本发明涉及食用菌栽培技术领域，具体涉及一种通过人工调控蛹虫草菌种接种时机与方式以提高蛹虫草子实体生物产量的方法。
背景技术：
蛹虫草(cordycepsmilitaris)，又名北冬虫夏草、北虫草、虫草花，在真菌分类学上属子囊菌亚门，核菌纲，麦角菌目，麦角菌科，虫草属，是虫草属真菌的模式种。虫草属真菌是寄生于昆虫、蜘蛛或大团囊属植物的地下子实体上形成的一类虫菌复合物的统称。蛹虫草在野外主要寄主于鳞翅目、鞘翅目和双翅目的一些昆虫的幼虫和蛹上。蛹虫草中除含有大量蛋白质、维生素等营养成分外，还含有虫草多糖、腺苷、虫草素、虫草酸、n6-(2-羟乙基)腺苷、喷司他丁等大量生物活性物质，是一种极具发展前景的药食两用真菌。
提高生物转化率即单位重量栽培料的产菇率，一直食用菌栽培领域的核心技术问题，直接关系到栽培企业的市场竞争能力。提高蛹虫草子实体的产量即生物转化率，也是蛹虫草规模化栽培中的核心技术问题。该技术涉及到菌种质量、营养调控、栽培管理等不同方面。目前，在蛹虫草的规模化栽培中，由于竞争非常激烈，各栽培企业均已竭力在菌种质量、营养调控、栽培管理等各方面完善相关的栽培技术，以在优胜劣汰的环境中得以生存。但由于蛹虫草菌种比大多数的食用菌更容易变异和退化，因此，优质菌种的选育和菌种质量的控制，一直是蛹虫草栽培领域难度最高的技术领域。
总体来说，蛹虫草的菌种退化可以归结为以下几种类型：
1、核型变化导致的菌种退化，表现无法启动有性生殖过程，因此不能形成子实体。
已知真菌的交配型系统是控制其交配亲和性和有性生殖的遗传基础。蛹虫草的交配型系统是一种二极性的异宗配合交配型系统。该交配型系统的特征是，由同一种有性孢子萌发形成的初级菌丝(简称单核体)不能独立完成有性生殖，只有当两种不同交配型的有性孢子萌发生成的初生菌丝之间经过交配(即两种不同类型的单核体进行交配)形成异核体，才能启动和完成有性生殖，产生正常的子实体。同时，具有产子实体能力的异核体菌种，在培养和传代的过程中，核型很容易发生变异，由异核体分解为两种不具备交配能力的同核体，这两种同核体菌丝虽然含有不同类型的交配型基因，确已失去交配能力，即使在一起生长，也不能产生子实体。这就是核型变化导致不能正常产子实体的菌种退化现象，这种菌种退化在蛹虫草规模栽培中发生频率非常高，可以在很大程度上影响生产菌种的质量。根据异核体分解、同核体积累的程度，可以导致子实体产量不同程度的降低甚至完全不产子实体的情况，给规模生产带来极大损失。从真菌交配型系统特性上来说，有一种补救途径，即只要有一种具性亲和能力的单核体存在，就也可以与本身无性亲和能力的含不同交配型基因的异核体或同核体交配，形成新的具有产子实体能力的异核体，简称双单交配。针对异核体分解、同核体积累的退化，已有的解决办法有两种。一种是不断纯化菌种，通过不断剔除同核体、保留异核体来保持菌种的质量，但这种方法只能在一定程度上减少异核体分解、同核体积累的风险，不能从根本上避免退化。另一种是利用单核体菌种核型更稳定的特点，在制种时两种单核体菌种分别制作，接种时两种菌种混合接种，这种方法能够较好地保证出草率，两种交配型混合时的浓度比例，也常常给规模生产带来产量波动。若采用双单交配进行混合接种，结果会比单单交配混合接种效果更差。
2、高水平活性氧相关的菌种自发高频变异，表现为线粒体功能损伤、菌丝疯长、不转色、不出子实体或出子实体能力大幅降低等严重退化现象。中国科学院植物生理生态研究所王成树团队对该类型菌种退化的机制已有较深入的研究(参见li,l,hu,x,xia,y,等.linkageofoxidativestressandmitochondrialdysfunctionstospontaneousculturedegenerationinaspergillusnidulans[j].molecular&cellularproteomicsmcp,13(2):449-461)。
3、营养不良等因素导致的菌种退化，表现为菌种分解培养料能力降低，生物产量降低。
通常的解决办法是，将菌种回接到寄主上(如蚕蛹上)培养或在培养基中添加与寄主营养相类似的成分以尽量模拟野外培养条件培养蛹虫草，然后再从中分离菌种，以期达到复壮菌种性状的目的。
以上三种菌种退化，以第一种退化最不易监测，因为核型变化原本就是真菌自然存在的不同方式，菌丝仍是正常的，转色能力也没有变化。从核型监测来说，对于一个菌种培养物(斜面或液体菌液)，虽然从单菌丝水平可以测定是否单交配型，但从菌种的群体水平，很难判断两种交配型是异核体还是已经分解的两种同核体的混合表现。如果能在规模生产中，减少或避免这种退化带来的影响，将能有效提升蛹虫草的栽培效率。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种两步接种提高蛹虫草子实体产量的方法。该方法是一种通过人工调控蛹虫草菌种接种时机与方式以提高蛹虫草子实体生物产量的方法。本发明采用的两步接种方法既能减少规模生产中的核型变化导致的菌种退化影响，又能大幅提高蛹虫草子实体的生物转化率，因此能够有效提高蛹虫草子实体的生物产量。本发明是食用菌菌种接种领域的一个重要创新。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种两步接种提高蛹虫草子实体产量的方法，包括如下步骤：
(1)将蛹虫草单核体菌种接种至蛹虫草栽培培养基上，进行培养；
(2)将另一种含有与第(1)步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体、异核体或同核体菌种接种至第(1)步接种后的蛹虫草培养物上，继续培养，直至收获蛹虫草子实体，所述培养物为含接种蛹虫草单核体菌种的栽培培养基。
其中，步骤(1)将蛹虫草单核体菌种接种至蛹虫草栽培培养基上，培养一段时间。该蛹虫草单核体菌种的获得方法为：从蛹虫草成熟子实体上通过子囊孢子弹射等方法，分离获得一定数量的子囊孢子单孢菌种，再将所获得的子囊孢子单孢菌种两两配对培养，能够产生子实体的配对菌种，则表明彼此是具有性亲和能力的，其中至少有一个菌种是单核体菌种；从多个配对结果中，可以推断出各单孢菌株是否单核体菌种；两个能产生子实体的配对菌株，其中一个必定是单核体菌种，而另一个则是含有相反交配型基因的单核体、异核体或同核体菌种(步骤2中所需采用)。具体操作方法和原理，可参考已发表的文献【高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.】所述相关内容；或者采用本领域可实现的其他相关方法均可。
其中，步骤(2)再将另一种含有与第(1)步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体、异核体或同核体菌种接种至第(1)步接种后的蛹虫草培养物上，继续培养，直至收获蛹虫草子实体。单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体、异核体或同核体菌种的获得，同上述参考文献，或者采用本领域可实现的其他相关方法均可。
其中，步骤(1)将蛹虫草单核体菌种接种至蛹虫草栽培培养基上，培养一段时间，该时间具体是指培养3～20天。该培养时间是本发明的核心步骤之一，从后面要叙述的发明原理可知，该时间是利用单核体菌种的高纯度来提高培养基利用充分度和最终提高子实体生物产量的关键。
作为优选，步骤(1)所述培养时间为8-15天。由于蛹虫草菌种的多样性，不同菌种的生育期长短会有不同，因此在实施本发明方法时，不同菌种的优选时间会稍有差异。根据不同菌种生长特性，找到两步接种之间的最佳时间间隔，能够得到最佳的规模生产效益。
其中，步骤(2)所述将另一种含有与第(1)步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体、异核体或同核体菌种接种至第(1)步接种后的蛹虫草培养物上，其所接种的菌种应具有可与第(1)步接种的菌种产生单单交配或双单交配的性交配反应的能力。这从步骤(1)中所述的单核体、异核体或同核体菌种的获得方法中也可看到，这种性交配能力是通过单单交配、双单交配的原理来判断的。接种后继续培养，直至收获蛹虫草子实体。
所述栽培培养基配方是用麦仁、大米、小米、玉米等不同粮食原料单独或组合后，按质量比1：1.2～1.8的比例加水配成，该栽培培养基配方还可以包括添加本领域技术人员所熟悉的更多的营养物，该栽培培养基需灭菌后使用。
本发明中关于蛹虫草栽培过程中的其它培养条件等，采用的都是蛹虫草栽培领域通用的技术和条件，该领域的技术人员都能实施，将在实施例中更详细说明。
设计原理：本发明两步法所对比的是目前栽培中一直在用的已知最优的两种接种法：传统异核体接种法(以下简称传统法)和两种单核体混合后一步接种法(以下简称一步法)。三种方法的优劣对比见表1。其中，受核型变化影响程度，由于单核体最稳定，异核体最易分解，因此传统法受影响最大。有效生物转化率方面，在培养物中同核体菌丝也消耗营养，但这种营养消耗并不能转化为子实体产量，因此是负消耗，有效生物转化率相对就更低。传统法由于有混杂一定比例同核体的可能，因此有效生物转化率无法达到最高。而一步法在一次交配的过程中，也可能因重复交配(双单交配)导致一定比例的同核体副产物的出现，也使有效生物转化率无法达到最高。两步法采用了延迟交配的方法，其核心原理是，第一步接种的单核体经过一段时间的培养，已经在培养料中占据绝对优势，作为更严格意义上的纯种，其能量利用和转化是完全统一的，不存在菌丝营养不亲和带来的损耗，而第二步接种的菌种，只是在培养基表面起到提供异核而启动有性生殖的作用，基本不影响有效生物转化率，因此能使整个培养的有效生物转化率达到最高，子实体生物产量也达到最高。
表1、传统法、一步法、两步法三种接种方法的优劣对比
经过大量栽培试验验证表明，两步法相对于其它两种方法，能够较大幅度地提高子实体生物产量。两步法的缺点是会使生育期相对延长，但从试验观察发现，两步法培养的出子实体阶段，子实体生长速度显著快于传统法和一步法，因此其生育期的延长幅度相对较小，总体是利明显大于弊。表2提供了一项培养料干重为20克、每种方法培养重复数为500瓶情况下的试验数据。其中两步法比传统法生物转化率提高了77.8％，比一步法生物转化率提高了66.7％。而生育期延长影响低于15％(如本发明实施例1)。
因此，本发明利用两步接种方法提高蛹虫草子实体产量，既能减少规模生产中的菌种退化影响，又能提高蛹虫草子实体的生物转化率，从而大幅提高蛹虫草子实体的生物产量。
本发明所采用的两步接种方法，无论在文献和生产实践中，均未见该方法被应用。微生物发酵领域中有固体培养转到液体培养的两步发酵法，有维生素c两步法生物发酵等，但与本发明的两步法均明显完全不同。因此本发明是一种全新的两步接种提高蛹虫草子实体产量的方法。本发明也可能被借鉴应用于与蛹虫草具有相似的菌种退化特征和栽培特征的其它食用菌，因此本发明是食用菌栽培领域的一个重要创新。
表2、传统法、一步法、两步法三种接种方法的子实体产量对比
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提出了一种全新的两步接种提高蛹虫草子实体产量的方法，利用两步接种方法提高蛹虫草子实体产量，既能减少规模生产中的菌种退化影响，又能提高蛹虫草子实体的生物转化率，从而大幅提高蛹虫草子实体的生物产量，相对于传统法、一步法，本发明的方法基本不影响有效生物转化率，因此能使整个培养的有效生物转化率达到最高，子实体生物产量也达到最高。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第3天。常规培养方法和单核体菌种获得方法，在该领域已相当成熟，该领域的技术人员均能实行，并可作出不同程度的改良，本实施例中具体操作方法参考(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.，具体见1.3节)所述相关内容。本实施例所用的栽培培养基配方为：每瓶含麦仁20克，水30毫升，高压灭菌后使用，每个处理重复50瓶。液体培养采用pdb培养基，液体菌种在150rpm、22℃条件下振荡3天后，用无菌水稀释100倍体积后接种至栽培培养基，每瓶接种稀释后的菌液4毫升。其它实施例条件与方法相同。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体菌种至第一步接种后的蛹虫草栽培培养基上。此步骤中，菌种的获得、制备、接种方法均与步骤(1)相同，并可参考文献(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.)所述相关内容。其它实施例培养条件与方法相同。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。此处所述常规培养方法，在该领域已相当成熟，该领域的技术人员均能实行，具体可参考文献(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.)所述相关内容。本实施例栽培过程的整个过程的培养温度为22℃，光培养阶段光照强度为500勒克斯。其它实施例培养条件与本方法相同。
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为50天(直到收获为止)，子实体平均鲜重为28.4克/瓶，平均干重为3.9克/瓶，平均生物转化率为142％。而同期采用相同材料的对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。同期采用相同材料的一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。此处对照培养所用的传统法，是指该领域最普通使用的常规接种方法(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.中的1.3节)；一步法是指两种具有性亲和能力的不同交配型菌种一次性配对接种的方法；具体均可参考文献(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5中的1.5节)所述相关内容。本例中的传统法、一步法所采用的培养基配方、菌种制作条件、栽培培养条件均与本例中两步法所述条件一致。
实施例2
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第8天。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体菌种至第一步接种后的蛹虫草培养物上。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。(其他步骤同实施例1)
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为53天，子实体平均鲜重为32.7克/瓶，平均干重为4.6克/瓶，平均生物转化率为163.5％。而同期对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。
实施例3
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第15天。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体菌种至第一步接种后的蛹虫草培养物上。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。(其他步骤同实施例1)
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为57天，子实体平均鲜重为34.5克/瓶，平均干重为4.9克/瓶，平均生物转化率为172.5％。而同期对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。
实施例4
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草大米栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第20天。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草单核体菌种至第一步接种后的蛹虫草培养物上。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。(其他步骤同实施例1)
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为60天，子实体平均鲜重为32.1克/瓶，平均干重为4.5克/瓶，平均生物转化率为160.5％。而同期对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。
实施例5
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第15天。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草异核体菌种至第一步接种后的蛹虫草培养物上。此处所用的异核体菌种是蛹虫草栽培中最常规应用的菌种，不需要额外的方法获得。同时，异核体菌种本身就是指含有两种不同交配型的，因此必然含有一种与第一步接种的单核体菌种不同的交配型。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。(其他步骤同实施例1)
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为57天，子实体平均鲜重为32.9克/瓶，平均干重为4.7克/瓶，平均生物转化率为164.5％。而同期对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。
实施例6
(1)按常规方法接种蛹虫草单核体菌种至蛹虫草栽培培养基上
用常规方法制备好蛹虫草单核体液体菌种，接种于蛹虫草栽培培养基中，分别经过避光培养、见光培养等常规培养过程，培养至第15天。
(2)按常规方法接种另一种含有与第一步接种的单核体菌种相反交配型基因的蛹虫草同核体菌种至第一步接种后的蛹虫草培养物上。此步骤中，同核体菌种的获得方法与实施例1中所述单核体菌种的获得方法相同，同核体是一种在型亲和反应中能够供给核却不能接受核的单交配型菌种，具体可参考文献(高新华2008，蛹虫草(cordycepsmilitaris)的交配型研究，食用菌学报15(1)：1～5.)所述相关内容。
两步接种后，按蛹虫草常规培养法培养并进行出子实体管理，直到子实体成熟，开始收获并测定子实体的鲜重、干重。(其他步骤同实施例1)
(3)两步法培养结果
2019年9月至11月期间培养结果表明，本次培养的生育期为57天，子实体平均鲜重为33.2克/瓶，平均干重为4.8克/瓶，平均生物转化率为166％。而同期对照传统法培养的生育期为50天，子实体平均鲜重为19.4克/瓶，平均干重为3.3克/瓶，平均生物转化率为97％。一步法的生育期为50天，子实体平均鲜重为20.7克/瓶，平均干重为3.5克/瓶，平均生物转化率为103.5％。
从以上6个实施例结果可见，本发明能够大幅提高蛹虫草子实体的生物产量，8～15天是两步接种间隔的优选时间，第二步接种中用含有与第一步接种菌种不同交配型的单核体菌种、异核体菌种、同核体菌种效果相同(见表2)。
实施例7
实施例7采用与实施例1相同的培养方法，不同之处在于：本实施例所用的栽培培养基配方为：每瓶含大米20克，水24毫升，高压灭菌后使用，每个处理重复50瓶。
实施例8
实施例8采用与实施例1相同的培养方法，不同之处在于：本实施例所用的栽培培养基配方为：每瓶含大米20克，水36毫升，高压灭菌后使用，每个处理重复50瓶。实施例7和8的结果与实施例1类似。