茎，但丛生芽生根培养基成分中仍含有较高浓度的细胞分裂素和生长素，随着培养时间的延长，苗伸长生长的同时，基部形成根系，也会形成大量小芽，导致瓶内的苗参差不齐，不合适整瓶移栽，必须在超净工作台上进行分离，不仅降低工作效率，而且增加了污染几率，生长情况如图4、图5所示。在金线莲和白芨快速繁殖过程中，存在同样的问题，金线莲如图6、图7所示，白芨如图8、图9所示。此外，本申请人所在的组培研究中心引进了多种兰科药用植物资源：石斛包括铁皮石斛和霍山石斛；金线莲包括尖叶金线莲、大圆叶金线莲、红霞金线莲；白芨包括黄花白芨和紫花白芨。倘若不同品种的适宜外植体、组培繁殖方法都不相同，需花费大量的时间和精力去探索。因此，上述原因严重制约了兰科药用植物优质种苗产业化推广。

本发明针对上述问题，进一步优化兰科药用植物种苗产业化生产技术，以期创造出一种适于多种兰科药用植物高效成苗的组培方法，建立一套高效低耗量的培养体系，以最快的速度将研究成果转化为现实生产力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高效低耗量的适用于多种兰科药用植物快速繁殖方法，该方法培养效果佳，增殖系数高，稳定性好、生产成本低，是一种在最短的时间内获得大量有效苗的快速繁殖方法。本发明方法非常适合工业化生产，而且达到产业化水平。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种适于多种兰科药用植物批量化生产的方法，包括以下步骤：

(1)兰科药用植物资源与外植体消毒处理：选择石斛的腋芽、金线莲茎段、白芨假鳞茎为外植体进行消毒；

(2)基础苗获得：外植体消毒后接种在改良ms+6-ba1.0～4.0mg/l+iaa0.5～2.0mg/l+naa0.5～2.0mg/l+椰汁10～50mg/l琼脂固体培养基，诱导丛生芽，改良ms是指其它元素含量不变，有机成分含量为1.2倍，培养至少40d；

(3)批量化生产：将步骤(2)获得的丛生芽接在ms+多效唑0.5～5.0mg/l+矮壮素0.5～5.0mg/l+ga30.2～1.0mg/l的琼脂固体培养基上进行伸长生长、壮苗和生根；30～40d形成5～10cm高根叶俱全的有效苗；

(4)选择整齐一致的有效生根苗，打开瓶盖炼苗，然后移至以锯木屑为基质的移栽容器中，进行室内炼苗，再移栽至温室大棚的苗床中，进行大规模生产。

本发明根据外植体的特性，采用不同方法进行前期处理，常规消毒处理即可，污染率控制在10～30％以内。

进一步的，

步骤(1)将石斛多年生老茎剪下，用70％酒精表面消毒后放置室内培养30d，取萌发的腋芽备用。

金线莲盆栽苗移至炼苗室培养30d，将金线莲茎段外植体剪成含有1节1芽的规格，长度0.5-1cm备用。

白芨苗根部土壤清洗干净后，移栽至高压灭菌的锯木屑中培养30d，剥出假鳞茎备用。

将上述各种备用材料首先在无菌操作台上用无菌水清洗5～7次，用70％酒精浸润30秒，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌10～15min，无菌水冲洗5～6次用于接种。

进一步的，

步骤(2)将步骤(1)消毒处理好的外植体接种在步骤(2)培养基上，每个培养瓶外植体个数为1～10个，培养40d，单芽逐渐形成5芽以上的丛生芽时，转入到新的步骤(2)培养基中进行继代增殖培养，培养30～40天获得大量丛生芽。

本发明步骤(2)培养40d左右，每瓶能获得有效芽50株以上，最高控制在100株以内。

进一步的，

步骤(3)是将步骤(2)获得的丛生芽切下来，分成3～7株一丛，每瓶5～10丛，转入步骤(3)培养基中，培养30～40d即可伸长和生根，获得5～10cm高根叶俱全的有效苗进行移栽。

本发明步骤(3)一步成苗；每瓶至少获得有效生根苗30株，最高控制在50株以内。

进一步的，

步骤(4)石斛、金线莲和白芨试管苗炼苗阶段以锯木屑为移栽基质，室内炼苗控制在30d以内；温室大棚培养阶段，石斛和金线莲以树皮为栽培基质，白芨以椰糠：泥炭土：珍珠岩质量比例2:1：1为栽培基质。

进一步的，

步骤(4)石斛、金线莲和白芨试管苗移栽时，选择整齐一致的有效生根苗，打开瓶盖炼苗3-5d，瓶内的幼苗先用1000倍的多菌灵或代森锰锌喷雾1～2次，取出清洗根部培养基，进行室内炼苗，成活后再移栽至温室大棚的苗床中，进行大规模生产，培养30～40d长出新叶新根时，既已成活。

本发明炼苗阶段成活率达到100％，温室大棚阶段成活率达到95％以上。

进一步的，

步骤(2)和(3)试管苗的培养温度为24℃±2，1000～2000lx环境中，每天10～12小时光照培养；步骤(3)移栽苗在温度为20～30℃，湿度80～90％的条件下生长。

进一步的，

步骤(2)使用的培养基优选：改良ms+6-ba2.5mg/l+iaa0.5mg/l+naa0.8mg/l+椰汁20mg/l，或者使用培养基：ms改良+6-ba3.0mg/l+iaa0.6mg/l+naa1.0mg/l+椰汁40mg/l；改良ms是指其它元素含量不变，有机成分含量为1.2倍。

进一步的，

步骤(3)使用的培养基优选：ms+多效唑2.0mg/l+矮壮素2.0mg/l+ga30.5mg/l，或者使用培养基：ms+多效唑1.0mg/l+矮壮素1.0mg/l+ga31.0mg/l。

进一步的，

石斛包括铁皮石斛或霍山石斛；金线莲包括尖叶金线莲、大圆叶金线莲或红霞金线莲；白芨包括黄花白芨和紫花白芨。

本发明与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的方法适用于铁皮石斛、霍山石斛、尖叶金线莲、大圆叶金线莲、红霞金线莲、黄花白芨、紫花白芨等多种兰科药用植物组织培养快速繁殖；选择石斛腋芽、金线莲茎段、白芨假鳞茎为外植体，从外界取回材料后立刻进行常规消毒处理，污染率高，尤其是白芨假鳞茎生长在土壤中，污染率高达100％。该发明方法根据不同材料母株特性，选择最佳前期处理方法，重点解决了外植体本身的污染源，再进行常规消毒，污染率控制在30％以内，显著降低了污染率。该发明方法选择不同兰科药用植物品种，但是采用相同培养方法进行组织培养快速繁殖种苗，大大提高了培养效率。

2、针对现有技术存在的不足之处，该发明方法采用增殖途径未经愈伤或者原球茎再分化成芽阶段，直接形成丛生芽，不仅有效苗数多，且能保持与母本优良特性的高度一致性。比目前报道最佳培养方法缩短原球茎诱导时间40-50天(见发明专利铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法，授权号zl201410288573.9)。

3、本发明根据生产需要设计培养方法，在高效基础苗获得阶段，培养基成分中提高细胞分裂素和生长素的浓度，促进芽萌发，抑制根形成；培养基中添加1.2倍的有机成分和椰汁促进其生长、发芽，缩短出芽时间，提高增殖倍数，加快基础苗的繁殖，每瓶获得有效芽至少50株，最高控制在100株以内，防止苗数过多影响基础苗质量。该发明方法不仅提高了培养效率，还节约了生产成本。在高效批量化生产时，去掉培养基中细胞分裂素和生长素，防止无效芽的形成；添加矮壮素和多效唑成分促进其壮苗与生根；添加赤霉素最突出的生理效应是促进茎的伸长。每瓶获得有效芽至少30株，最高控制在50株以内，防止苗数过多生长空间变小，从而影响试管苗生根效率与健壮程度。

4、该发明方法同步诱导铁皮石斛、霍山石斛、金线莲与白芨等兰科药用植物的芽伸长生长和根系形成，30～40d形成5～10cm高根叶俱全的有效苗，既“一步成苗”方法；比目前报道最短时间提早了15～30天形成完整植株(见发明专利铁皮石斛组培一步成苗批量化生产的方法，授权号zl201410288573.9)。

5、铁皮石斛、霍山石斛、金线莲与白芨生根试管苗移栽到锯木屑基质进行室内炼苗，但时间不宜过长，控制在30d以内，成活率达到100％；经过炼苗后的试管苗移栽至温室大棚，缓苗期短，显著提高移栽成活率(高达95％以上)。

附图说明

图1为石斛丛生芽增殖前期受原球茎影响的情况；

图2为石斛丛生芽增殖中期受原球茎影响的情况；

图3为石斛丛生芽生根受原球茎影响的情况；

图4为石斛丛生芽生根受无效芽影响的情况；

图5为石斛健壮生根苗参差不齐的情况；

图6为金线莲丛生芽增殖受原球茎影响的情况；

图7为金线莲健壮生根苗参差不齐的情况；

图8为白芨丛生芽增殖受原球茎影响的情况；

图9为白芨健壮生根苗参差不齐的情况；

图10为石斛老茎萌发腋芽的情况；

图11为石斛腋芽外植体接种在培养基上的情况；

图12为石斛腋芽形成丛生芽的情况；

图13为石斛丛生芽增殖培养20d左右的情况；

图14为石斛丛生芽增殖培养40d左右的情况；

图15为金线莲盆苗在炼苗室生长的情况；

图16为金线莲茎段外植体接种在培养基上的情况；

图17为金线莲茎段增殖培养的生长情况；

图18为白芨盆苗在炼苗室生长的情况；

图19为白芨假鳞茎外植体接种在培养基上的情况；

图20为白芨假鳞茎增殖培养的生长情况；

图21为石斛丛芽增殖生根伸长培养初期的生长情况；

图22为石斛丛芽增殖生根伸长培养后期的生长情况；

图23为石斛健壮有效生根苗的生长情况；

图24为石斛试管苗规模化炼苗成活的生长情况；

图25为石斛试管苗温室大棚规模化生产时幼苗的生长情况。

图26为石斛试管苗温室大棚规模化生产时成苗的生长情况。

图27为金线莲丛芽增殖生根伸长培养前期的生长情况；

图28为金线莲丛芽增殖生根伸长培养后期的生长情况；

图29为金线莲健壮有效生根苗的生长情况；

图30为金线莲试管苗规模化炼苗成活的生长情况；

图31为金线莲试管苗温室大棚规模化生产时幼苗的生长情况；

图32为金线莲试管苗温室大棚规模化生产时成苗的生长情况；

图33为白芨丛芽增殖生根伸长培养后期的生长情况；

图34为白芨健壮有效生根苗的生长情况；

图35为白芨试管苗规模化炼苗成活的生长情况；

图36为白芨试管苗规模化炼苗成活的生长情况。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、适于多种兰科药用植物批量化生产的方法

一、培养基配制和灭菌

初代继代培养基用于基础苗繁殖：ms改良(ms其它元素含量不变，有机成分含量为1.2倍)+6-ba2.5mg/l+iaa0.5mg/l+naa0.8mg/l+椰汁20mg/l；

伸长和生根培养基用于批量化生产：ms+多效唑2.0mg/l+矮壮素2.0mg/l+ga30.5mg/l；

以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

二、高效基础苗繁殖

1、选择铁皮石斛和霍山石斛多年生老茎剪下，用70％酒精表面消毒后培养室内，放置在3-4层滤纸的培养皿中，观察滤纸湿度，喷雾无菌水保湿，促进腋芽萌发，培养30d左右，萌发0.5～1.0cm的腋芽，老茎上腋芽生长情况如图10所示。将腋芽的气生根去掉，在无菌操作台上用无菌水清洗5～7次，用70％酒精浸润30s左右，再放入0.1％的升汞溶液中灭菌10～15min，无菌水冲洗5～6次备用。用无菌滤纸把水分吸干，腋芽转入装有初代培养基上玻璃培养管(容量20毫升)，或塑料培养瓶(容量80毫升)中，每个培养瓶腋芽外植体个数为1～10个，污染率在10％左右，接种情况如图11所示。培养10d左右，从腋芽的基部开始形成芽点，继续培养30d左右，逐渐形成5芽以上的丛生芽，增殖情况如图12和图13所示。增殖培养时，将丛芽分成3～7株一丛接种在增殖培养基上，每瓶接种5～10丛，培养30～40d，从基部形成数量较多的芽，且整齐一致，每代每瓶获得有效芽50～100株，生长情况如图14所示。

2、选择金线莲盆栽苗移至炼苗室培养30d左右，无菌水喷雾叶片表面，生长情况如图15所示。然后将金线莲茎段外植体剪成含有1节1芽的规格(0.5～1cm)备用，消毒方法同步骤1。用无菌滤纸把水分吸干，腋芽转入装有初代培养基上玻璃培养管(容量20毫升)，或塑料培养瓶(容量80毫升)中，每个培养瓶腋芽外植体个数为1～10个，金线莲茎段接种情况如图16所示。培养10d左右，从茎段叶腋处开始形成芽点，污染率在20％以下；继续培养30d左右，逐渐形成5芽以上的丛生芽。增殖培养时，将丛芽分成3～7株一丛接种在增殖培养基上，每瓶接种5～10丛，培养30～40d从基部形成数量较多的芽，且整齐一致，每代每瓶获得有效芽50～100株，生长情况如图17所示。

3、选择优质白芨苗，将根部的土壤清洗干净，然后用1000倍的多菌灵或代森锰锌浸泡30min,再移栽到高压灭菌后的锯木屑基质中，至炼苗室培养30d左右，无菌水喷雾叶片表面，生长情况如图18所示。然后将白芨假鳞茎剥出备用，消毒方法同步骤1。用无菌滤纸把水分吸干，腋芽转入装有初代培养基上玻璃培养管(容量20毫升)，或塑料培养瓶(容量80毫升)中，每个培养瓶腋芽外植体个数为1～10个，白芨假鳞茎接种情况如图19所示。培养20d左右，从茎段叶腋处开始形成芽点，污染率在30％以下；继续培养30d左右，逐渐形成5芽以上的丛生芽。增殖培养时，将丛芽分成3～7株一丛接种在增殖培养基上，每瓶接种5～10丛，培养30～40d，从基部形成数量较多的芽，且整齐一致，每瓶每代获得有效芽50～100株，生长情况如图20所示。

石斛、金线莲和白芨高效基础苗繁殖，在下述培养条件下进行培养：24℃左右，每天10小时光照，光照强度为1000～2000lx左右。这一步需要抑制根的形成，有效芽的数量控制在50～100株以内，以防影响基础苗的繁殖。根据生产规模，繁殖充足的基础苗，再进行批量化生产。

三、高效批量化生产

取上述10000个株系丛生芽进行批量化生产，具体方法如下：将步骤二获得的丛生芽分成3～7株一丛规格分开，接到批量化生产培养基中培养。

1、石斛丛生芽分芽接种在批量化生产培养基上，每瓶接种10～30株，情况如图21所示；培养30d左右，每个芽丛均长成5～10cm高的健壮试管苗，同时从基部长出5～10条根的完整植株，每代每瓶获得有效生根苗30～50株，生长情况如图22所示；选择健壮生根苗，打开瓶盖炼苗3-5d，瓶内的幼苗先用1000倍的多菌灵或代森锰锌喷雾1～2次，石斛苗取出清洗根部培养基，放置网床上晾至根发白，情况如图23所示；随后将幼苗移至以锯木屑为基质的移栽容器中，炼苗室培养30d左右，生长情况如图24所示；然后将炼苗成活的组培苗移栽至温室大棚以树皮为基质的苗床中，栽培3个月左右长出新芽新根时，既已成活，生长情况如图25所示；继续培养1年以后，株高达到15cm以上的成苗，生长情况如图26所示。

2、金线莲丛生芽分芽接种在批量化生产培养基上，每瓶接种10～30株，情况如图27所示；培养30d左右，从芽基部形成少量丛生芽，同时伸长生长，长成5～10cm高的健壮试管苗，同时从基部长出5～10条根的完整植株，每代每瓶获得有效生根苗30～50株以内，生长情况如图28所示；选择健壮生根苗，打开瓶盖炼苗移栽，方法同上，金线莲炼苗情况如图29所示；温室大棚金线莲生长情况如图31所示；继续培养1年以后，株高达到15cm以上的成苗，生长情况如图32所示。

3、白芨丛生芽分芽接种在批量化生产培养基上，每瓶接种10株以上；培养30d左右，从芽基部形成少量丛生芽，同时伸长生长，长成5-10cm高的健壮试管苗，同时从基部长出5～10条根的完整植株，每代每瓶获得有效生根苗30～50株，生长情况如图33所示；有效生根苗情况如图34所示；选择健壮生根苗，打开瓶盖炼苗移栽，方法同上，白芨炼苗情况如图35所示；然后将炼苗成活的白芨试管苗移栽至温室大棚以椰糠：泥炭土：珍珠岩(2:1：1)为基质的苗床中，栽培1个月后长出新叶新根，开始伸长生长，生长情况如图36所示。

石斛、金线莲和白芨等兰科植物批量化生产时，在下述培养条件下进行培养：24℃左右，每天10小时光照，光照强度为1000～2000lx左右。移栽苗在温度为20～30℃，湿度80～90％的条件下生长，长出新叶新根时，既已成活。这一步需要抑制无效芽的形成，以防影响生根苗移栽。

本发明所提供的兰科植物组织培养繁殖方法，根据兰科植物不同品种的特性，选择最适宜的外植体，如石斛腋芽、金线莲茎段和白芨假鳞茎，取材容易，数量大，遗传稳定性高，生长良好等优势。初代培养前，根据不同材料母株特性，进行前期处理，污染率控制在30％以内，而且不经过愈伤组织阶段，直接诱导丛生芽，不仅生长速度快，而且繁殖系数大，每瓶有效苗最低为50株，最高控制在100株以内。批量化生产阶段，采用多步合一的培养方法，培养过程中，去掉培养基中细胞分裂素和生长素，防止无效芽的形成；添加矮壮素和多效唑成分促进其壮苗与生根；添加赤霉素最突出的生理效应是促进茎的伸长，每瓶获得有效生根壮苗最低为30株，最高控制50株以内。本发明方法不仅简化了健康种苗生产程序，而且节约了培养室空间，降低了生产成本，提高了生产效率。本发明技术已成功应用到兰科药用植物大规模生产中，且获得非常好的应用效果。

实施例2、组织培养快速繁殖盾叶薯蓣一、培养基配制和灭菌

初代继代培养基：ms改良(ms其它元素含量不变，有机成分含量为1.2倍)+6-ba3.0mg/l+iaa0.6mg/l+naa1.0mg/l+椰汁40mg/l；

伸长和生根培养基：ms+多效唑1.0mg/l+矮壮素1.0mg/l+ga31.0mg/l。

以上培养基121℃下，灭菌20分钟。

取石斛腋芽、金线莲茎段和白芨假鳞茎，基本操作方法同实施例1一致；效果与实施例1相差不大。