一种肠道菌群啮齿动物模型的构建方法与流程

本发明涉及肠道菌群研究技术领域，具体涉及一种肠道菌群啮齿动物模型的构建方法。

背景技术：

正常生理条件下，人体肠道内至少含有1000种不同的菌种，这些菌群所携带的基因数是人体自身基因的100倍以上，宿主与肠道菌群之间互惠互利的动态平衡在维持机体各项功能中发挥着极为重要的作用。随着研究的深入，肠道菌群与机体疾病与健康的关系日益清晰，其对机体免疫系统、循环系统、中枢神经系统和消化系统正常功能的维持均有着不可替代的作用，肠道菌群失调可能会导致和/或加重多种疾病的发生发展，如癌症和阿尔兹海默症等。

当前，肠道菌群是学术界热点之一，但对其研究尚处于探索阶段，很多问题亟待深入研究，例如：肠道菌群影响机体免疫和代谢的途径和机制；肠道菌群中致病菌或致病代谢产物的筛选鉴定；致病菌或致病代谢产物作用机制及与其他因素(如基因型)的交联作用；肠道菌群中有益菌或有益代谢产物的分离鉴定及其作用机制的研究等等。因此，迫切需要一种合适的动物模型来研究肠道菌群与机体相互作用及筛选与鉴定肠道菌群中有益和/或有害成分。

当前，针对清除啮齿类动物肠道微生物的常规方法是使用抗生素，即长期联合使用多种不同抗生素，达到减少肠道微生物的目的。但此方法存在多种不足：(1)使用抗生素效果有限，无法达到清除肠道微生物的目的，仅能降低肠道微生物含量，作用有限；(2)抗生素需长期使用，否则无法达到降低肠道微生物的目的；(3)长期使用抗生素存在耐药性和副作用。因此，亟需构建一种新型快速安全的方法来研究肠道菌群在机体免疫和循环代谢中的作用和意义。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题在于利用抗生素减少肠道微生物所带来的不足，提供一种肠道菌群啮齿动物模型的构建方法。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供一种肠道菌群啮齿动物模型的构建方法，该方法以小鼠为实验对象，灌胃聚乙二醇电解质散剂，即得到用于肠道菌群研究的啮齿类动物模型；所述聚乙二醇电解质散剂的使用方法为每天使用两次，间隔时间为4h。

优选的，所述聚乙二醇电解质散剂的使用量为：经口灌胃1ml/次/只。

优选的，所述聚乙二醇电解质散剂包括以下原料氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、硫酸钠、聚乙二醇制成。

优选的，所述聚乙二醇电解质散剂的制备方法为将0.74g氯化钾、1.68g碳酸氢钠、1.46g氯化钠、5.68g硫酸钠、60g聚乙二醇4000混合后，溶于1000ml双蒸水中。

优选的，在灌胃聚乙二醇电解质散剂前，小鼠禁食固体食物。

优选的，所述小鼠选取2月龄雄性c57bl/6小鼠。

优选的，所述选取的小鼠无特定病原体，体重30±2.0g。

优选的，所述小鼠的饲养方法为将小鼠饲养于屏障环境中，每日所需的食物和水经过灭菌处理，自由进食进水。

优选的，还包括菌群移植模型的验证步骤：通过qrt-pcr方法检测小鼠肠道菌群量和优势菌群量，用以验证菌群移植模型是否建立成功。

优选的，还包括检测建模方法副作用的步骤：通过elisa法检测小鼠体内白介素-1β和白介素-6含量，通过化学比色法测定小鼠体内乳酸脱氢酶含量，以检测建模方法的副作用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明建模时间短，从开始建模到模型建立仅需8小时；

(2)本发明较常规方法效果更为显著，可重复性好；

(3)本发明的建模方法无副作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后肠道组织解剖图；其中a为对照组；b为模型组；

图2为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后单位质量肠道组织菌群16srdna基因v4区qrt-pcr绝对定量结果；

图3为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后单位质量肠道组织拟杆菌门qrt-pcr绝对定量结果；

图4为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后单位质量肠道组织肠球菌属qrt-pcr绝对定量结果；

图5为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后血清il-6水平；

图6为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后血清il-1β水平；

图7为本发明实施例1中两组小鼠建模完成后血清ldh水平。

具体实施方式

以下将结合说明书附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。

实施例1

(一)肠道菌群研究的啮齿类动物模型的建立方法：

(1)以2月龄c57bl/6小鼠为实验动物，雄性，10只，体重30±2.0g，随机分为两组：对照组、模型组(各5只)；饲养在屏障环境中，饲喂基础维持饲料；每日所需的食物和水经过灭菌处理，自由进食进水；

对照组：小鼠灌胃生理盐水，每日2次，1ml/次/只，间隔4小时，饲喂前均禁食固体食物2小时；

模型组：小鼠灌胃聚乙二醇电解质散剂，每日2次，1ml/次/只，间隔4小时，饲喂前均禁食固体食物2小时；

(2)聚乙二醇电解质散剂的配制：所使用的聚乙二醇电解质散剂的制备方法为将氯化钾0.74g，碳酸氢钠1.68g，氯化钠1.46g，硫酸钠5.68g，聚乙二醇400060g混合后溶于1000ml双蒸水中，充分混匀。

(二)评价和分析所构建的肠道菌群研究的菌群移植模型：

(1)qrt-pcr法(quantitativereal-timepcr)检测三组c57bl/6小鼠肠道组织内菌群含量和组成的变化，定量分析聚乙二醇电解质散清除肠道微生物的效果：

①设计最大限度包含微生物16srdna特异性引物，包括16srrnav4区和乳酸杆菌(lactobacillus)，多形拟杆菌(bacteroides)，粪肠球菌(enterococcus)，螺旋菌科(lachnospiraceae)，肉毒杆菌(clostridium)。引物序列如下：

②第二次灌胃聚乙二醇电解质散后2小时处死小鼠，采集实验动物近肛门处直肠组织(长度为1cm)，称重，使用qiagen公司dna提取试剂盒提取组织dna，按照试剂盒操作说明书进行，具体步骤如下：

a.将组织样本100-300mg置于2ml离心管中，并置于冰上；

b.样品中加入800μl试剂cd1，持续震荡30min以上，直至样品完全混匀；

c.15,000g离心样品1min，移取上清液至新的2ml离心管；

d.加入200μl试剂cd2，轻微混匀；

e.15,000g离心样品1min，移取上清液700μl至新的2ml离心管；

f.加入600μlcd3，轻微混匀；

g.小心移取650μl上述液体至离心柱中，并将离心柱放置于收集管中，12,000rpm离心1min，弃去滤液；

h.重复步骤7，直至所有上清液均过滤；

i.将离心柱转移至新的收集管中，加入500μl试剂ea，15,000g离心样品1min，弃去滤液；

j.加入500μl试剂cd5，15,000g离心样品1min，弃去滤液；

k.将离心柱转移至新的收集管中，15,000g离心样品1min，弃去滤液；

l.将离心柱转移至新的收集管中，加入100μl试剂cd6，摇匀，直至试剂cd6完全覆盖离心柱的膜；

m.15,000g离心样品1min，收集滤液；

n.使用nanodrop分光光度计检测提取的dna浓度与纯度，并置于-80℃冰箱保存。

③qrt-pcr法检测实验动物肠道组织内微生物含量：采用美国roche公司96实时荧光定量pcr系统检测实验小鼠肠道组织内微生物总量与不同种类微生物含量：

25μl扩增体系由12.5μlsybrmix(promega)，2μl引物，5μl模板dna引物和5.5μlddh2o组成。荧光定量pcr反应条件为：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火，延伸30s，执行50个循环，每个循环结束后收集荧光信号。

(2)处死动物后，采集实验动物外周血，离心后取血清，使用elisa法检测血清中白介素-1β(il-1β)和白介素-6(il-6)含量，并使用化学比色法检测血清中乳酸脱氢酶(ldh)含量，以检测该建模方法副作用；其中elisa法和化学比色法均为现有技术。

(三)实验结果

通过分析对照组、模型组实验动物肠道菌群总量与不同种类微生物含量的变化，分析肠道微生物清除程度和建模是否成功：

(1)如图1所示，处死实验动物后解剖实验小鼠，与对照组相比，模型组小鼠肠道内容物几乎完全被清除；

(2)对照组、模型组中小鼠肠道菌群总量与菌群丰富度：

①肠道菌群总量：如图2所示，qrt-pcr结果表明，与对照组实验小鼠相比，模型组实验小鼠单位质量肠道组织内微生物总量显著降低；

②菌群丰富度：如图3和图4所示，属于优势菌的拟杆菌门与肠球菌属均被清除；

③il-6，il-1β和ldh检测结果：如图5、图6和图7所示，三组实验动物血清il-6，il-1β和ldh检测结果均显示无统计学差异。

综上，本发明实施例中模型组实验小鼠相比较对照组实验小鼠肠道微生物清除率达94.96％，表明本发明可有效清除啮齿类动物肠道微生物，且无副作用。本发明简单易行安全有效，可重复性好。本发明建立的啮齿类动物肠道菌群清除模型是肠道菌群研究不可缺少的动物模型，在研究肠道菌群在环境污染物暴露和疾病发生发展过程中的作用和意义具有重要的使用价值。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，与本发明构思无实质性差异的各种工艺方案均在本发明的保护范围内。