一种湿地松胚性愈伤组织的诱导培养方法及诱导培养基与流程

本发明涉及植物组织培养领域，具体是涉及一种湿地松胚性愈伤组织的诱导培养方法及诱导培养基。

背景技术：

湿地松(pinuselliottiiengelm.)原产于美国东南部，1933年引入中国后，由于适应性强、生长快，松脂质量好，松香不易结晶、不易凝固、杂质少等优点，已成为我国人工栽培面积最大的外来产脂树种。然而，湿地松生产多以传统、粗放的实生苗繁殖为主，生产设施简陋，科技投入少，缺乏统一的繁育和栽培技术，导致苗木成品质量不稳定且数量也远远达不到实际需求；而现有扦插繁殖技术生根率低、嫁接技术要求高且受季节限制，致使优良家系及无性系不能规模化生产。

体细胞胚胎发生(somaticembryogenesis)是指通过人为控制，使植物的体细胞不经过受精过程的细胞融合，而是通过发生和合子胚类发育途径相似的过程产生新个体的现象，具有遗传稳定性强、再生率高、不受自然条件限制等优点。针叶树体胚发生通常分为胚性愈伤组织(胚性胚柄团)诱导、胚性愈伤组织增殖、体细胞胚的分化成熟和体胚萌发及植株再生等四个阶段。胚性愈伤组织诱导作为体胚发生的第一步在湿地松体胚发生体系中具有重要地位。

目前，关于湿地松胚性愈伤组织诱导虽已有报道，但尚存在胚性愈伤组织诱导率低的问题。诱导率低产生的原因较多，如外植体的基因型、取样时间及培养条件等。因此，通过选择合适的基因型、取样时间、培养条件等，建立稳定的胚性愈伤组织诱导体系，可为湿地松体胚发生技术体系的建立奠定基础，也为湿地松良种的规模化育苗提供一种高效、稳定的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服上述背景技术的不足，提供一种湿地松胚性愈伤组织的诱导培养方法及其专用诱导培养基，建立稳定的胚性愈伤组织诱导体系，为湿地松体胚发生技术体系的建立奠定基础，也为湿地松良种的规模化育苗提供一种高效、稳定的方法。

为达到本发明的目的，本发明湿地松胚性愈伤组织的诱导培养方法包括以下步骤：

(1)7月中上旬采集湿地松球果，将球果用无水乙醇完全浸没10-20min后用无菌水冲洗2-4次，再剥去种壳取出种子，用70-80％的酒精浸泡种子2-4min，无菌水冲洗5-8次，种子放入带滤纸的培养皿内，封口，冷藏备用；

(2)在无菌条件下沿种子的侧边距离尾部处切开，取出完整的未成熟合子胚，置于固体诱导培养基上，接种，封膜，放入23±3℃条件下暗培养46-52天后，得到胚性愈伤组织；

其中，所述固体诱导培养基为添加有2,4-d、kt和6-ba的dcr培养基。

本发明所述7月中上旬采集湿地松球果是参考pullan火炬松合子胚发育阶段划分标准，即取处于ii-iii阶段的未成熟合子胚作为材料。所述7月中上旬优选7月2-14日。

进一步地，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为1.8-3.6mg/l、kt的浓度为0.8-3.6mg/l和6-ba的浓度为0.8-3.6mg/l。

优选地，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为1.8-2.5mg/l、kt的浓度为1.6-2.7mg/l和6-ba的浓度为1.6-2.7mg/l。

更优选地，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为2.2mg/l、kt的浓度为2.2mg/l和6-ba的浓度为2.2mg/l。

进一步优选地，所述固体诱导培养基中还添加了1.4-1.6g/l的松三糖、8-15g/l的vc、2.7-3.3g/l的结冷胶、90-110mg/l的肌醇、0.8-1.2g/l的酶水解酪蛋白或480-520mg/l的谷氨酰胺中的一种或多种。

更进一步优选地，所述固体诱导培养基中还添加了1.5g/l的松三糖、10g/l的vc、3.0g/l的结冷胶、100mg/l的肌醇、1g/l的酶水解酪蛋白、500mg/l的谷氨酰胺中的一种或多种。

进一步地，所述固体诱导培养基的ph值为5.5-6.1，优选5.8。

另一方面，本发明还提供了一种湿地松胚性愈伤组织的诱导培养基，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为1.8-3.6mg/l、kt的浓度为0.8-3.6mg/l和6-ba的浓度为0.8-3.6mg/l。

优选地，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为1.8-2.5mg/l、kt的浓度为1.6-2.7mg/l和6-ba的浓度为1.6-2.7mg/l。

更优选地，所述固体诱导培养基中2,4-d的浓度为2.2mg/l、kt的浓度为2.2mg/l和6-ba的浓度为2.2mg/l。

进一步优选地，所述固体诱导培养基中还添加了1.4-1.6g/l的松三糖、8-15g/l的vc、2.7-3.3g/l的结冷胶、90-110mg/l的肌醇、0.8-1.2g/l的酶水解酪蛋白或480-520mg/l的谷氨酰胺中的一种或多种。

更进一步优选地，所述固体诱导培养基中还添加了1.5g/l的松三糖、10g/l的vc、3.0g/l的结冷胶、100mg/l的肌醇、1g/l的酶水解酪蛋白、500mg/l的谷氨酰胺中的一种或多种。

进一步地，所述固体诱导培养基的ph值为5.5-6.1，优选5.8。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

本发明提供的湿地松胚性愈伤组织诱导培养方法以湿地松未成熟合子胚为材料，以dcr为基础培养基，通过添加适量的激素、硝酸银、vc、结冷胶等，对诱导培养基进行了优化，使胚性愈伤组织的诱导率最高达到40％，为建立湿地松体细胞胚再生体系奠定了基础，也为湿地松良种繁育及下一步的遗传转化提供了理论依据。

附图说明

图1是合子胚的发育阶段；其中a、未成熟合子胚；b、切开的未成熟合子胚；c、第1阶段；d、第2阶段；e、第3阶段；f、第4阶段；g、第5阶段；h、第6阶段；i、第7阶段；j、第8阶段；

图2是本发明湿地松未成熟胚诱导愈伤组织的产生过程；其中，从左至右分别为：1、诱导初期；2、胚性愈伤组织；3、非胚性愈伤组织；4、胚性胚柄细胞团；

图3是本发明实施例3中不同碳源对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。应当理解，以下描述仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。

此外，本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明实施例中湿地松胚性愈伤组织的诱导培养方法为：

(1)7月中上旬采集湿地松球果，将球果用无水乙醇完全浸没15min后用无菌水冲洗2-4次，再剥去种壳取出种子，用75％的酒精浸泡种子3min，无菌水冲洗5-8次，种子放入带滤纸的培养皿内，封口，冷藏备用；

(2)在无菌条件下沿种子的侧边距离尾部1/3处切开，取出完整的未成熟合子胚，置于固体诱导培养基上，接种，封膜，放入23±1℃条件下暗培养7周后，得到胚性愈伤组织；

其中，所述固体诱导培养基为添加有2,4-d、kt和6-ba的dcr培养基。

实施例1

不同采集日期及外植体成熟度对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响研究：2018年从吉安市峡江林木良种场选取编号为16号单株的球果，采集时间为7月4日、7月11日、7月18日、7月25日、8月1日，每个采集时期随机抽取3个球果，每个球果随机取10个未成熟种子灭菌，去除外种皮，得到含合子胚及胚乳的外植体。

以pullan火炬松合子胚发育阶段划分标准为参照，在20×体视镜(leicamz16)下观察湿地松合子胚的发育时期，将观察到的湿地松合子胚的发育时期划分为8个阶段。如图1所示，第1阶段为合子胚发育早期，第2阶段为多胚头阶段，第3阶段为裂生多胚阶段，第4阶段为球形胚阶段，第5阶段为棒状胚阶段，第6阶段为子弹头阶段，第7、8阶段合子胚逐渐发育成熟。

如表1所示，不同采集时间的球果作为外植体的愈伤组织诱导率及胚性愈伤组织诱导率均存在显著差异，以7月11日和7月4日(ii-iii阶段)的愈伤组织诱导率最高，随着合子胚的发育，胚性愈伤组织诱导率逐渐降低，直至完全成熟，胚性愈伤组织诱导率为0％。

表1不同采集日期对湿地松胚性愈伤组织诱导的影响

实施例2

不同激素对湿地松愈伤组织诱导的影响研究：按实施例1的操作方法(球果采集时间为7月11日)，将外植体接种到dcr基本培养基上进行诱导增殖，通过添加不同浓度的kt，2,4-d和6-ba对诱导湿地松胚性愈伤组织的结果如表2所示。

表2不同激素浓度组合对湿地松愈伤组织诱导率的影响

表2表明，不同浓度的kt、2,4-d、6-ba的激素组合对湿地松愈伤组织诱导的影响差异显著。5号处理愈伤组织诱导率最高，达到30％，其次是4号处理和8号处理，湿地松胚性愈伤组织诱导率为20％，2号处理未能诱导出愈伤组织，因此，5号处理dcr+kt2.2mg/l+2,4-d2.2mg/l+6-ba2.2mg/l为湿地松胚性愈伤组织诱导的最适培养基。

实施例3

不同碳源对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响研究：在实施例2得到的诱导培养基(5号)上分别添加蔗糖、麦芽糖、松三糖作为碳源，试验了不同碳源对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响，结果如图3。

图3表明，当蔗糖浓度为30g/l时，诱导率达到最高，为20％。当麦芽糖浓度为30g/l时，诱导率达到最高，为30％。以松三糖作为诱导培养基的碳源时，变化规律不明显。当松三糖浓度为1.0g/l时，湿地松愈伤组织诱导率仅为2.5％，而当松三糖浓度为1.5g/l时，诱导率达到最高，为40％。

实施例4

硝酸银、vc对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响研究：在实施例2得到的诱导培养基(5号)上分别添加硝酸银和vc，试验了不同浓度硝酸银及vc对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响，结果如表3、表4。

表3不同浓度硝酸银对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响

由表3可知，当不添加硝酸银时，诱导率最高，为42.5％。随着硝酸银浓度的升高，诱导率逐渐降低。当添加8g/l的硝酸银时，诱导率最低，仅为7.5％。由此可知，添加硝酸银会降低湿地松胚性愈伤组织的诱导率。

表4不同浓度vc对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响

由表4可知，随着vc浓度的增加，诱导率整体呈上升趋势。当vc浓度为2.5g/l时，诱导率最低为12.5％；当vc浓度为10g/l时，胚性愈伤组织诱导率最高，达到37.5％。

实施例5

不同结冷胶浓度对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响研究：在实施例2得到的诱导培养基(5号)上添加结冷胶，试验了不同浓度结冷胶对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响，结果如表5。

如表5所示，添加3.0g/l结冷胶的湿地松胚性愈伤组织平均诱导率显著高于添加6.0g/l结冷胶的平均诱导率，分别为42.5％和5％。

表5不同结冷胶浓度对湿地松胚性愈伤组织诱导率的影响

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。