一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法与流程

本发明涉及生物技术技术领域，更具体地，涉及一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法。

背景技术：

尼罗罗非鱼属于丽鱼科，具有适应性强，繁殖力高，食性广、杂，抗病力强和肉味鲜美等特点，已成为世界性的主要养殖鱼类。目前尼罗罗非鱼已是我国重要的养殖鱼类，也是我国重要的出口创汇水产品之一，特别是在广东、广西、海南、福建等地，尼罗罗非鱼养殖、加工和贸易产业发达。罗非鱼在我国产量由1990年的10万吨，增长到2012年的155万吨，占世界罗非鱼产量的30.4％。

罗非鱼雄鱼比雌鱼生长快50％，雌性尼罗罗非鱼约四个月即达到性成熟，在养殖期能多次繁殖，从而在池塘里产生大量小罗非鱼。而小罗非鱼竞争溶氧、营养物质和空间，并在年终不能长成商品规格，大大影响了罗非鱼养殖的产量和效益，因此，商业性大规模生产全雄鱼是国内外尼罗罗非鱼繁殖的目标。

生产全雄鱼可以通过手工挑选，激素诱导，种间杂交等方式，但都有局限性。手工挑选工作量大，准确性差；激素诱导存在食品和生态安全性问题已逐渐被淘汰；种间杂交对于亲本纯度要求高，雄性率一般为90～95％，仍有相当数量的雌鱼。三系配套技术，也称为Genetically Male Tilapia(GMT)，是一种先进的罗非鱼全雄鱼苗生产技术，其平均雄性率大于98％。GMT技术大量生产的关键是在建立三系时快速有效地区分正常雄鱼(XY♂)和超雄鱼(YY♂)以及正常雌鱼(XX♀)和雌性转化鱼(XY♀)，虽然各种基因型的鱼在外形上没有差异，需要逐一观察生殖孔，费时费力，近年来，筛选尼罗罗非鱼基因组中与性别决定基因连锁的雌雄性别特异性DNA分子标记，借助Marker-Assisted Selection(MAS)技术就能有效地解决这个问题，MAS使得GMT的商业化生产成为可能。MAS-GMT技术的第一步需诱导XY个体性别逆转即培育雌性转化鱼(XY♀)，需要使用雌激素，仍然不能完全避免激素污染。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法。

本发明的第一个目的是提供一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法。

本发明的第二个目的是提供一种快速培育雄罗非鱼的方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

现有技术中报导尼罗罗非鱼天然有XY雌鱼的现象，本发明通过实验室繁殖验证，即确立尼罗罗非鱼天然XY雌鱼可以用于培育YY超雄鱼，且培育的YY超雄鱼可以用于罗非鱼的遗传性别控制。

发明人发现来自中国8个地方来源的尼罗罗非鱼群体中，其中7个群体都具有天然的XY雌鱼，发明人认为由于受到环境因素的影响，例如温度影响使得XY个体性别逆转。本研究首先从尼罗罗非鱼群体中鉴定天然的XY雌鱼，将其与遗传性别稳定品系的XY雄鱼交配，杂交F1代获得了YY超雄鱼，对YY超雄罗非鱼进行测交验证，获得了高雄(雄性比例大于95％)或全雄后代。

因此本发明要保护一种YY超雄尼罗罗非鱼的培育方法，筛选天然XY雌鱼，将XY雌鱼与正常XY雄鱼交配，获得YY超雄鱼(图1)。

优选地，包括以下步骤：

S1.选择存在天然XY雌性尼罗罗非鱼的群体；

S2.检测尼罗罗非鱼遗传性别；

S3.通过外生殖器的形态判断表型性别，最终筛选出XY雌鱼；

S4.将步骤S3筛选出的XY雌鱼和具有稳定遗传性别的尼罗罗非鱼品系的XY雄鱼交配，再检测尼罗罗非鱼遗传性，筛选出子代中的YY超雄鱼；

优选地，所述通过外生殖器的形态判断表型性别的具体方法为：用一只手握住鱼，另外一只手轻压鱼体腹部，肛门扩张，生殖孔(也就是肉眼能看清的肛门后的孔)，能随之扩张的是雌鱼，不能扩张的是雄鱼。

更优选地，检测尼罗罗非鱼遗传性别使用核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示引物。

正向引物F：5′-ATGGCTCCGAGACCTTGACTG-3′(SEQ ID NO：1)；

反向引物R：5′-CAGAAATGTAGACGCCCAGGTAT-3′(SEQ ID NO：2)。

更优选地，检测尼罗罗非鱼遗传性别的方法为：提取待测样本基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示引物进行PCR扩增，将PCR扩增产进行电泳检测，分析电泳结果，根据测序结果判断尼罗罗非鱼的遗传性别，判断标准为：PCR扩增产物大小为1422bp一条带，则待测样本为XX基因型；PCR扩增产物为两条带，且大小分别为1422和982bp，则待测样本为XY基因型；PCR扩增产物为982bp一条带，则待测样本为YY基因型。

更优选地，所述PCR扩增的体系为2×PCR mix Buffer 12.5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 10.5μL，共25μL。

更优选地，PCR扩增的程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃90s，37个循环；72℃10min延伸。

本发明还要求保护一种快速培育雄罗非鱼的方法，将筛选出的YY超雄鱼培育至性成熟后，与尼罗罗非鱼的XX个体繁殖。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明首次从尼罗罗非鱼群体筛选天然XY雌鱼，并将其与遗传性别稳定群体的XY雄鱼交配，获得了YY超雄鱼，获得的YY超雄罗非鱼可以用于罗非鱼遗传性别控制，可以快速获得YY超雄罗非鱼。本发明的方法在天然群体筛选XY雌鱼，适用于实验室或水产养殖企业开展罗非鱼遗传性别控制。本发明培育YY超雄罗非鱼的方法可用于对不同群体的尼罗罗非鱼性别控制，简化了MAS-GMT技术操作流程，对推广尼罗罗非鱼性别控制方法具有重要意义。

附图说明

图1一种新的培养YY超雄罗非鱼的技术路线：通过MAS技术鉴定尼罗罗非鱼天然XY雌鱼和雄鱼，将它们交配，获得YY超雄鱼，可以用于罗非鱼遗传性别控制；MAS：分子标记辅助选育；GMT：遗传雄性罗非鱼。

图2为鉴定本发明尼罗罗非鱼天然XY雌鱼，日本群体XX、XY和YY个体经过测交验证，XX个体只能扩增一条1422bp的X特异条带，YY个体只能扩增一条982bp的Y特异条带，而XY个体具有X和Y特异的条带，在吴川群体的雌鱼部分只具有X特异的条带，也有部分同时具有X和Y特异条带；M：DNA标记；*：天然XY雌鱼；-：阴性对照。

图3为鉴定本发明吴川群体雌鱼和日本群体雄鱼杂交亲代、子代遗传性别，吴川群体雌鱼亲本分别为XY(上)和XX(下)型，日本群体雄鱼亲本均为XY型，XY和XY型交配，后代具有XX、XY和YY 3种基因型，XX和XY交配，后代只具有XX和XY 2种基因型。M：DNA标记。-：阴性对照。

图4为鉴定本发明培育YY超雄鱼回交和测交亲代、子代遗传性别，YY超雄罗非鱼与母本(XY)回交，后代XY和YY各一半，YY超雄鱼与XX基因型交配，后代全为XY型，M：DNA标记；-：阴性对照。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一对用于检测尼罗罗非鱼性别基因型的引物

设计一对引物(SEQ ID NO：1：5′-ATGGCTCCGAGACCTTGACTG-3′和SEQ ID NO：2：5′-CAGAAATGTAGACGCCCAGGTAT-3′)，对吴川群体和日本群体基因组DNA进行PCR扩增和电泳分析。

PCR扩增的体系为2×PCR mix Buffer 12.5μL，10μmol/L正反向引物各0.5μL，基因组DNA 1μL，ddH2O 10.5μL，共25μL。

PCR扩增的程序：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃90s，37个循环；72℃10min延伸。

PCR扩增产物大小为1422bp一条带，则待测样本为XX基因型；PCR扩增产物为两条带，且大小分别为1422和982bp，则待测样本为XY基因型；PCR扩增产物为982bp一条带，则待测样本为YY基因型。

实施例2一种检测尼罗罗非鱼性别的方法

利用实施例1的引物检测尼罗罗非鱼的基因型，当待测样本为XX基因型为雌鱼；当则待测样本为YY基因型为超雄鱼；当则待测样本为XY基因型，如果用一只手握住鱼，另外一只手轻压鱼体腹部，肛门扩张，生殖孔(也就是肉眼能看清的肛门后的孔)，能随之扩张的是XY雌鱼，不能扩张的是XY雄鱼。

实施例3一种快速培育YY超雄罗非鱼的方法

1、尾鳍基因组DNA的提取

取吴川和日本群体雌性个体(包括XY雌鱼和XX雌鱼)，剪取尾鳍，放入100％无水乙醇–20℃冰箱保存，用于提取基因组DNA。利用基因组提取试剂盒提取样品DNA，然后进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，基因组20kb条带清晰可见，用Nanodrop 2000超微量核酸蛋白测定仪(Thermo Scientific，美国)检测RNA样品的OD值和浓度，OD260/280值均在1.80～2.00之间。

2、PCR扩增筛选XY雌鱼和雄鱼

利用实施例1的方法检测吴川和日本群体尼罗罗非鱼性别基因型。

结果显示，吴川群体具有天然XY雌鱼，而日本群体不存在XY雌鱼(图2)。

3、天然XY雌鱼用于YY超雄鱼的培育

如表1所示，将上一步检测得到的吴川群体的XY雌鱼与日本群体XY雄鱼交配(表1交配编号1)，后代中雄性比率明显比XX雌鱼与XY交配后代高(交配编号2)。利用特异性引物进行筛选(SEQ ID NO：1～2)，在XY和XY交配后代中鉴定出四分之一的YY超雄鱼个体(图3)。

4、培育YY超雄鱼用于罗非鱼性别控制

将培育的YY超雄鱼与母本回交，后代全雄，且具有一半XY和YY个体，后代全雄。将培育的YY超雄鱼与F1中XX个体、F0XX个体和日本群体XX个体交配，后代全部为XY，雄性率高于97％(表1和图4)。最终确定本发明可以用于尼罗罗非鱼的遗传性别控制。

表1交配子代表型性别比例：

注：各个样本遗传性别都经过验证。

序列表

<110> 广东海洋大学

西南大学

<120> 一种快速培育YY超雄尼罗罗非鱼的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccga gaccttgact g 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagaaatgta gacgcccagg tat 23