本发明属于医药领域，特别是涉及一种糖尿病足肌腱变性坏死症动物模型的生产方法。
背景技术：
糖尿病足坏疽(diabeticfoot，df)全称糖尿病足肢端坏疽，是一种与局部神经异常和下肢远端外周血管病变相关的足部感染、溃疡和(或)深层组织破坏，是下肢血管病变、神经病变和感染共同作用的结果，是糖尿病并发症发展的最常见终点。
全国名中医奚九一教授经长期研究发现，糖尿病足坏疽中的非缺血性的肌腱坏死类型危害最大。本症的病变组织、治疗与预后均不同于缺血性坏疽(脱疽)。本症病变部位始终不发生缺血性的干枯分界脱落现象，确与中医“脱疽(缺血性坏疽)”不符。肌腱组织中医归于“筋”，故奚教授拟相应的中医病名为“筋疽(肌腱变性坏死症)”(奚九一等，糖尿病足肌腱变性坏死症(筋疽)的临床研究，上海中医药杂志，1996年第5期)。
技术实现要素：
本发明提供了一种糖尿病足肌腱变性坏死症模型啮齿动物的生产方法，包含给予啮齿动物高脂饲料，保持环境湿度70～100％、环境温度28～38℃，连续28天，注射链脲佐菌素，得糖尿病模型啮齿动物；在所述糖尿病模型啮齿动物的足部制造创面，且于所述足部创面沿肌腱筋膜层避开血管注入金黄色葡萄球菌3～8×106cfu，3天后即得。
在一优选例中，所述的模型啮齿动物为大鼠。
在另一优选例中，所述的环境湿度为85％。
在另一优选例中，所述的环境温度为33℃。
在另一优选例中，所述的生产糖尿病模型啮齿动物的步骤包括：在第29天给予所述啮齿动物禁食，腹腔注射链脲佐菌素，4h后灌胃葡萄糖溶液，72h后第二次腹腔注射链脲佐菌素，第二次注射72h后挑选随机血糖>16.7mmol/l的啮齿动物。
在另一优选例中，所述的足部创面的大小为5×5mm。
在另一优选例中，所述的金黄色葡萄球菌的用量为5×106cfu。
本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
具体实施方式
根据奚九一教授的筋疽理论，本发明采用复合因素建立痰湿郁热证型糖尿病足坏疽(筋疽)动物模型，具体造模思路如下：高脂饮食和环境高湿高温引起大鼠机体痰湿郁热证，链脲佐菌素(strepozotocin)能够选择性损伤胰腺b细胞，引起细胞坏死，致血胰岛素不同程度下降伴血糖升高。胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要病理生理基础和显著特征，导致体内葡萄糖和脂质代谢的紊乱，良好的2型糖尿病动物模型应具备这两方面的特性。
研究表明，高脂饲料喂养可以引起易感型大鼠肥胖和胰岛素抵抗，再加上小剂量多次注射链脲佐菌素造成胰岛β胞轻度损伤，使多数动物产生血糖异常，形成痰湿郁热型ii型糖尿病大鼠模型。本发明先以高脂饲料喂养，环境高湿高热筛出痰湿郁热型肥胖大鼠后，再以小剂量腹腔注射链脲佐菌素2次制作的大鼠模型，表现出肥胖、高血糖伴有高血脂、高胰岛素血症及胰岛素抵抗，与2型糖尿病的特征一致。将痰湿郁热型2型糖尿病大鼠足部制造创面，并使之感染金葡菌，符合筋疽发病局部肿胀期炎性反应的表现，潮红、灼热，中心部分出现皮损坏死，多伴腐败性秽臭气，破溃后脓性液甚少，肿胀不易减退。本发明基于西医糖尿病发病机理和中医基础理论，建立痰湿郁热证型糖尿病足坏疽(筋疽)模型大鼠，弥补了中医筋疽模型的空缺，为糖尿病足中医类研究提供符合中医理论的动物模型。
进而，本发明提供一种痰湿郁热证型糖尿病足坏疽(筋疽)模型的建立方法，包括将wistar大鼠在高温高湿环境下，进行高糖高脂饮食喂养4周，建立痰湿郁热型肥胖大鼠模型。第29天对大鼠建立湿热型糖尿病模型，即将全部大鼠禁食不禁水12h，禁食12h(不超过15h，正常饮水)，腹腔注射(i.p.)链脲佐菌素(streptozocin,stz)，4h后灌胃葡萄糖溶液，72h后第二次i.p.注射stz，第二次注射3天后尾静脉取血，选择经血糖测量仪测量随机血糖>16.7mmol/l的大鼠。利用外科剪进行大鼠足部创面构建，构建足部创面大小约5×5mm，用浓度为1×108cfu/ml的金葡菌悬液注射创面肌肉30～80μl，注射应避开血管。待手术3天后，即为痰湿郁热证型糖尿病足坏疽(筋疽)动物模型。
上述痰湿郁热证型糖尿病足坏疽(筋疽)动物模型的建立方法，具体包括以下步骤：
(1)选取wistar健康雄性大鼠，体重为体重100-120g，预喂养1周。自由饮食饮水。
(2)将合格大鼠进行40％高脂饮食喂养，同时提高空气湿度，升高环境温度(饲养环境潮湿(85±15％)，并每天用取暖器照射4h，温度33±5℃)，4周后选出肥胖大鼠。
(3)第29天，肥胖大鼠禁食不禁水12h，行腹腔注射法进行链脲佐菌素(streptozocin,stz)的注射。stz为现配现用的stz溶液，stz的纯品为结晶粉状物，ph4.2-4.5的柠檬酸缓冲液溶剂。配好的stz溶液应避光冰浴，10min内用完。
(4)注射stz3天后尾静脉取血，选择经血糖测量仪测量随机血糖>16.7mmol/l的大鼠。建立痰湿证糖尿病大鼠模型。
(5)利用外科剪进行大鼠足部创面构建，构建足部创面大小约5×5mm。
(6)用浓度为1×108cfu/ml的金葡菌悬液注射创面，注射应避开血管。具体操作为金黄色葡萄球菌-atcc25923，刮取传代后菌落，磷酸盐缓冲液(pbs液)10倍，梯度稀释后，菌悬液计数。使用分光光度计，设置a值600，吸光度为1，即为1×108/ml。每个创面皮下注射该浓度0.1mlpbs液。
(7)手术3天后，即为痰湿郁热证糖尿病足(筋疽)动物模型。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中所使用的试剂和原料均可通过商业途径购买获得。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例一
1.1动物：60只wistar雄性大鼠，体重100-120g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于上海中医药大学实验动物中心，动物合格证号scxk(沪)2017-0005，实验动物饲养许可证号syxk(沪)2014-0008。室温调整在20-25℃，湿度在45％±5％，12h光照和12h黑暗环境，标准饮食，自由给水，适应7d后，进行试验。
1.2药物：茵陈清筋方是传承上海市名中医奚九一教授“糖尿病足筋疽”理论并依据“肝主筋、脾主肉”理论创新而成，由茵陈、垂盆草等8味中药组成，全方具有清热利湿，解毒清筋的功效，临床上用于“筋疽型”糖尿病足坏疽患者。
1.3菌种：金黄色葡萄球菌，购自中国医学细菌保藏管理中心，菌号atcc25923。
1.4试剂：链脲佐菌霉素，购自美国sigma公司，货号：slbb7534v。糖化血红蛋白(hbalc)试剂盒，血脂指标总胆固醇(tc)，甘油三酯(tg)，低密度脂蛋白(ldl)等，南京建成生物工程研究所；elisa试剂盒：肿瘤坏死因子α(tnf-α)、白细胞介素6(il-6)、c反应蛋白(crp)、糖基化终产物(ages)、羟脯氨酸(hyp)和髓过氧化物酶(mpo)，均购自武汉华美生物工程有限公司(cusabio)。
1.5仪器：万分之一天平bs.124s，德国sartorious仪器公司；台式离心机centrifuge5702r，德国eppendorf公司；高速冷冻离心机centrifuge5415r，德国eppendorf公司；milli-q超纯水系统，millipore中国有限公司；快速血糖测定仪(美国强生onetouch稳豪型血糖仪)；酶标仪powerwavexs，美国biotek仪器有限公司。
2.方法：
2.1动物分组及2型糖尿病模型建立
大鼠称重，随机分为二组，对照组20只，造模组50只。对照组大鼠喂饲普通饲料，造模组饲养环境湿度控制在85±15％，每天用取暖器照射4h，温度33±5℃，以40％高脂饲料饲养4周，自由饮糖水(10％)。4周后，造模组体重与对照组出现明显差异。禁食12h(不超过15h，正常饮水)，腹腔注射stz溶液30mg/kg，注射stz约4h后灌胃50％葡萄糖3ml；72h后第二次注射stz，方法同上；第二次注射72h后测空腹(禁食7h，正常饮水)，随机血糖>16.7mmol/l者即2型糖尿病模型大鼠造模成功，成功率大约80％。对照组注射等量体积缓冲液、灌胃等体积生理盐水。
2.2筋疽模型建立及对照组的相应处理
麻醉造模组大鼠，将大鼠左后肢近足背近趾端剪毛，75％乙醇消毒，切除全层皮肤，范围5×5mm，并于创面沿肌腱筋膜层注射50μl金黄色葡萄球菌悬浮液(1×108cfu/ml)。待手术3天后，造模成功。手术结束后，造模组大鼠随机分为模型组与茵陈清筋方治疗组各20只。
对照组组大鼠也给予与上述造模组同样的麻醉和手术处理，并同样注射50μl金黄色葡萄球菌悬浮液(1×108cfu/ml)。
3.给药治疗
茵陈清筋方治疗组对造模成功的大鼠每日灌胃给药21g生药量/kg体重茵陈清筋方(临床成人用量15倍)，连续给药30天，每天一次。模型组和对照组灌胃等体积生理盐水。
4.观察
4.1一般情况：
—般状况观察每天观察大鼠的一般状况指标，包括精神状态、活动状态、生长体态、被毛、食欲、粪便、尿液，并加以记录。体重及体温测试每天用电子秤秤大鼠的体重。
4.2数据统计与分析数据
均采用平均数±标准差表示，所用统计软件为spss21.0，均值统计分析用单因素方差分析法。p<0.05被认为统计上差异显著，p<0.01被认为是差异极显著。
5.指标检测
5.1血糖指标：每周大鼠尾尖采血，使用快速血糖测定仪测定随机血糖值。实验结束时，检测糖化血红蛋白(hbalc)，比色法，参照试剂盒说明书。
5.2血脂指标：采用生化试剂盒，检测实验结束时，各组大鼠血清中tc，tg，ldl等血脂指标水平，参照试剂盒说明书。
5.4血液炎症指标：采用elisa试剂盒，检测实验结束时，各组大鼠血清中tnf-α、il-6、crp等炎症因子水平，参照试剂盒说明书。
5.5代谢指标：采用elisa试剂盒，检测实验结束时，各组大鼠血清中糖基化终产物(ages)、羟脯氨酸(hyp)、髓过氧化物酶(mpo)水平，参照elisa试剂盒说明书。
5.6观察对比模型组与治疗组伤口愈合情况：分别于造模成功后1周、2周、3周和4周观察造模及给药对伤口愈合的影响，伤口愈合率＝(初始伤口面积-残余面积)/初始伤口面积×100％。
6.结果
6.1—般状况指标观察
实验前所有大鼠精神良好、反应灵敏，活泼好动，被毛柔顺洁白有光泽，饮食欲正常，大便黑硬成形，尿液淡黄。实验后，对照组无明显异常表现，体重日渐增加，创面恢复较快，14天时基本恢复完全。筋疽模型组8只大鼠出现伤口水肿，软组织坏死14-20天仍较严重，30天后基本愈合3只，未愈合15只，死亡2只。茵陈清筋方组在14天时，伤口较模型组基本愈合15只，未愈合5只，死亡0只。
6.2筋疽模型组的白细胞变化及茵陈清筋方的干预作用
表1各组大鼠造模前后白细胞指标变化(10^9/l，
注:与对照组相比，*p<0.05；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表1显示，整个实验过程对照组大鼠白细胞无明显变化。在造模前，各组大鼠白细胞均无明显差异，造模后模型组与治疗组大鼠与对照组比较白细胞升高，(p<0.05)差异具有统计学意义(p<0.05)。
表2各组大鼠治疗后白细胞指标变化10^9/l
注:与对照组相比，*p<0.05；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表2显示，整个实验过程对照组大鼠白细胞无明显变化。治疗后1周、2周、3周和4周模型组与对照组白细胞比较均升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。茵陈清筋方组在治疗后1周、2周与对照组白细胞比较升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。治疗后3周、4周茵陈清筋方组与模型组比较白细胞下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。
6.3筋疽模型组造成的血糖变化及茵陈清筋方的干预作用
表3各组大鼠造模前后血糖变化(mmol/l，
注:与对照组相比，*p<0.05。
表3显示，整个实验过程对照组大鼠血糖水平无明显变化。在造模前，各组大鼠血糖均无明显差异，造模后模型组与治疗组大鼠造模之后血糖较对照组大鼠高(p<0.05)，模型组与治疗组之间无明显差异。
表4各组大鼠治疗后血糖变化(mmol/l，
注:与对照组相比，*p<0.05；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表4显示，整个实验过程对照组大鼠血糖无明显变化。治疗后1周、2周、3周、4周模型组与对照组血糖比较均升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。茵陈清筋方组在治疗后1周、2周与对照组血糖比较升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。治疗后3周、4周茵陈清筋方组与模型组比较血糖下降，差异具有统计学意义(p<0.05)。
6.4筋疽模型组造成的hbalc和tc，tg，ldl等血脂水平的变化及茵陈清筋方的干预作用
表5各组大鼠hbalc和tc，tg，ldl的变化
注:与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表5显示，实验结束时，筋疽模型组hba1c水平较对照组显著升高(p<0.01)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的hba1c水平(p<0.05)；筋疽模型组tc水平较对照组明显升高(p<0.05)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的tc水平(p<0.05)；筋疽模型组tg水平较对照组明显升高(p<0.05)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的tg水平(p<0.05)；筋疽模型组ldl水平较对照组明显升高(p<0.05)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的ldl水平(p<0.05)。
6.5筋疽模型组造成的血清中tnf-α、il-6、crp等炎症因子水平变化及茵陈清筋方的干预作用
表6各组大鼠血清tnf-α、il-6、crp等炎症因子水平变化
注:与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表6显示，实验结束时，筋疽模型组血清中tnf-α水平较对照组明显升高(p<0.05)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的tnf-α水平(p<0.05)；筋疽模型组血清il-6水平较对照组显著升高(p<0.01)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的il-6水平(p<0.05)；筋疽模型组crp水平较对照组显著升高(p<0.01)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的crp水平(p<0.05)。
6.6筋疽模型组血清糖基化终产物(ages)、羟脯氨酸(hyp)、髓过氧化物酶(mpo)等水平变化及茵陈清筋方的干预作用
表7各组大鼠血清ages、hyp和mpo变化
注:与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；治疗组与模型组比较，#p<0.05。
表7显示，实验结束时，筋疽模型组坏疽组织的ages水平较对照组明显升高(p<0.05)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的ages水平(p<0.05)；筋疽模型组坏疽组织的hyp水平较对照组显著升高(p<0.01)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的hyp水平(p<0.05)；筋疽模型组坏疽组织的mpo水平较对照组显著升高(p<0.01)，茵陈清筋方组能够明显降低筋疽模型动物的crp水平(p<0.05)。
6.7筋疽模型组对伤口愈合率的影响及茵陈清筋方的干预作用
表8各组大鼠伤口愈合率的变化(％，
注:与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01；治疗组与模型组比较，#p<0.05，##p<0.01。
表8显示，在手术后第4天，“筋疽”糖尿病足坏疽模型造模成功，模型组大鼠的伤口愈合率显著低于对照组(p<0.01)。造模成功后开始给药，在给药后第1-3周，模型组大鼠的伤口愈合率显著低于对照组(p<0.01)；而给予具有清热利湿，解毒清筋功效，临床上用于“筋疽型”糖尿病足坏疽治疗的名医验方茵陈清筋方的治疗组在给药后第1、2、3周均能较模型组有较好的伤口愈合率(p<0.05)，表明本发明的糖尿病足坏疽模型造模成功，且符合痰湿郁热型证型。
7.小结：造模后，筋疽模型组在白细胞计数、随机血糖值、血红蛋白、血脂、炎症细胞因子、血清糖基化终产物(ages)、羟脯氨酸(hyp)、髓过氧化物酶(mpo)等方面均与对照组存在具有统计学意义的显著差异；创面愈合方面，手术后第4天，模型组大鼠的伤口愈合率显著低于对照组。给药后1～3周，模型组的伤口愈合率显著低于对照组。通过茵陈清筋方的治疗，以上指标均有较好的改善。