一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法与流程

本发明属于毒性研究技术领域，尤其涉及一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法。

背景技术：

近些年来农药的的生产量和利用量都在大幅上涨，包括杀虫剂、杀螨剂、杀菌剂、除草剂、植物生长调节剂等。三唑类杀菌剂在近十年中全球市场销售量位居首位，已成为全球杀菌剂主要大类，其主要通过干扰细胞色素p450抑制甾醇的合成从而影响细胞膜的形成。利用三唑类农药的高效、广谱、内吸的特性，目前已经将其应用到了水果、坚果、谷类以及蔬菜等作物上的真菌病害防治上。然而农药施用后仅有少部分作用于目标作物，大部分则是通过雨雾淋洗、地表径流、大气沉降和食物链等途径进入到土壤、地下水、河流与湖泊等环境介质中，对生态安全与人类健康带来潜在的风险。

目前农药的毒性作用的研究主要集中在植物、水生动物和哺乳动物，相对于陆生昆虫研究较少。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法，采用本发明提供的方法能够准确地评价三唑类农药的生长发育毒性，为农业上合理使用的三唑类农药的剂量和浓度提供理论和实验数据支持。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法，包括以下步骤：

1)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；

2)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；

3)当所述步骤1)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重与步骤2)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重相比，任一项出现显著差异时，表明三唑类农药具有生长发育毒性；

所述含有三唑类农药的固体培养基中三唑类农药的浓度为10～800mg/l。

优选的，所述步骤1)含有三唑类农药的固体培养基以水为溶剂，每升还包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1gcacl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。

优选的，所述步骤1)和2)黑腹果蝇的三龄幼虫的数量为18～22只。

优选的，所述培养的条件包括：所述培养的温度为24～26℃，所述培养的光暗比为12h:12h；所述培养的环境湿度为50～60％。

优选的，所述步骤2)固体培养基以水为溶剂，每升包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1gcacl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。

优选的，还包括：所述步骤1)培养过程中，蛹化得到的黑腹果蝇出现畸形，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

优选的，还包括：将将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6h以上，当三龄幼虫的肠道细胞出现损伤，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

优选的，所述三唑类农药包括戊唑醇。

本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法，包括以下步骤：1)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；2)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；3)当所述步骤1)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重与步骤2)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重相比，任一项出现显著差异时，表明三唑类农药具有生长发育毒性；所述含有三唑类农药的固体培养基中三唑类农药的浓度为10～800mg/l。采用本发明提供的方法能够准确地评价三唑类农药的生长发育毒性，为农业上合理使用的三唑类农药的剂量和浓度提供理论和实验数据支持。

附图说明

图1为暴露于戊唑醇后幼虫蛹化羽化率；

图2为暴露于戊唑醇后成蝇体重；

图3为暴露于戊唑醇后幼虫蛹化羽化过程中的畸形；

图4为暴露于戊唑醇后台盼蓝染色结果。

具体实施方式

本发明提供了一种利用黑腹果蝇评价三唑类农药的生长发育毒性的方法，包括以下步骤：1)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；2)将黑腹果蝇的三龄幼虫置于固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重；3)当所述步骤1)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重与步骤2)的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重相比，任一项出现显著差异时，表明三唑类农药具有生长发育毒性；所述含有三唑类农药的固体培养基中三唑类农药的浓度为10～800mg/l。

在本发明中，所述三唑类农药优选包括戊唑醇。

本发明将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重。

在本发明中，所述黑腹果蝇优选选用w¹¹⁸野生型黑腹果蝇，本发明对所述w¹¹⁸野生型黑腹果蝇的来源没有特殊限定，采用常规市售的即可。

在本发明中，所述含有戊唑醇的固体培养基中三唑类农药的浓度为10～800mg/l，具体为10mg/l、100mg/l、250mg/l、500mg/l和800mg/l。在本发明中，所述三唑类农药优选用二甲基亚砜溶解后，再混合到固体培养基中，配制成相应的浓度。

在本发明中，所述含有三唑类农药的固体培养基以水为溶剂，每升还优选包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1gcacl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液；更优选包括77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。在本发明中，所述黑腹果蝇的三龄幼虫的数量优选为18～22只，更优选为20只。

在本发明中，所述培养的条件优选包括：所述培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃；所述培养的光暗比为12h:12h；所述培养的环境湿度为50～60％。本发明对所述培养时所需的光照强度没有特殊限定，采用本领域技术人员常规光照培养黑腹果蝇的光照强度即可。本发明优选采用恒温培养箱对黑腹果蝇进行培养。

本发明将黑腹果蝇的三龄幼虫置于固体培养基上，培养6～8d，每天统计黑腹果蝇的蛹化率、羽化率和体重。

在本发明中，所述固体培养基优选以水为溶剂，每升包括：70～80g玉米面、30～35g酵母、8～12g琼脂、0.5～1gcacl2、30～33g蔗糖、60～65g葡萄糖、1～3g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液；更优选包括77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。在本发明中，所述固体培养基中还优选含有二甲基亚砜，所述二甲基亚砜的含量与含有三唑类农药的固体培养基中的二甲基亚砜的含量相同。

在本发明中，所述黑腹果蝇的三龄幼虫置于固体培养基上培养的条件与黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上培养的条件相同，在此不再赘述。

在本发明中，当在含有三唑类农药的固体培养基上培养的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重与固体培养基上培养的的黑腹果蝇的蛹化率、羽化率、体重相比，任一项出现显著差异时，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

在本发明中，所述显著差异p值小于0.05。

在本发明中，所述方法还优选包括：在黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上培养过程中，蛹化得到的黑腹果蝇出现畸形，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

在本发明中，当所述蛹化得到的黑腹果蝇在羽化时难以破壳成蝇，表明三唑类农药具有生长发育毒性；当所述蛹化得到的黑腹果蝇的翅膀萎缩无法发育成健康成蝇时，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

在本发明中，所述方法还优选包括：将黑腹果蝇的三龄幼虫置于含有三唑类农药的固体培养基上，培养6h以上，当三龄幼虫的肠道细胞出现损伤，表明三唑类农药具有生长发育毒性。

在本发明中，所述6h以上优选具体为6h、12h和30h。

本发明对所述检测龄幼虫的肠道细胞出现损伤的方法没有特殊限定，采用常规方法即可，在本发明实施例中具体选用台盼蓝染色实验进行检测。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

试剂配制：戊唑醇，纯度97％，购自上海毕得医药科技有限公司，用二甲基亚砜溶解。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积二甲基亚砜。

暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照(不含戊唑醇)、戊唑醇组(10mg/l)。每个平行实验组中放入20只三龄幼虫进行染毒培养，置于标准培养条件下培养7d。另外一组置于标准培养条件下培养6h，12h和30h后进行台盼蓝染色实验。培养的培养基为77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。培养的条件为温度为24℃，光暗比为12h:12h；环境湿度为50％。

样本检测：在7d内统计各组蛹及成蝇数量，计算各浓度下蛹化率和羽化率，分别称量新羽化雌雄成蝇体重，另外在显微镜下观察各发育过程果蝇形态特征。取染毒不同时间的三龄幼虫染色洗净后置于体式显微镜下观察各组幼虫细胞染色情况结果见图1～4。

实施例2

试剂配制：戊唑醇，纯度97％，购自上海毕得医药科技有限公司，用二甲基亚砜溶解。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积二甲基亚砜。

暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照(不含戊唑醇)、戊唑醇组(100mg/l)。每个平行实验组中放入20只三龄幼虫进行染毒培养，置于标准培养条件下培养7d。另外一组置于标准培养条件下培养6h，12h和30h后进行台盼蓝染色实验。培养的培养基为77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。培养的条件为温度为24℃，光暗比为12h:12h；环境湿度为50％。

样本检测：在7d内统计各组蛹及成蝇数量，计算各浓度下蛹化率和羽化率，分别称量新羽化雌雄成蝇体重，另外在显微镜下观察各发育过程果蝇形态特征。取染毒不同时间的三龄幼虫染色洗净后置于体式显微镜下观察各组幼虫细胞染色情况结果见图1～4。

实施例3

试剂配制：戊唑醇，纯度97％，购自上海毕得医药科技有限公司，用二甲基亚砜溶解。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积二甲基亚砜。

暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照(不含戊唑醇)、戊唑醇组(250mg/l)。每个平行实验组中放入20只三龄幼虫进行染毒培养，置于标准培养条件下培养7d。另外一组置于标准培养条件下培养6h，12h和30h后进行台盼蓝染色实验。培养的培养基为77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。培养的条件为温度为24℃，光暗比为12h:12h；环境湿度为50％。

样本检测：在7d内统计各组蛹及成蝇数量，计算各浓度下蛹化率和羽化率，分别称量新羽化雌雄成蝇体重，另外在显微镜下观察各发育过程果蝇形态特征。取染毒不同时间的三龄幼虫染色洗净后置于体式显微镜下观察各组幼虫细胞染色情况结果见图1～4。

实施例4

试剂配制：戊唑醇，纯度97％，购自上海毕得医药科技有限公司，用二甲基亚砜溶解。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积二甲基亚砜。

暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照(不含戊唑醇)、戊唑醇组(500mg/l)。每个平行实验组中放入20只三龄幼虫进行染毒培养，置于标准培养条件下培养7d。另外一组置于标准培养条件下培养6h，12h和30h后进行台盼蓝染色实验。培养的培养基为77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。培养的条件为温度为24℃，光暗比为12h:12h；环境湿度为50％。

样本检测：在7d内统计各组蛹及成蝇数量，计算各浓度下蛹化率和羽化率，分别称量新羽化雌雄成蝇体重，另外在显微镜下观察各发育过程果蝇形态特征。取染毒不同时间的三龄幼虫染色洗净后置于体式显微镜下观察各组幼虫细胞染色情况结果见图1～4。

实施例5

试剂配制：戊唑醇，纯度97％，购自上海毕得医药科技有限公司，用二甲基亚砜溶解。标准培养基中加入等体积不同浓度储备液至指定浓度，空白对照组中加入等体积二甲基亚砜。

暴露条件：设置2个实验组，每组5个平行；空白对照(不含戊唑醇)、戊唑醇组(800mg/l)。每个平行实验组中放入20只三龄幼虫进行染毒培养，置于标准培养条件下培养7d。另外一组置于标准培养条件下培养6h，12h和30h后进行台盼蓝染色实验。培养的培养基为77.7g玉米面、32.19g酵母、10.6g琼脂、0.726gcacl2、31.62g蔗糖、63.2g葡萄糖、2g山梨酸钾和15ml5％对羟基苯甲酸丁酯溶液。培养的条件为温度为24℃，光暗比为12h:12h；环境湿度为50％。

样本检测：在7d内统计各组蛹及成蝇数量，计算各浓度下蛹化率和羽化率，分别称量新羽化雌雄成蝇体重，另外在显微镜下观察各发育过程果蝇形态特征。取染毒不同时间的三龄幼虫染色洗净后置于体式显微镜下观察各组幼虫细胞染色情况结果见图1～4。

实施例1～4中的图1～图4结果表明，暴露于戊唑醇对幼虫的蛹化过程影响较小，各浓度组平均蛹化率均接近100％，但是对果蝇的羽化过程影响较大，随浓度升高各组平均羽化率分别为：0mg/l时93.75％、10mg/l时90.00％、100mg/l时86.67％、250mg/l时85.00％、500mg/l时86.25％、800mg/l时76.25％，800mg/l浓度组平均羽化率较对照组下降17.50％，与对照组相比p小于0.05出现显著差异，可以看出高浓度戊唑醇影响果蝇的生长发育过程。各组雌蝇平均体重分别为0mg/l时1.078mg、10mg/l时1.052mg、100mg/l时0.994mg、250mg/l时0.926mg、500mg/l时0.932mg、800mg/l时0.843mg。各组雄蝇平均体重分别为0mg/l时0.787mg、10mg/l时0.760mg、100mg/l时0.723mg、250mg/l时0.708mg、500mg/l时0.712mg、800mg/l时0.708mg。500m/l和800mg/l浓度时雌雄体重与对照组相比p小于0.05，表现出显著差异，表明高浓度戊唑醇对果蝇的正常发育表现出毒性作用。另外，在变态发育过程中部分果蝇出现畸形，其中部分羽化的果蝇难以破壳成蝇，部分新羽化果蝇翅膀萎缩无法发育成健康成蝇，且随戊唑醇浓度增加新羽化的雌雄果蝇体重下降。台盼蓝染色实验发现，戊唑醇还导致了幼虫肠道细胞出现损伤，暴露6h后，各浓度组三龄幼虫肠道没有出现细胞损伤。作用12h后观察到肠道细胞损伤，在250mg/l、500mg/l和800mg/l浓度组中幼虫部分肠道呈现蓝色。延长至30h后，肠道损伤面积持续增大，在250mg/l、500mg/l和800mg/l高浓度组颜色深的蓝黑色损伤点出现。可见，戊唑醇暴露时间越长、作用浓度越高对果蝇幼虫肠道的损伤效应越强，高浓度下可导致肠道细胞死亡。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。