富硒猴头菇菌丝体，制备方法及其应用与流程

本发明涉及一种富硒猴头菇菌丝体的制备方法及其抗胃粘膜损伤活性，用于治疗消化性溃疡以及相关的疾病，属于医药领域，国际专利分号分类为c08b37/60。

背景技术：

猴头菌（hericiumerinaceus(rullexf.)pers）属担子菌门、伞菌纲、红菇目、猴头菌科，它除了味道鲜美、营养丰富外，还具有降血糖、抗氧化和抗衰老、促进周围神经再生，抑制肿瘤细胞生长、增强免疫调节能力等功效，尤其对治疗胃溃疡及胃肠癌有显著作用。

硒是人体的必须微量元素，在体内主要参与形成谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase,gsh-px)、硫氧还蛋白还原酶（thioredoxinreductase,trxr）、硒蛋白p（selenoproteinp，selp），调节氧化应激、氧化还原状态及关键细胞活动。缺乏硒可能导致许多疾病如克山病、过度氧化应激造成的疾病等，并加重疾病的进程。我国大部分地区都属于缺硒区，因此要靠从日常饮食中摄入来补充硒。

硒在自然界中主要以无机硒和有机硒存在，其中无机硒的安全范围很小，食用菌具有较强的富硒能力，能将无机硒转化为人体吸收和利用的有机硒。猴头菌作为味道、营养、功效倶佳的食用菌，自然是选择用来富硒培养的重要材料；食用菌深层发酵具有周期短、占地少、成本低、适合工业化生产、质量人为可控等优点，因此在食用菌生产中具有广阔的应用前景。但与其它食用菌如香菇、金针菇等相比，对猴头菇菌丝体进行富硒培养存在着产量低、耐硒能力差、富硒效率低等困难，因此目前对猴头菌的富硒培养大多仅限于子实体的培养。本发明通过解决富硒猴头菇深层发酵的技术性难题，获得富硒菌丝体，并进一步研究了菌丝体治疗胃溃疡活性，证明猴头菇富硒菌丝体能用于治疗胃溃疡以及相关疾病等。

技术实现要素：

本发明的目的之一是通过摇瓶液体培养和深层发酵罐培养获得富硒猴头菇菌丝体。

所述的获得方法，将猴头菇菌种放入培养箱里活化，从平板上切取菌丝浓密，生长良好的菌种分别接入含有na2seo3的pda平板培养基中，倒置培养至菌丝长满平板；从平板上切取菌块，接入液体种子液培养基中，震荡培养。将液体种子接种至装有含na2seo3的发酵培养基的摇瓶中，震荡培养。离心或过滤取菌丝体，用蒸馏水冲洗，烘干，得摇瓶培养富硒猴头菇菌丝体。

所述的获得发酵罐培养富硒猴头菇菌丝体所述方法获得猴头菇种子液后接入发酵罐培养。离心或过滤取菌丝体，用蒸馏水冲洗，烘干，得发酵罐培养富硒猴头菇菌丝体。具体方案如下：

步骤一：将活化后的猴头菇菌种接入含有na2seo3的pda平板培养基中，倒置培养至菌丝长满平板，从平板上切取菌块，接入含有na2seo3的液体种子液培养基中，在转速50-300rpm下震荡培养5-14d，得到富硒猴头菇菌丝体种子液；

步骤二：将步骤一中的富硒猴头菇菌丝体种子液接种于na2seo3的发酵培养基的摇瓶中，在温度为24-30℃，转速为50-300rpm下震荡培养培养时间5-14d，将得到的发酵液离心或过滤取菌丝体，用蒸馏水冲洗，烘干，得发酵培养的富硒猴头菇菌丝体。

所述步骤一中，活化温度为24-30℃。

所述步骤一中，活化时间为15-60min。

所述步骤一中，平板倒置培养温度为24-30℃。

所述步骤一中，种子液震荡培养温度为24-30℃。

所述步骤一中，种子液震荡培养转速为50-300rpm。

所述步骤一中，种子液震荡时间为5-14d。

所述步骤一中，种子液中na2seo3的浓度为2-20μg/ml。

所述步骤一中，种子液的成分包括马铃薯18-22%，葡萄糖0.8-1.5%，麦芽糖0.8-1.5%，mgso40.1-0.2%，k2hpo40.05-0.2%，ph自然。

进一步优选方案为，种子液成分为马铃薯20%，葡萄糖1%，麦芽糖1%，mgso40.15%，k2hpo40.1%，ph自然。

所述步骤二中，摇瓶发酵温度为24-30℃。

所述步骤二中，摇瓶发酵时间为5-14d。

所述步骤二中，摇瓶发酵转速为50-300rpm。

所述步骤二中，摇瓶发酵培养液中na2seo3的浓度为2-20μg/ml。

所述步骤二中，摇瓶发酵接种量为5-15%。

所述步骤二中，发酵罐培养温度为24-30℃。

所述步骤二中，发酵罐培养转速为50-300rpm。

所述步骤二中，发酵罐培养时间为5-10d。

所述步骤二中，发酵罐do为20-80%。

所述步骤二中，发酵培养基成分包括4-6.5%可溶性淀粉、4-6.5%黄豆粉、0.01-0.05%cacl2、20-28mg/100mlvb1+vb2+vb6。

进一步优选方案为发酵罐培养基成分为5.8%可溶性淀粉、5.8%黄豆粉、0.04%cacl2、24mg/100mlvb1+vb2+vb6。

所述方法中，发酵罐培养的接种量为5-15%。

本发明目的之二是提供一种富硒且质量可控的猴头菇菌丝体在制备用于治疗消化性溃疡、与炎症相关的疾病药物中的应用。将上述方法制备得到的富硒猴头菇菌丝应用于胃粘膜损伤小鼠中，具有一定的作用，因此可应用于制备治疗消化性溃疡、与炎症相关疾病的药物。

所述方法中，步骤二中菌丝体产量在1.5g/100ml以上。

所述方法中，步骤二中菌丝体有机硒含量在100mg/kg菌丝以上。

食用菌将无机硒转化成有机硒，主要是通过以下两种方式：（1）将无机硒同化成硒氨基酸，如硒代蛋氨酸、硒代胱氨酸和硒代半胱氨酸，并进一步合成硒蛋白；（2）将无机硒同化合成硒多糖。本发明的技术方案，特点在于在固体培养基和液体培养基中均添加高浓度的硒使菌丝体的耐硒能力和无机硒转化能力不断增强，同时对种子培养基和发酵培养基配方进行优化，得到高产量的菌丝体和含量高的有机硒。

附图说明

图1为富硒猴头菇菌丝体减少乙醇所致小鼠胃粘膜面积的作用。

其中，c空白组，m模型组，p阳性组，ld低剂量组，md中剂量组，hd高剂量组。

图2为富硒猴头菇菌丝体抑制乙醇所致小鼠胃粘膜损伤面积的效率。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步说明本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的化学试剂、层析柱等，如无特殊说明均按常规实验条件下进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

实施例1：摇瓶培养富硒猴头菇菌丝体的制备方法。

将猴头菇菌种放入培养箱里活化，30min后，从平板上切取1cm²菌丝浓密，生长良好的菌种分别接入含有6μg/mlna2seo3的pda平板培养基中，28℃倒置培养至菌丝长满平板；从平板上切取1cm²菌块，接入液体种子液培养基中，25.8℃震荡培养7d，转速为150r/m。将液体种子接种至装有含12μg/mlna2seo3的发酵培养基的摇瓶中，25.8℃震荡培养7d，转速为150r/m。离心或过滤取菌丝体，用蒸馏水冲洗，烘干，得摇瓶培养富硒猴头菇菌丝体，产量达1.5g/100ml以上，菌丝体有机硒含量在100mg/kg。

实施例2：发酵罐培养富硒猴头菇菌丝体的制备方法

将猴头菇菌种放入培养箱里活化，30min后，从平板上切取1cm²菌丝浓密，生长良好的菌种分别接入含有6μg/mlna2seo3的pda平板培养基中，28℃倒置培养至菌丝长满平板；从平板上切取1cm²菌块，接入液体种子液培养基中，25.8℃震荡培养7d，转速为150r/m。将液体种子接种至装有含12μg/mlna2seo3的发酵培养基的发酵罐中，25.8℃培养7d，转速为150r/m，do为40-60%，ph4.5-7.0。离心或过滤取菌丝体，用蒸馏水冲洗，烘干，得发酵罐培养富硒猴头菇菌丝体，产量达1.5g/100ml以上，菌丝体有机硒含量在100mg/kg。

实施例3

针对实施例2，口服富硒猴头菇菌丝体抑制小鼠胃粘膜损伤的作用

将雄性昆明小鼠60只，随机分为空白组、模型组、阳性对照雷尼替丁组、富硒猴头菇菌丝体低、中、高剂量组，每组10只。空白组和模型组给予等体积蒸馏水，阳性对照组灌胃雷尼替丁50mg/kg，低、中、高剂量组分别灌胃富硒猴头菇菌丝体50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg，动物每天灌胃给药1次，连续10d。末次给药前小鼠禁食12h，自由饮水，于末次给药1h后，除空白组外，动物灌胃无水乙醇0.25ml/只，空白组灌胃等积体的蒸馏水，同时禁水。1h后处死动物，取出全胃，剪开胃壁，生理盐水冲净，拍照，测量溃疡面积。

在图1中：富硒猴头菇菌丝体在50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg剂量下均能降低显著降低乙醇诱导致小鼠胃粘膜损伤面积，说明富硒猴头菇菌丝体具有降低消化性溃疡面积的作用。

在图2中：富硒猴头菇菌丝体在50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg剂量下均能显著提高乙醇所致小鼠胃粘膜损伤面积比例的抑制率，说明富硒猴头菇菌丝具有治疗消化性溃疡的作用。