一种团头鲂的耐低氧育种方法与流程

本发明属于水产育种领域，涉及一种团头鲂的育种方法。
背景技术：
：团头鲂(megalobramaamblycephala，yih)，鲤形目(cypriniformes)，鲤科(cyprinidae)，鲌亚科(cultrinae)，鲂属(megalobrama)，俗称武昌鱼、鳊鱼，属鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属，原产于鄱阳湖、梁子湖等长江中游的一些大、中型湖泊中，是我国重要的草食性经济鱼类之一，2016年全国养殖总产量超过83万吨。与草鱼、鲤、鲫等大宗淡水养殖鱼类品种相比，团头鲂不耐低氧，对养殖水体的溶氧变化比较敏感。低氧容易使团头鲂养殖群体“浮头”，引发摄食量下降、消化不良、抗病力和免疫力下降等问题，并造成生长速度下降，引发死亡，限制了团头鲂产能的提升。上海海洋大学开展团头鲂种质研究、育种研究和推广有30多年的历史。1985年起，我校连续引进湖北淤泥湖原种亲鱼，针对生长性状和体型，采用群体选育，历经15年，1999年获得遗传性状稳定的选育第六代(f6)—即团头鲂“浦江1号”(生长速度提高了29％，体长/体高比保持在2.1～2.2，鳞被珠光闪亮)。2000年，经全国水产原、良种审定委员会审定，农业部审核，团头鲂“浦江1号”被公布为适宜推广的水产良种(品种登记号：gs01001-2000)。迄今，团头鲂“浦江1号”良种已使用了近20年，为了团头鲂养殖业的可持续发展，有必要进行良种更新。比如团头鲂“浦江1号”的选育主要针对生长性状和体型，耐低氧性能的选育就没有开展过。团头鲂“浦江1号”良种不同的家系在低氧胁迫期间生长会产生明显的分化，这表明团头鲂“浦江1号”良种的耐低氧能力还有待进一步提高，在团头鲂不同的养殖或野生群体中开展进一步的耐低氧选育，将可能培育出耐低氧新品种。技术实现要素：本发明的团头鲂良种是在耐低氧能力较强的鄱阳湖优良野生群体基础上，通过连续低氧胁迫养殖条件下，开展群体或家系选育，并辅以雌核发育技术，经过10年连续5代选育而成。育种项目起始之时，经耐低氧性能测试、生长对比试验和微卫星遗传多样性分析，确定以从鄱阳湖引进的优良野生团头鲂群体作为育种核心群体。第一年从鄱阳湖野生群体中选择优良亲本建立育种奠基群体f0代，针对耐低氧和生长性状，开始了选育工作，并在第三年通过群体选育获得f1代。第五年通过群体选育获得f2子代。第六年，再以选育f2代亲本为基础，进行同塘低氧胁迫养殖，经低氧胁迫、群体选育，获得耐低氧f2代亲本。第七年，借助vie(visibleimplantelastomertag)荧光标记，再经累代低氧胁迫，运用数量遗传学最佳线性无偏预测(blup)分析和家系选育，获得耐低氧的f3代。第九年，借助vie标记技术，运用blup分析和家系选育，辅以雌核发育等综合育种技术，获得耐低氧的f4代。第十一年，借助vie标记技术，运用blup分析和家系选育，获得耐低氧的f5代。与对照“浦江1号”相比，团头鲂“f4代”鱼种阶段的体型失衡(loe，25℃)的关键溶氧值由1.03下降到0.90以下，耐低氧能力平均提高14.4％以上。根据2个主要区域共4试验点连续的生产试验对比结果，随着耐低氧能力的提升，团头鲂新品种在池塘高密度养殖条件下的生长速度也获得显著提升，一龄鱼种阶段的生长速度比“浦江1号”提高了18.4％以上，二龄成鱼阶段提高了17.9％以上，一龄和二龄阶段的成活率累计提高了12.8％以上。成鱼规格整齐，所显示的上述各性状具有遗传稳定性。亲本来源：以鄱阳湖野生团头鲂为基础群体，共1498尾1龄鱼，2007年10月、11月分2次引自江西省都昌县鄱阳湖湖区，活鱼车全程充纯氧运输到上海海洋大学。选育(或培育)过程：2007年10月-11月，引进鄱阳湖1龄野生团头鲂1498尾。2008年，经生长对比试验、低氧性能测定和微卫星遗传多样性分析，选择256尾2龄优良亲本建立育种奠基群体f0代，选留率为17.1％。2009年，经生长对比试验，选择106尾(雌50，雄56)生长速度快、亲缘关系较远的3龄f0代优良亲本，繁殖获得f1代。开展群体选育，1龄阶段的选择强度为1％。2010年，以生长为目标，继续f1代2龄阶段的群体选育，选择强度为9％。2011年，选择100尾(雌50，雄50)生长速度快、亲缘关系较远的3龄f1代优良亲本，繁殖获得f2代。开展群体选育，1龄阶段的选择强度为1％。2012年，以生长为目标，继续f2代2龄阶段的群体选育，选择强度为9％。以f2代选留的3456尾2龄鱼为基础，经2次低氧胁迫，获得耐低氧f2代亲本1030尾，选留率29.8％。当年累计选择强度为2.7％。2013年，耐低氧f2代3龄个体体重排序最大的98尾亲本(雌50，雄48)繁殖出f3代，经1龄阶段的低氧胁迫养殖、blup家系选育，获得耐低氧f3代。1龄阶段低氧胁迫下的blup家系选择强度为1％。2014年，继续耐低氧f3代2龄阶段的家系选育，blup家系选择的强度为9％。2015年，选择优良耐低氧f3代3龄雌鱼92尾、雄鱼56尾，分别建立自交家系f4代。经1龄阶段的低氧胁迫养殖、blup家系选育，获得耐低氧f4代。1龄阶段低氧胁迫下的blup家系选择强度为1％。2016年，继续耐低氧f4代2龄阶段的家系选育，blup家系选择的强度为9％。2017年，选择优良耐低氧f4代3龄雌鱼386尾、雄鱼365尾，扩繁出f5代，经生产性对比试验及中试验证，其性能优良，生长速度比f4代提高7.8％。另外，在f5代中筛选出性状优良的5个家系，其生长速度比f4代提高15.7％，在f5代选育中有显著的进步。本发明提供了一种团头鲂的育种方法，所述育种方法包括如下步骤：s1：选取亲缘关系远、耐低氧性能好的团头鲂群体作为团头鲂f0代亲本群体；s2：对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的选择群体；然后对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f0代亲本群体2龄阶段的选择群体，即团头鲂f1代群体；s3：对所述团头鲂f1代群体1龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f1代群体1龄阶段的选择群体；然后对所述团头鲂f1代本群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f1代群体2龄阶段的选择群体；对所述团头鲂f1代群体2龄阶段的选择群体进行第一次低氧胁迫和第二次低氧胁迫，得到团头鲂f2代群体；s4：从团头鲂f2代群体中构建多个家系群体；对所述多个家系群体分别进行第三次低氧胁迫和第四次低氧胁迫，选择生长速度快的家系群体，得到团头鲂f3代群体；s5：对所述团头鲂f3代亲本群体1龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f3代亲本群体1龄阶段的选择群体；然后对所述团头鲂f3代亲本群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育，选取生长性能好的团头鲂群体，得到团头鲂f3代亲本群体2龄阶段的选择群体，即团头鲂f4代群体。在一些实施方式中，所述育种方法还包括如下步骤：s6：团头鲂f4代群体进行扩繁培育，选择生长性能好的个体，得到团头鲂f5代群体。在一些实施方式中，在步骤s1中，亲缘关系远的选取标准为：选取10-20个团头鲂的等位基因，所述等位基因的期望杂合度大于或等于0.6，优选大于或等于0.763；所述等位基因的多态信息含量大于或等于0.6，优选大于或等于0.678；优选，所述等位基因选自：ttf1、ttf2、ttf3、ttf4、ttf5、ttf6、ttf7、ttf8、ttf9、ttf10、mam02、mam03、mam25、est13、est23、est37、est43、est66；耐低氧性能好的选取标准为：体型失衡的关键溶氧值小于或等于1.08mg/l，优选小于或等于1.03mg/l；优选，在步骤s1中的选留率小于或等于20％；更优选选留率小于或等于17.1％。在一些实施方式中，在步骤s2中，对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于0.8g·d-1，优选大于或等0.87g·d-1；选择强度小于等于0.5％，优选选择强度小于等于1％；优选，对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于3.0g·d-1，优选大于或等于3.23g·d-1；优选选择强度小于等于9％。在一些实施方式中，在步骤s3中，对所述团头鲂f1代群体1龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于0.8g·d-1，优选大于或等0.94g·d-1；选择强度小于等于0.5％，优选选择强度小于等于1％；优选，对所述团头鲂f1代群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于2.9g·d-1，优选大于或等于3.40g·d-1；选择强度小于等于5％，优选选择强度小于等于9％；优选，所述第一次低氧胁迫是将所述团头鲂生存的水环境平均溶解氧值降低至低于1.0mg/l，更优选0.9-1.0mg/l；优选，所述第二次低氧胁迫是将所述团头鲂生存的水环境平均溶解氧值降低至低于0.8mg/l，更优选0.6-0.8mg/l。在一些实施方式中，在步骤s4中，所述多个家系群体为10-30个家系群体；所述第三次低氧胁迫为所述团头鲂生存的水环境平均溶解氧值降低至1.8～2.5mg/l，优选1.97～2.38mg/l，优选，所述第三次低氧胁迫的持续时间2-6个月；所述第四次次低氧胁迫为所述团头鲂生存的水环境平均溶解氧值降低至3.0～5.0mg/l，优选3.98～4.38mg/l，优选，所述第三次低氧胁迫的持续时间2-6个月；选择生长速度快的家系群体择压力小于或等于20％，优选10-20％。在一些实施方式中，在步骤s5中，对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于0.9g·d-1，优选大于或等1.12g·d-1；选择强度小于等于0.5％，优选选择强度小于等于1％；优选，对所述团头鲂f0代亲本群体1龄阶段的选择群体2龄阶段的群体选育中，选取生长性能好的团头鲂群体的选择标准为：体质量绝对增长率大于或等于3.0g·d-1，优选大于或等于3.69g·d-1；优选选择强度小于等于9％。在一些实施方式中，在步骤s6中，生长性能好的标准为1龄平均日增重大于0.6g，优选大于0.608g；优选选择强度小于等于0.9％。在一些实施方式中，f0代亲本群体来自鄱阳湖。主要性状1、耐低氧能力显著提高本发明的团头鲂新品种f4代系在耐低氧性能优良的鄱阳湖野生群体基础上，经多代耐低氧胁迫下的群体、家系选育选育而成。池塘高密度生产性中试结果显示：本发明的团头鲂新品种鱼种阶段的耐低氧能力相对与“浦江1号”平均提高14.4％以上，其体型失衡(loe，25℃)的关键溶氧值由1.03下降到0.90以下。2、生长速度获得提升由于耐低氧能力的提升，本发明的团头鲂新品种f4代在池塘高密度养殖条件下的生长速度也获得显著提升。一龄鱼种阶段的生长速度比“浦江1号”提高了18.4％以上，二龄成鱼阶段提高了17.9％以上，成鱼规格整齐，变异系数较小，遗传稳定。3、养殖成活率提高高密度生产性中试结果显示：本发明的团头鲂新品种f4代一龄鱼种和二龄成鱼阶段的累计成活率比“浦江1号”平均提高了12.8％以上。主要优点：本发明的团头鲂新品种在提高群体耐低氧能力的同时，其在高密度池塘养殖条件下的生长性能和成活率也获得了显著提高，可作为优良的团头鲂养殖新品种在高密度养殖条件下(如池塘或工厂化设施)加以推广利用。附图说明图1为本发明团头鲂新品种的选育路线图。图2为团头鲂耐低氧f3家系群体vie荧光标记示例。其中，眼眶粉红色标记；头部眼间红色标记；:尾鳍两侧绿色标记；眼眶红色和白色荧光标记；头部眼间绿色荧光标记；尾鳍两侧绿色荧光标记。白线为1cm。图3团头鲂“f4”外部形态图。图4“f4”团头鲂的核型图。图5位点est13的扩增结果。图6位点est37的扩增结果。图7位点ttf4的扩增结果。图8“f4”、“浦江1号”鳃组织石蜡切片光镜和扫描电镜图。图9f3代低氧胁迫流程图。具体实施方式为了更好的解释本发明的技术方案，下面结合附图详细介绍本发明的实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。1.试验基础1.1试验地点本发明中团头鲂新品种的选育工作主要在上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心进行。同时，在上海海洋大学青浦鱼类育种试验站进行育种材料备份和异地生长对比小试。种质检验委托农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心测定。遗传学实验在上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室进行。1.2亲鱼繁殖方法1.2.1催产所有世代的催产均采用一针注射法：性腺发育良好的雌鱼按照促黄体生成素释放激素类似物lrh-a5μg+绒毛膜促性腺激素hcg800～1000iu/kg注射，雄鱼剂量减半。在水温25℃时，晚上20～22时注射激素，次日清晨即可产卵。1.2.2授精和孵化所有世代的均采用人工授精：即人工挤取精、卵混合后，用羽毛搅拌1～2分钟，然后将受精卵倒入制备好的滑石粉水混合液中脱粘(用1kg滑石粉加5kg水配制)，搅拌3分钟后脱粘完成，经滤洗后倒入孵化桶中流水孵化。2.育种技术路线本发明所育团头鲂新品种的选育路线参见图1所示。较为具体地，分为如下步骤：f0代到f1选留率为17.1％。f1代到f2选留率为0.9％。f2代到f3选留率为0.27％。f3代到f4选留率为0.9％。f4代到f5选留率为0.9％。2.1选育的基础群体f0代以鄱阳湖耐低氧性能优良的野生团头鲂群体(1龄鱼1498尾，2007年年底分2次引自江西省都昌县鄱阳湖湖区，活鱼车全程充纯氧运输到上海海洋大学)为选育群体。2008年，经生长对比试验、低氧性能测定和微卫星遗传多样性分析，选择256尾2龄优良亲本建立育种奠基群体f0代，选留率为17.1％。生长对比试验、低氧性能测定结果参见表1。微卫星遗传多样性分析参见表2和表3。鱼类体型失衡的关键溶氧值(loecrit)可对鱼类缺氧窒息点进行精确测量获得，loecrit值越小代表个体的耐低氧能力越高。表1显示，在个体规格相同、水温(25℃)相同的情况下，江西鄱阳湖群体(pyh)的体型失衡的loecrit值显著低于团头鲂“浦江1号”，表明该群体发生窒息的溶氧值较低，耐低氧能力比较突出。表1不同团头鲂群体的耐低氧能力分析注：*表示同龄两个群体间存在极显著性差异(p<0.01).采用微卫星技术分析了引进的江西鄱阳湖(pyh)和团头鲂“浦江1号”(pj)群体遗传多样性(表2)。其中，典型的三个等位基因的扩增引物和扩增条件参见表3。结果显示，江西鄱阳湖群体的等位基因数、期望杂合度和多态信息含量分别为5.7、0.763和0.678，遗传多样性在最丰富。另外，发现团头鲂“浦江1号”的等位基因数、期望杂合度和多态信息含量分别为4.6、0.546和0.566，遗传纯合度较高，需要用较大的群体进行传代，以避免出现近交。表2基于微卫星标记的团头鲂群体遗传多样性指数表3微卫星引物序列及其反应条件2.2f1代选育2009年，以鄱阳湖野生团头鲂群体为基础，经耐低氧能力测试、生长对比试验和微卫星遗传多样性分析，选择106尾(雌50，雄56)生长速度快、亲缘关系较远的3龄f0代优良亲本，繁殖获得f1代。开展群体选育，1龄阶段的选择强度为1％。2010年，以生长为目标，继续f1代2龄阶段的群体选育，选择强度为9％。f1代总选留率为万分之九。2011年5月上旬，开展f1代亲本群体(选育组)和未经选育的基础群体(对照组)的人工繁殖(选育组和对照组亲鱼的催产、人工授精、受精卵孵化、放苗的整个过程均同步进行)，待鱼苗能够正常摄食时转移到水泥池(～24m2)进行分池养殖。7月上旬，待鱼苗长到10g左右时，随机选取体质健壮且体质量相近的个体，分别剪左腹鳍条和右腹鳍条作标记，进行水泥池(～24m2)同池养殖。每池每种鱼各放60尾，各设置4个平行试验组。一龄试验鱼经过100d(7～10月)的饲养后，测量其体重增长率。2012年1月上旬，试验鱼经补剪鳍条后放回～1.5亩土池同池喂养，二龄试验鱼经过200d(5～11月)的饲养后，测量其二龄阶段的体重增长率。数据测量及分析按下式计算体质量绝对增长率。式(1)中，w1和w2分别为时间t1与t2时的体质量。用电子天平测量鱼的体质量(精确到0.1g)，利用excel软件计算各平行组生长数据的平均值和标准差，用spss软件进行差异显著性分析。表4一、二龄团头鲂f1选育组与对照组体质量增长率比较注：*表示同龄两个群体间存在显著性差异(p<0.01).表4为一、二龄团头鲂选育组、对照组的生长速度比较结果。从表4中可以看出，选育组一龄鱼的体质量绝对增长率为0.87g/d，对照组为0.77g/d，选育组比对照组高12.9％。选育组二龄鱼的体质量绝对增长率为3.23g/d，对照组为2.91g/d，选育组比对照组高11.0％。同龄的选育组和对照组两个群体间的体质量绝对增长率存在显著差异(p<0.01)。2.3耐低氧f2代选育2011年，以f1代选留的100尾(雌50，雄50)生长快、亲缘关系较远的三龄亲本，繁殖获得f2代。并开展一龄阶段的群体选育。当年从34.5万尾一龄鱼种中选留3456尾生长快、体型好的个体为后备亲本，一龄阶段的选择压力约为1％。2012年，选育f2代转运到上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心(浦东滨海)，继续二龄阶段群体选育。溶氧do值设置的下限为团头鲂窒息点(约0.8～1.0mg/l，根据温度稍有差异)，持续时间为2小时，频次为2次(7月和9月各一次)(见表5)。以f2代选留的3456尾二龄成鱼为基础，通过降低池塘(4.5亩)水位和气温急升(2012年7月，do约1.0mg/l)或急降(2012年9月，溶氧do约0.8mg/l)造成的低氧胁迫，淘汰缺氧死亡的二龄成鱼2426尾，存活1030尾，选择压力为29.8％。当年年底，从缺氧存活的1030尾二龄成鱼中选择98尾(雌50，雄48)生长速度快、亲缘关系较远的f2代成鱼为繁殖亲本，选择压力为9.5％。二龄阶段的累计选择压力为2.8％表5团头鲂耐低氧f2代二龄选育情况统计表6为一、二龄团头鲂选育组、对照组的生长速度比较结果。从表6中可以看出，选育组一龄鱼的体质量绝对增长率为0.94g/d，对照组为0.78g/d，选育组比对照组高20.5％。选育组二龄鱼的体质量绝对增长率为3.40g/d，对照组为2.84g/d，选育组比对照组高19.7％。同龄的选育组和对照组两个群体间的体质量绝对增长率存在显著差异(p<0.01)。表6一、二龄团头鲂f2选育组与对照组体质量增长率比较注：*表示同龄两个群体间存在显著性差异(p<0.01).2.3耐低氧f3代选育概况2013年，建立f3家系并开展一龄阶段的选育。以选留的耐低氧50尾雌鱼和48尾雄鱼作为亲本，建立24个f3混合家系群体(2♀×2♂群体22个、2♀×3♂群体2个)，共100个f3家系。2013年5月中旬，进行24个混合家系群体人工繁殖(各家系群体亲鱼的催产、人工授精、受精卵孵化、放苗的整个过程均同步进行)，待能够正常摄食时，每个群体随机保留3000～3500尾鱼苗，分别转移到24个室内水泥池(～16m2)中进行正常溶氧(do＝5.97～9.36mg/l，均值约为7.0mg/l)条件下的分池养殖。经过20d的培育，6月上旬，各家系群体用特定孔径的分级筛子选留最大的400尾(规格4-5cm,～1.5g)，放于原水泥池中继续进行为期约6个月的低氧胁迫养殖，低氧胁迫水体平均溶解氧为2.3±0.5mg/l(在窒息点上约1.5mg/l，团头鲂能够摄食生长)。低氧胁迫养殖在全封闭的室内车间水泥池中进行。室内车间面积约为900m2，共有水泥池32个，车间四周墙体为砖混结构，车间顶采用2暗1透的采光板均匀覆盖进行密封并保证足够透光，在密闭条件下各水泥池水体溶氧下降迅速，为保证各家系群体的养殖水体在不同阶段维持较一致的低氧水平，调整充气量和充气时间或者关闭，并定期添加新水(换水量<10％)，试验期间每天对各池子的溶氧值及水质指标进行定时监测。在2013年6月～2013年12月低氧胁迫养殖期间，针对各家系群体，共进行2次生长性能指标测量。2014年4月底筛选出5个快速生长家系群体以及6个生长较快的家系群体，一龄阶段共选留11个家系群体。进一步从筛选留下来的11家系群体中挑取生长较快的774尾个体。一龄阶段的选择压力约为1％。具体步骤如图9所示。2014年，二龄阶段的家系选育。结合不同荧光颜色和标记位置对选留的774尾个体进行vie(visibleimplantelastomertag)荧光标记，然后放入大塘(4.5亩)进行养殖。至年底(约18月龄时)进行生长指标的测量与分析。最终存活720尾，平均体质量达到717.8g，大小均匀，体长/体高平均值2.16，体型较好。经微卫星(ssr)亲子鉴定，存活个体归属于24个家系。进一步从中选择个体大、亲缘关系较远的142尾(雌92，雄50)f3代成鱼为繁殖亲本，选择压力约为20％。2.3.1生长性状统计团头鲂耐低氧f3代孵化出苗20d后，进行为期6个月的室内车间低氧胁迫养殖。各家系群体在3个不同生长阶段的体质量、体长和体高平均值统计见表7。测量尾数为50～60尾，与常氧下养殖的选育系后代为对照。结果显示：团头鲂耐低氧f3代各家系群体在低氧胁迫下的生长速率极显著变慢(p<0.001)，并且在各家系群体间存在显著差异(p<0.01)，有些家系群体(a19、a20、a3、a2和a18)在低氧胁迫条件下的生长较快。表7团头鲂选育f3代各家系群体不同生长阶段的增重率注：*,p<0.01；**,p<0.001。2.3.2各家系生长和耐低氧性状的相关分析通过增重率(养殖期间增加的重量/实际养殖时间，agrw)评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为5个，分别为a19、a20、a3、a2和a18，较快生长家系群体8个，分别为a17、a6、a4、a26、a27、a5、a25和a28，其余11个均为一般生长家系群体；依据agrw-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为7个，分别为a17、a16、a4、a2、a3、a20和a25，较快生长家系群体6个，分别为a12、a24、a19、a22、a27和a10，其余11个均为一般生长家系群体；依据agrw-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为3个，分别为a5、a23和a6，较快生长家系群体8个，分别为a24、a7、a8、a28、a21、a19、a11和a27，其余13个均为一般生长家系群体(表8)。通过增长率(养殖期间增加的体长/实际养殖时间，agrl)评价各家系群体生长性能，依据agrl-1评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为3个，分别为a19、a3和a20，较快生长家系群体9个，分别为a2、a18、a17、a6、a26、a4、a25、a28和a7，其余12个均为一般生长家系群体；依据agrl-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为a18、a24、a25和a27，较快生长家系群体8个，分别为a20、a19、a2、a22、a17、a4、a28和a12，其余12个均为一般生长家系群体；依据agrl-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为a5、a6、a8和a7，较快生长家系群体6个，分别为a24、a28、a11、a23、a27和a21，其余14个均为一般生长家系群体。通过增高率(养殖期间增加的体高/实际养殖时间，agrh)评价各家系群体生长性能，依据agrh-1评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为a19、a3、a2和a20，较快生长家系群体9个，分别为a18、a17、a4、a6、a26、a12、a25、a27和a5，其余11个均为一般生长家系群体；依据agrh-2评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为a7、a12、a2和a18，较快生长家系群体5个，分别为a4、a17、a25、a20和a3，其余15个均为一般生长家系群体；依据agrh-3评价各家系群体生长性能，快速生长家系群体数为4个，分别为a5、a21、a24和a23，较快生长家系群体6个，分别为a28、a6、a27、a8、a11和a25，其余14个均为一般生长家系群体。根据各家系群体在上述9个指标分类中的累积和叠加情况，可以得知a2、a3、a18、a19和a20等5个家系群体生长快速，a4、a6、a17、a25、a27、a28等6个家系群体生长较快，其余13家系群体生长一般。表8各家系群体的月增重量(g/月)、月增长量(cm/月)与月增高量(cm/月)注：阴影标注为各指标中快速增长的家系。各家系群体生长和耐低氧性状间主要相关性：(1)3次测量的生长指标中，每一次的agrw、agrh和agrl两两之间(如agrw-1、agrh-1和agrl-1两两之间)都存在0.01水平上的显著正相关性，仅有agrh-2和agrl-2的正相关不显著；(2)agrw-1、agrh-1和agrl-1分别与agrw-2、agrh-2和agrl-2都正相关；但agrw-1/-2、agrh-1/-2和agrl-1/-2都分别与agrw-3、agrh-3和agrl-3负相关；(3)耐低氧性状uht分别与生长性能指标agrw-1和agrh-1在0.05水平上显著正相关，与agrl-1负相关性不显著，uht与agrw-2在0.01水平正相关，分别与agrh-2和agrl-2不显著正、负相关，但uht分别与agrw-3、agrh-3和agrl-3存在0.01水平正相关、不显著正相关及负相关(表9)。表9生长与耐低氧性状相关分析注：相关分析采用spearman的rho和斯皮尔曼相关系数(rs)。**.在0.01水平(双侧)上显著相关；*.在0.05水平(双侧)上显著相关。2.3.3各家系群体2龄生长跟踪评价通过综合比较生长指标和低氧性状，共筛选出5个快速生长家系群体(a2、a3、a18、a19和a20)以及6个生长较快的家系群体(a4、a6、a17、a25、a27、a28)，共11个家系群体。对筛选留下来的11家系群体中挑取生长较快的774尾个体，结合不同荧光颜色和标记位置对每个家系群体分别进行vie(visibleimplantelastomertag)荧光标记(如图2所示)。vie标记之后，2龄阶段入大塘养殖。至18月龄时对各家系群体存活个体的生长指标进行测量与统计分析。最终存活720尾，平均存活率达92.99％，经微卫星(ssr)亲子鉴定，存活个体归属于24个家系(表10)。存活个体平均体质量达到717.8g，体长/体高平均值2.16，体型较好。表10各家系群体18月龄生长指标统计结果表11为一、二龄团头鲂选育组、f2对照组的生长速度比较结果。从表11中可以看出，选育组一龄鱼的体质量绝对增长率为1.03g/d，对照组为0.80g/d，选育组比对照组高28.8％。选育组二龄鱼的体质量绝对增长率为3.56g/d，对照组为2.80g/d，选育组比对照组高27.1％。同龄的选育组和对照组两个群体间的体质量绝对增长率存在显著差异(p<0.01)。表11一、二龄团头鲂f3选育组与对照组体质量增长率比较注：*表示同龄两个群体间存在显著性差异(p<0.01).2.4耐低氧f4代选育概况2015年，建立f4家系并开展一龄阶段的选育。以选留的耐低氧f3代92尾雌鱼和50尾雄鱼作为亲本，建立24个f4混合家系群体(4♀×2♂群体22个、2♀×3♂群体2个)，共188个f4家系。5月中旬，进行24个混合家系群体人工繁殖，待能够正常摄食时，每个群体随机保留约10000尾鱼苗，分别转移到24个室内水泥池(～16m2)中进行正常溶氧(do～7.0mg/l)条件下的分池养殖。经过20d的培育，6月上旬，各家系群体过分级筛选留最大的800尾，放于水泥池中继续进行为期约6个月的室内车间低氧胁迫养殖(具体实施过程同f3代选育)。低氧胁迫养殖期间，针对各家系群体，共进行3次生长性能指标测量。一龄阶段，共选留在低氧胁迫下生长较快的12个家系群体，再从中选留6500尾生长快速的个体，一龄阶段的选择压力约为2.7％。2016年，二龄阶段的家系选育。选留的6500尾个体进行vie荧光标记，然后放入大塘(4.5亩)进行养殖。至年底(约18月龄时)存活6080尾，从中选取生长快、遗传多样性高的760尾雌鱼和760尾雄鱼，选择压力约为25％，建立耐低氧f4代亲本。经微卫星(ssr)亲子鉴定，存活个体归属于24个家系。2.4.1团头鲂f4群体与基础群体的生长性能比较2015年5月上旬，开展f4代亲本群体(选育组)和未经选育的基础群体(对照组)的人工繁殖，并进行一龄和二龄阶段的生长对比试验，具体试验方法与f1代选育相同的方法进行。从表12中可以看出，选育组一龄鱼的体质量绝对增长率为1.12g/d，对照组为0.81g/d，选育组比对照组高38.3％。选育组二龄鱼的体质量绝对增长率为3.69g/d，对照组为2.75g/d，选育组比对照组高34.2％。同龄的选育组和对照组两个群体间的体质量绝对增长率存在显著差异(p<0.01)。表12一、二龄团头鲂f4选育组与对照组体质量增长率比较注：*表示同龄两个群体间存在显著性差异(p<0.01).2.5耐低氧f5代选育概况对团头鲂f4代进行常规方法扩繁，选择强度为0.9％，得到f5代，结果参见表13，从中可以看出平均日增重得到明显提高。表13一、二龄“浦江2号”选育系(f5代)与基础对照组体质量增长率比较注：*表示同龄两个群体间存在显著性差异(p<0.01).如表13所述，低氧胁迫下的选育在成活率方面效果显著，经过4代选育，f4代选育组相比基础对照的成活率提升了27.0％。在未经低氧胁迫的f1代，f1/f0成活率提升了仅3.3％；但在低氧胁迫的f2代，f2/f1成活率提升了8.0％；在低氧胁迫的f3代，f3/f2成活率提升了9.1％；在低氧胁迫的f4代，f4/f3成活率提升了6.6％。低氧胁迫对选育系的成活率每代提高了2-3倍，提升效果显著。表14团头鲂f1～f4选育组各世代与对照组成活率比较注：f1代未经低氧胁迫选育，f2-f4经过低氧胁迫选育。不同字母代表存在显著性差异(p<0.01)如表14所述，选育组相比基础对照的体重变异系数逐代减少显著。选育组f4代一、二龄的体重变异系数(c.v)为8.82％和8.43％，而基础对照组的变异系数为20.20.85％和20.31％，选育系体重变异系数减少显著(表15)。表15团头鲂f1～f4选育组各世代与对照组变异系数(c.v)比较3.“团头鲂f4代”的种质特征3.1、形态特征体高而侧扁，呈菱形。头小，吻钝圆，口端位，口裂较宽，上、下颌曲度小、角质薄而窄，上颌角质呈三角形。体侧鳞片基部浅色，两侧灰黑色，在体侧形成数行深浅相交的纵纹。腹部自腹鳍至肛门间有皮质棱。背鳍末根不分枝，鳍条为硬刺，硬刺粗短。胸鳍较短，末端不到或仅达腹鳍基部，上眶骨略呈三角形。腹鳍腹位。臀鳍较长，起点距腹鳍基部距离较距尾鳍基部距离短。尾柄宽短、尾鳍叉形。团头鲂“f4代”的外部形态见图3。3.2、“团头鲂f4代”的遗传学特性3.2.1体细胞染色体数及核型体细胞染色体数：2n＝48。核型公式：24m+20sm+4st。染色体臂数(nf)：92。“f4代”团头鲂染色体组型见图4。3.2.2分子遗传学特征随机取“f4代”团头鲂的尾鳍，提取基因组dna，微卫星引物序列及其反应条件见表3。“f4代”团头鲂的位点est13、est37和ttf4扩增结果标准图谱见图5-7。扩增结果显示，位点est13、est37和ttf4的不同片段为“f4”团头鲂群体的代表性谱带。3.3、团头鲂“f4代”的耐低氧能力测定3.3.1、耐低氧loe测定(1)“f4”团头鲂低氧胁迫试验：团头鲂在缸中常温(25℃)、常氧暂养1周后开始低氧胁迫。通过控制空气泵和氮气的进气大小调节使水体溶解氧浓度在4小时内减半，继续降低溶氧4小时内再减半，之后每半小时降低0.5。记录团头鲂失去平衡的时间。(2)实验设计：以“浦江1号”做对照，每组实验处理12尾鱼。(3)计算公式：po2i：倒数第二梯度溶氧溶度；ti：实验鱼失去平衡所用时间；tii：时间间隔30min；po2ii：溶氧下降梯度。体型失衡(loe)的关键溶氧值差异对团头鲂“f4代”及“浦江1号”的loe进行测定，统计结果见表16。团头鲂“f4代”鱼种阶段的体型失衡(loe)的关键溶氧值显著下降。在水温10℃时，由0.72下降到0.54，耐低氧能力提高了25.0％；在水温25℃时，由1.03下降到0.89，耐低氧能力提高了15.7％；在水温30℃时，由1.41下降到1.28，耐低氧能力提高了10.2％。表16“团头鲂f4代”的体型失衡(loe)的关键溶氧值(mean±s.d.)**p<0.013.3.2、低氧胁迫下鳃电镜扫描(1)取样：团头鲂禁食暂养3天后，取3尾鱼的鳃作为对照组样品，同时降低并维持溶氧为1.5±0.5mgo2l-1，对剩下的鱼进行低氧胁迫4天。(2)样品制备与电镜扫描：取下鳃之后做好观察面标记，用1×pbs中漂洗数次后置2.5％戊二醛中4℃固定3h；用1×pbs漂洗3次，每次15min；用1％锇酸4℃固定2h；用1×pbs漂洗15min；用50％、70％、80％乙醇依次脱水，各15min；用80％乙醇脱水过夜；第二天，用90％、95％乙醇脱水，各15min；换醋酸异戊酯15min或叔丁醇15min；自然干燥、冷冻干燥或二氧化碳真空干燥；镀膜，电镜扫描。低氧胁迫下鳃电镜扫描差异团头鲂“f4代”及“浦江1号”在低氧胁迫下的鳃组织石蜡切片结果见图8。结果显示，在低氧条件下(do＝2.0mg/l)，“团头鲂f4代和“浦江1号”团头鲂呼吸面积均不断增加，到第4d时，“团头鲂f4代”呼吸面积为3.40×104μm2，显著小于“浦江1号”的4.23×104μm2(表17)；到第7d时，“团头鲂f4代”呼吸面积为2.77×104μm2，显著小于“浦江1号”的3.39×104μm2(表17)。这表明在相同的低氧胁迫条件下，“团头鲂f4代”不需要增加过多的呼吸面积来应付低氧，剩余鳃的呼吸容量可助“团头鲂f4代”团头鲂应付更低的溶氧环境，这从一个侧面说明团头鲂“f4代”耐低氧能力显著提高。表17“团头鲂f4代”的鳃呼吸表面积测定结果(mean±s.d.)鳃小片表面积。单位：104μm23.3.3、组织石蜡切片观察(1)制作组织切片：将固定的团头鲂鳃、肝脏组织经过梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片染色。将组织置于75％乙醇中，脱水1h；将组织取出，表面残余液体吸去，放在80％乙醇中，脱水处理2h；将组织从80％乙醇中取出，吸去液体，放在95％乙醇中，脱水处理1h；取出组织，置于100％乙醇中，脱水处理40min，洗2次；将组织从乙醇中取出，吸去残液，置于50％乙醇+50％二甲苯混合液中，30min；组织取出，置于二甲苯中，15min；50％二甲苯和50％石蜡混合液，60℃烘箱，组织置于其中30min；组织置于石蜡中，60℃烘箱，透蜡处理1.5h，2次；包埋、修模、切片，切片厚度为4～5μm。保存于37℃恒温箱中。(2)苏木精-伊红(he)染色：1)将切片置于二甲苯中，脱蜡20min，2次；2)取出后，置于50％二甲苯和50％乙醇中，浸泡10min；3)将切片依次经过100％乙醇、100％乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇和灭菌超纯水中，各3min；4)苏木素染色30min，流动的自来水缓慢冲洗20min；5)1％盐酸水溶液中分化数秒褪色，置于灭菌超纯水中1min，然后用0.5％氨水中1min返蓝复染，然后再用灭菌超纯水洗1min；6)将切片分别置于70％乙醇、80％乙醇和95％乙醇中，脱水处理2min；7)置于伊红染液中，30s；8)切片置于95％乙醇中，洗去余色，再用100％乙醇，洗2次，每次2min；9)50％二甲苯和50％乙醇中，3min；10)切片置于二甲苯中，2次，每次3min；11)用中性树胶进行封片。3.3.4“浦江2号”选育系的耐低氧相关基因富集从团头鲂“浦江2号”(f5代)和“浦江1号”对照的转录组数据库中进行耐低氧基因的高通量筛选，甄别出脯氨酸羟化酶(egln2)基因等10个低氧差异表达基因。egln2基因在鱼类低氧应答因子(hif)信号通路中，通过修饰泛素化后的hif1a使其降解而调节体内氧平衡。课题组研究发现egln2基因上存在2个完全连锁的多态snp位点(pic>0.5)，即t397c397和t715g715，可组成单倍型ⅰ(c397g715)和单倍型ⅱ(t397t715)。单倍型ⅰ在对照群体(团头鲂“浦江1号”)中出现的频率为83.5％，在团头鲂“浦江2号”中的出现频率为27.5％，差异极显著(p<0.01)；单倍型ⅱ在对照群体中出现的频率为16.5％，在团头鲂“浦江2号”中的出现频率为72.5％，差异极显著(p<0.01)。表18“浦江2号”选育系egln2基因差异snp位点的基因型分析单倍型ⅰ和ⅱ可组合成3种双倍型，即双倍ⅰ型(c397c397g715g715)、双倍ⅱ型(t397t397t715t715)和双倍ⅲ型(t397c397t715g715)。“浦江2号”群体该基因以双倍ⅱ型基因型为主，出现频率为76.5％，双倍i和iii型基因型为23.5％(表18)。而“浦江1号”群体则以双倍i和iii型基因型为主，出现频率达87.5％，而双倍ⅱ型基因型仅为出现频率为12.5％(表18)。这些结果表明，经过在耐低氧能力较强的鄱阳湖群体中开展低氧胁迫下的连续选育，“浦江2号”选育系耐低氧相关的重要基因或相关基因型得以富集，其耐低氧能力获得了进一步的提升。3.4可数性状背鳍鳍式：d.iii,7。臀鳍鳍式：a.iii,24～29。侧线鳞数：50-60。上侧线鳞数：11-13。下侧线鳞数：8-10。第一鳃弓外侧鳃耙数：12-16。3.5可量性状团头鲂“f4代”鱼种和成鱼可量性状比例值见表19。表19可量性状比例值3.6内部构造特征鳔：无鳔管，鳔分三室，中室最大，后室最小。下咽齿：下咽齿三行。齿式为2·4·4(5)/5(4)·4·2。脊椎骨数：脊椎骨总数为4+38～39。腹膜：腹膜为浅黑色。3.7生态特征食性：为草食性，兼杂食性。适宜水温：摄食水温为10℃-40℃，最适摄食水温为22℃-30℃。生长水温为0℃-40℃，最适生长水温为22℃-30℃。3.8生长表20各年龄生长阶段的规格龄组体长(cm)平均体长(cm)体重(g)平均体重(g)鱼种(0+)17.2-19.518.5±1.1110.2-129.6120.2±8.8二龄鱼(1+)29.9-31.830.8±7.2780.6-960.8858.8±101.6三龄鱼(2+)37.6-43.240.8±3.21365.0-1590.41,449.6±221.83.9繁殖性成熟年龄：在适温条件下，雌、雄鱼初次性成熟约为二龄(1+)，最佳繁育年龄为三龄(2+)～五龄(4+)。雌雄性别比例：雌、雄鱼比为1：1。产卵类型：性腺一年成熟一次，产粘性卵，分批产卵，经脱粘可流水孵化。怀卵量：人工养殖条件下亲鱼个体怀卵量见表21。表21人工养殖条件下亲鱼个体怀卵量年龄,龄二龄雌鱼平均体重，g858.8±101.6绝对怀卵量,粒66880±5040相对怀卵量,粒/g77.9±8.54、历年生长对比试验结果4.1、试验地点试验在上海海洋大学农业部团头鲂遗传育种中心(位于浦东滨海)和上海海洋大学青浦鱼类育种试验站进行。浦东试验点土池为1.5亩/个，青浦试验点土池为1.5亩/个，每个试验点各设3个平行。4.2、试验材料实验材料为团头鲂“团头鲂f4代”和“浦江1号”自繁f11代(以下简称“对照组”)。2015年5月中旬，从团头鲂“f4代”群体中挑选50组性成熟且发育良好的亲本为繁殖对象，于下午4时开始混合使用绒毛膜促性腺激素(hcg)和促黄体生成素释放激素类似物(lhrh-a2)，采取一次性胸鳍基部注射法对亲本进行催产注射，雄鱼注射剂量为雌鱼注射剂量的一半。将已经注射了催产剂的雌雄亲鱼分别暂养在两个直径2米的圆形产卵池中，微流水刺激。次日早上采用拉网方式起捕亲鱼，取精、卵进行人工干法授精。受精卵经滑石粉脱粘后放入鱼苗孵化桶中孵化，每隔3～4h清洗1次孵化桶过滤网直至出膜，繁殖出苗后放大塘养殖。4.3、试验方法将2015年5月中旬同一天人工繁殖的试验组和对照组鱼苗放大塘养殖。待鱼苗长到5cm左右时，从两个群体中各随机抽样200尾，分别剪左腹鳍条和右腹鳍条做标记，在青浦试验点分别抽取3个土塘为平行组，采用完全随机区组设计，同池混养。经过6个月的喂养后，采用拉网方式，随机取样35尾测量其体重、体长、体高等数据。将测量后的试验鱼经补剪鳍条继续同池混养12个月，测量其体重、体长和体高等数据，后经干塘统计成活率。试验期间投喂淡水鱼颗粒饲料，配合人工种植的黑麦草，每日早晚各投喂1次，根据鱼的生长以及天气情况及时调整投饲量。在饲养过程中，每隔半月灌注新水一次，每隔一个月使用阿维菌素全塘泼洒预防鱼病，根据天气情况及时开关增氧机，试验期间各池塘养殖环境保持一致。4.4、数据测量用电子天平测量体质量(精确到0.1g)，用两脚规配合直尺测量体高、体长(精确到0.1mm)，成活率按下式计算(孙成飞,陈杰,蒋霞云,邹曙明.tgf2转座子介导的草鱼、团头鲂和鲫插入诱变研究[j].农业生物技术学报,2018,26(1):11～19)。成活率＝成活的数量/总数量×100％4.5、数据分析利用microsoftexcel办公软件计算各平行组生长数据的平均值和标准差，用spss软件进行差异显著性分析，分析结果以平均值±标准差式表示。4.6、浦东试验点生长对比小试结果从表22、表23可见，团头鲂“浦江2号”选育系一、二龄鱼的生长速度均超过“浦江1号”对照组。一龄鱼比对照组生长快20.4％；二龄鱼比对照组生长快19.8％。体长/体高比在2.1～2.2之间，体型较好。表明“浦江2号”在一、二龄阶段均具有显著(p<0.01)的生长优势。从上年鱼苗放养到成鱼养成的2年成活率提高了11.9％。表22“浦江2号”选育系一龄阶段的生长对比试验(青浦试验点)表23“浦江2号”选育系二龄阶段的生长对比试验(青浦试验点)以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。当前第1页1 2 3