一种培育高结实性异源四倍体玉米的方法与流程

本发明属于玉米远缘杂交育种方法领域，具体涉及一种培育高结实性异源四倍体玉米的方法。
背景技术：
：玉米是粮饲兼用作物，也是重要的工业原料。随着人口增加和人们生活水平的提高、以及畜牧业的发展，对玉米的需求也急剧增加。提高单产是提高玉米产量的主要途径，但是由于现有玉米种质存在遗传基础狭窄等问题，限制了突破性玉米品种的培育。因此，拓宽和创制新的玉米种质资源是培育高产品种的关键。四倍体多年生类玉米(或称为大刍草，zeaperennisl.)和摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)等玉米近缘野生属种在长期的进化过程中形成了各种不同的优良特性。大刍草具有耐冻、耐冷、耐湿和抗病等特点，如对玉米大、小斑病有很强的抗性，还具有抗逆性强和适应性广等优点。摩擦禾具有良好的抗病虫性，如抗玉米根螟和玉米螠管蚜，抗锈病、抗玉米大斑病；摩擦禾还具有抗寒、抗旱、耐盐碱等优良特性；此外，摩擦禾还具有籽粒营养丰富，蛋白质含量高，消化率高等优点。玉米近缘野生属种的这些优良特性可用于拓宽玉米的种质基础，但是由于亲缘关系较远，存在生殖隔离等原因，它们和玉米杂交后存在不能结实、杂交后代不育或者育性极低等问题，使玉米近缘野生属种的有益基因难以导入到玉米材料中。mtf-1(tripsazeacreammaizet.，2n＝76)是四川农业大学以引自美国的同源四倍体玉米(zeamaysl.，4n＝40)和四倍体鸭茅状摩擦禾(或称指状摩擦禾，tripsacumdactyloidesl.，2n＝72)之间的属间杂种f1为母本，以四倍体多年生类玉米(zeaperennis，2n＝40)为父本杂交而获得的玉米异源六倍体；mtf-1的染色体数为76，是一个包含全套玉米染色体组(20条)、鸭茅状摩擦禾染色体组(36条)和四倍体多年生类玉米染色体组(20条)的属间杂种，是一个自然界不存在的新物种。mtf-1具有雌性可育的特性，以玉米(zeamaysl.)、大刍草(zeaperennisl.)或摩擦禾(tripsacumdactyloidesl.)为父本给mtf-1授粉都可产生结实后代。利用此特性，以mtf-1为桥梁材料，可将大刍草或摩擦禾中的有益基因转移到玉米中。但是由于mtf-1存在多年生、分蘖多等野生特性，其应用受到较大限制。目前，mtf-1主要用于培育多年生、分蘖多且无性繁殖的饲草玉米品种(cn103609428a，cn103548674a)，难以直接在玉米育种中应用。专利申请《一种培育近异源四倍体玉米材料的方法》(cn107148910a)公开了一种利用mtf-1培育近异源四倍体玉米的方法，利用该方法培育的近异源四倍体玉米材料花粉育性高，为将玉米近缘属种中的有益基因导入到玉米材料中创造了很好的条件。但是利用该近异源四倍体玉米杂交产生的后代存在生长不协调、结实率低、甚至花期不遇而无法自交结实，无法保证后代数量和有效保存有益种质等问题。因此，后代结实率低已成为将玉米近缘属种优良性状向玉米材料中转移或在玉米育种中应用的主要障碍。技术实现要素：针对目前与玉米近异源四倍体玉米杂交所得杂交后代存在结实率低等问题，本发明目的在于提出一种培育高结实性异源四倍体玉米的方法，用以提高异源四倍体玉米及其后代的结实率，为将玉米近缘野生属种中的优良基因导入到玉米材料，进而为扩大玉米种质的遗传基础提供一种有效手段。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种培育高结实性异源四倍体玉米的方法，包括如下步骤：(1)、在吐丝散粉期，以bf7(zeamays，2n＝38～41)为母本，以同源四倍体玉米(zeamays，2n＝40)为父本进行杂交，成熟时收获种子，得f1代；(2)、种植f1代，在三叶期开始至抽雄期前取f1代植株根尖，用基因组原位杂交方法进行染色体数目和染色体组成鉴定；在抽雄期用碘-碘化钾染色法对f1代材料进行花粉育性检测；选择f1代中染色体总数为38～42条，其中玉米染色体数为26～32条，四倍体多年生类玉米染色体数为6～14条，玉米和四倍体多年生类玉米染色体之间形成的易位染色体0～8条，且花粉育性大于60％的植株进行自交，成熟时收获果穗，统计结实率，并选取结实率大于40％的果穗，得f2代；(3)、种植f2代，在三叶期开始至抽雄期前取根尖，采用基因组原位杂交的方法对根尖染色体数目和染色体组成进行鉴定；在抽雄期用碘-碘化钾染色法对f2代植株的花粉育性进行检测；选择染色体总数为40～42条，其中含有玉米染色体31～36条、四倍体多年生玉米染色体2～8条、易位染色体数为0～6条、花期协调且花粉育性大于70％的植株进行自交，成熟时收获果穗；统计结实率，并选取实率大于50％的的果穗，得f3代；(4)、种植f3代，按照步骤(3)所述基因组原位杂交方法对根尖染色体数和染色体组成进行鉴定，并在抽雄期用碘-碘化钾染色法对花粉育性进行检测；选择染色体总数为40～42条，其中含玉米染色体35～38条、四倍体多年生类玉米染色体1～4条、易位染色体1～6条、花期协调且花粉育性大于80％的植株进行自交；成熟时收获果穗，统计结实率，选择结实率大于60％的果穗，保留种子；即为高结实性异源四倍体玉米。上述方法步骤(1)中所述的bf7(zeamays)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其保藏编号为：cgmccno.18176。所述bf7是四川农业大学以自育的玉米异源六倍体mtf-1(tripsazeacreammaizet.；2n＝76)为母本，以二倍体玉米mo17为父本杂交后获得一株编号为bc1-31的可育后代，再将其自交7代获得的玉米-大刍草异源多倍体。bf7的染色体总数为38-41条，其中含有玉米染色体24-28条，含有四倍体多年生类玉米染色体14-16条，玉米和大刍草的易位染色体0-3条，无摩擦禾染色体。bf7为一年生，植株似玉米，花粉育性较高，雌穗可育，自交能够获得少量的种子；bf7生长缓慢且自交结实率低，无法直接利用。上述方法步骤(1)中所述的同源四倍体玉米是指将二倍体玉米直接加倍获得的同源四倍体玉米。如用秋水仙素等将二倍体玉米自交系mo17加倍，即可得染色体总数为40条的同源四倍体玉米。所述同源四倍体玉米的加倍前的出发品种可以是自交系、杂交种、农家种或综合种等。所述的同源四倍体玉米可以是twf9、p1-vv或p1-mm。twf9、p1-vv或p1-mm引自cimmyt(墨西哥小麦玉米改良中心)，均可从公开途径得到。上述方法步骤(2)、(3)或(4)中所述的碘-碘化钾染色法请参照苏月贵硕士论文(四川农业大学硕士论文，2009)。上述方法步骤(3)或(4)中所述的基因组原位杂交方法参照tangq等2005年公开的方法(tangq等.cropsci,2005,45:717-721)。与现有技术相比，本发明具有的优点和有益技术效果：(1)本发明方法以同源四倍体玉米为父本，其与玉米异源多倍体bf7的杂交后代中玉米染色体数所占比例高，克服了以前近异源四倍体玉米花粉可育性高，但结实率低的缺点，本发明方法培育的异源四倍体玉米的花粉育性最高可达80％以上、结实率可达60％以上，因此，本发明方法培育的异源四倍体玉米不仅花粉育性高，而且后代的结实率高，为玉米染色体与四倍体多年生类玉米染色体之间的充分交换重组，将四倍体多年生类玉米的优良基因转移到玉米材料中、进而为扩大玉米遗传种质基础提供了一个有效途径。(2)本发明方法培育的异源四倍体玉米，克服了玉米与四倍体多年生类玉米之间存在的远缘杂交障碍，以其为桥梁材料，使四倍体多年生类玉米优良基因导入玉米变得很简单，使其在育种中大规模应用成为可能。(3)本发明方法将异源多倍化和高结实性相结合，能得到结实率60％以上的异源多倍体玉米材料，克服了多倍体玉米结实率低的缺点，为多倍体玉米育种利用奠定了基础；(4)本发明育种方法所得到的种子大而饱满，结实率高，且后代性状趋于稳定，为利用种子固定多倍化和远缘杂交优势提供了一种宝贵的育种材料。(5)利用本发明方法培育的异源四倍体玉米的品质好，如含油率和维生素a含量远高于其亲本。生物保藏：bf7(zeamays)是申请人四川农业大学自育的玉米异源多倍体玉米材料，于2019年7月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；其保藏编号为：cgmccno.18176。附图说明图1为实施例1步骤(2)中的f1的花粉育性检测显微照片。图2为实施例1步骤(2)中的f1双色基因组原位杂交显微照片(2n＝40＝2mp+8zp+30mz)。图3为实施例1步骤(3)中的f2的花粉育性检测显微照片。图4为实施例1步骤(3)中的f2双色基因组原位杂交显微照片(2n＝41＝4mp+2zp+35mz)。图5为实施例1步骤(4)中的f3的花粉育性检测显微照片。图6为实施例1步骤(4)中的f3双色基因组原位杂交显微照片(2n＝40＝4mp+1zp+35mz)。图7为实施例1步骤(2)中果穗照片。图8为实施例1步骤(3)中果穗照片。图9为实施例1步骤(4)中果穗照片。图10为实施例2中bc1-5材料的双色基因组原位杂交显微照片。图11为实施例2中bc1-5材料的果穗照片。具体实施方式实施例1本发明高结实性异源四倍体玉米的选育按照如下步骤进行：(1)、2016年6月，在四川农业大学温江农场以bf7(保藏编号为：cgmccno.18176，2n＝38～41)为母本，以p1-vv(引自cimmyt)为父本进行杂交，成熟时收获种子，获得f1代。(2)、2016年9月，从-20℃冰箱中取出f1代种子，在四川农业大学西双版纳育种基地种植f1代；2016年9月中旬至10月中旬取f1代植株根尖，用基因组原位杂交方法(参见tangq等.cropsci,2005,45:717-721)进行染色体数目和染色体组成鉴定，选择f1代材料中染色体总数为38～42条，其中玉米染色体数(以下简称为：mz)为26～32条，四倍体多年生类玉米染色体数(以下简称为zp)为6～14条，且玉米和四倍体多年生类玉米染色体之间发生部分易位，形成0～8条易位染色体(以下简称mp)。2016年11月用碘-碘化钾染色法(参照苏月贵，四川农业大学硕士论文，2009)对f1代材料进行花粉育性检测，选择花粉育性高于60％的材料进行自交，成熟时收获果穗，统计结实率，选取结实率大于40％的果穗，得f2代。其中编号为sz20-3的材料花粉育性为85.96％(见图1)；sz20-3材料的染色体数目为40条，其中含有玉米染色体27条，四倍体多年生类玉米染色体6条，玉米-大刍草易位染色体7条(见图2)；通过农艺性状观察，发现其植株生长协调，且自交结实率高达73.68％(见图7)。(3)、2017年3月，在四川农业大学温江农场种植f2代，对f2代农艺性状观察，发现f2代中大部分植株表现为栽培玉米型、生长协调、植株高大、主茎粗壮，f2代中各农艺性状还处于分离阶段，但较亲本具有很明显的杂种优势；2017年5月取根尖，用基因组原位杂交方法进行染色体数目和染色体组成的鉴定，选择染色体数目为40～42条，其中mz为31～36条，zp为2～8条，易位染色体0～6条(见图4，染色体总数为40条，其中7mp+2zp+31mz)，花粉育性为大于70％(见图3)的植株自交，于2017年6月至7月自交授粉21株，并于2017年8月下旬至9月上旬收获种子，统计结实率，选取结实率大于50％的果穗(见图8)，得f3代。(4)、2017年9月，在四川农业大学西双版纳制种基地种植f3代，通过对f3材料的农艺性状观察，发现f3代植株大多为栽培玉米型，茎秆粗壮、生长迅速，雄穗分支数多，散粉量大。取f3代根尖，按照步骤(2)中所述基因组原位杂交方法对f3代材料进行染色体数目和组成的鉴定；选择染色体数目为40～42条，其中含有mz35～38条，zp1～4条，玉米-大刍草易位染色体1～6条(见图6，染色体总数为40条，其中4mp+1zp+35mz)，花粉育性大于80％的材料进行自交(见图5)。在2017年11月至12月自交授粉64株，并于2018年1月下旬至2月上旬收获种子，选取结实率大于60％的果穗(见图9)，得f4代，即为高结实性异源四倍体玉米。实施例2本发明高结实性异源四倍体玉米的应用(1)2018年3月，在四川农业大学温江农场种植实施例1中得到的高结实性异源四倍体玉米材料30株，同期种植30株玉米自交系mo17。2018年5月，以实施例1中所得的高结实性异源四倍体玉米材料为母本，以mo17为父本进行杂交，杂交均能结实；2018年6月收获，得杂交f1代，f1代籽粒形态大而饱满。(2)2018年9月，在四川农业大学西双版纳育种基地种植步骤(1)所得f1代种子；2018年11月以f1为母本，以mo17为父本回交，于2019年2月收获，得bc1代种子。(3)2019年3月，于四川农业大学温江农场种植步骤(2)中得到的bc1代种子；观察发现植株似玉米，生长迅速，无分蘖，茎秆粗壮，叶片长；取bc1代植株根尖用原位杂交鉴定，发现后代染色体总数为19～30条，均含有四倍体多年生类玉米染色体或染色体片段，2019年5月用碘化钾法对所有材料花粉进行检测，结果其花粉育性平均为80.56％；2019年6月将所有材料进行自交授粉。2019年9月收获种子，统计结实率，结果bc1代自交结实率最高可达85.33％；其中材料编号为bc1-5材料的染色体总数为23条，含有18条玉米染色体和5条玉米-大刍草易位染色体(见图10)，且结实率为67.83％(见图11)。上述结果说明本发明高结实性异源四倍体玉米花粉育性高，易与二倍体玉米杂交，经过与mo17两次杂交后形成了bc1，后代中成功导入了四倍体多年生类玉米的遗传物质，且其自交结实性高。因此，本发明获得的高结实性异源四倍体玉米材料，能够作为将近缘野生种优良基因转移到玉米的桥梁材料。实施例3本发明方法培育的不同异源四倍体玉米的产量对比试验(1)按照实施例1所述方法，bf7为母本，分别以同源四倍体玉米p1-mm或twf9(均引自cimmyt)为父本杂交，并培育出2个家系的高结实率异源四倍体玉米。(2)2018年4月，在四川农业大学温江农场以双株双行、三次重复种植步骤(1)中培育的2个家系的高结实性异源四倍体玉米各56株。(3)2018年6月，统计育性可知，2个家系的花粉育性平均分别为77.6％和75.4％，将步骤中(2)所述2家系的高结实性异源四倍体玉米自交。(4)2018年8月，收获的种子大而饱满，对其进行考种发现，2个家系的平均结实率分别为64.2％和60.4％，千粒重平均为357.90g和325.03g；而同期种植的改良前原材料bf7和2种同源四倍体(p1-mm和twf9)结实率分别为47.6％、3.86％和32.76％，千粒重平均为309.45g、234.37g和263.10g(见表1)。表1本发明不同异源四倍体玉米的育性和结实率等的对比试验结果(5)统计每株产量发现，2个家系的高结实异源四倍体的每株产量分别为230.06g和115.77g；而普通二倍体mo17只有59.44g(见表2)。表2异源四倍体玉米对比产量试验结果上述结果说明本发明高结实性异源四倍体玉米花粉育性高，自交可得结实率高的果穗，且所得籽粒饱满，千粒重高，单株产量高。因此，本发明获得的高结实性异源四倍体玉米材料，克服了多倍体玉米远缘杂交时结实率低的障碍，为远缘杂交和多倍化的实际生产利用提供了一种有效途径。实施例4本发明高结实性异源四倍体玉米的品质检测试验(1)2018年6月，选择实施例1中收获的果穗中籽粒饱满且结实率高于50％的材料(2)利用近红外光谱仪对步骤(1)中筛选的种子进行蛋白含量、淀粉含量和油分含量的测定。表3含油量、蛋白质含量、淀粉含量对比实验结果材料油分(％)蛋白质(％)淀粉(％)bf7×p1-vv6.7511.9969.10bf74.5912.4568.87mo174.0513.0568.88结果(见表3)所得到的异源四倍体玉米籽粒油分平均达到6.75％，蛋白质平均11.99％，淀粉含量平均69.1％；而普通二倍体玉米自交系mo17和bf7油分含量为4.05％、4.59％，蛋白质含量为13.05％、12.45％，淀粉含量为68.88％、68.87％；且发现异源四倍体玉米中一个材料的维生素a含量高达18μg/100g，而普通二倍体玉米mo17和其他异源四倍体玉米维生素a平均含量均低于3.3μg/100g。以上结果说明，本发明高结实性异源四倍体玉米的油分含量高，且营养价值高，能够为高油分、高营养玉米育种提供新材料，为多倍体玉米种子的实际生产提供新的途径。当前第1页12