本发明涉及农业生物
技术领域：
，尤其涉及一种藜蒿不定芽继代培养的专用培养基及其制备方法。
背景技术：
：藜蒿(artemisiaselengensissp.)为菊科蒿属多年生宿根性草本植物，因其营养丰富、口感爽脆、兼具药用价值而广受消费者青睐。根茎扦插繁殖是藜蒿的传统种植方式，长期的连续扦插繁殖，导致藜蒿生产上存在产量下降、品相退化、品质良莠不齐等问题，亟需进行种苗的提纯复壮。借助现代植物离体快繁技术，不仅可以获得基因型一致的优良种苗，还能够实现在较短时间内大规模培育藜蒿种苗，以满足藜蒿产业发展的种苗需求。阳新湖蒿是湖北省阳新县的地方藜蒿良种，2018年被列入国家地理标志保护产品。申请人前期研究中，以阳新湖蒿茎顶端嫩芽为外植体，建立了基于愈伤组织诱导、不定芽分化、不定芽继代和生根育苗等环节的离体再生培养体系，所培育的组培苗大田种植示范结果表明，在苗相和产量方面都表现出明显的优势，具有重要的推广应用价值。但是，由于藜蒿组培苗大规模繁殖需要通过不定芽连续大量继代培养实现，所采用的不定芽继代培养基的组成为：ms培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l(ph5.8，培养条件：温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux)，加上配制培养基用的纯净水、专用的培养基灭菌及设备、外植体消毒等，组培苗生产成本较高且操作工序复杂，影响了蒿农种植组培苗的积极性。因此，特别需要一种有效降低藜蒿不定芽继代培养成本和简化操作程序的方法，以解决上述存在的技术问题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种藜蒿不定芽继代培养的专用培养基及其制备方法，能够有效地应用于生产上大规模繁殖藜蒿组培苗，具有成本低、缩短操作工序的有益效果。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种藜蒿不定芽继代培养的专用培养基，包括如下组分：基础培养基、苦瓜、6-ba、naa、蔗糖、琼脂和水。作为优选，所述基础培养基为按照配制1升基本培养基所需添加的1/3培养基。作为优选，所述苦瓜选自老熟的苦瓜。作为优选，所述苦瓜的添加量为200～250g/l；所述6-ba的添加量为0.01～0.03mg/l；所述naa的添加量为0.01～0.03mg/l；所述蔗糖的添加量为20～30g/l；所述琼脂的添加量为6～7g/l。作为优选，所述专用培养基的ph值为5.6～6.0。本发明还提供了一种藜蒿不定芽继代培养的专用培养基的制备方法，包括如下步骤：(1)将苦瓜进行处理，得到苦瓜汁；(2)将6-ba、naa加入到基础培养基中，得到具有生长调解功能的基础培养基；(3)将苦瓜汁、具有生长调节功能的基础培养基、蔗糖和琼脂混合后，定容，加热直至琼脂融化，得到藜蒿不定芽继代培养的专用培养基。作为优选，所述苦瓜汁的制备方法为：用自来水将苦瓜洗净、去籽、切碎后放入带水的锅中煮，直至苦瓜烂熟后，用纱布过滤得到苦瓜汁。作为优选，所述将切碎的苦瓜放入带水的锅中煮的时间为：煮沸到100℃后，再连续煮13～17min。作为优选，所述加热直至琼脂融化的加热时间为：煮沸到100℃后，再连续煮3～7min。本发明提供了一种藜蒿不定芽继代培养的专用培养基及其制备方法。本发明的专用培养基以及制备方法与现有技术相比具有以下优点：(1)培养基免灭菌，利用本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基，不经过灭菌也能达到培养基灭菌后同样的灭菌效果，培养20天后培养基染菌率均为0。(2)生产成本降低，本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基中，基础培养基用1/3ms培养基中加入苦瓜代替现有技术使用的ms培养基，用自来水代替纯水制备培养基，以及减少培养基灭菌设施和能源的投入，组培苗生产成本降低54.8％。(3)简化操作程序，本发明培养基制备过程中省去了灭菌环节，组培苗生产工序明显简化。(4)促进不定芽生长。利用本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基，不定芽生长量比对照灭菌、不加苦瓜的ms培养基增加了1cm，增加18.9％。具体实施方式本发明提供了本发明提供了一种藜蒿不定芽继代的专用培养基，包括如下组分：基础培养基、苦瓜、6-ba、naa、蔗糖、琼脂和水。在本发明中，所述基础培养基为按照配制1升基本培养基所需加量的1/3的ms培养基，优选为按照配制1升基本培养基所需加量的1/3ms培养基。所述ms培养基的组成及配制方法参照李浚明编译《植物组织培养教程》p.33(中国农业大学出版社，2002年6月第2版)。在本发明中，所述1升基本培养基的制备方法为：在本发明中，所述苦瓜选自老熟的苦瓜。在本发明中，所述水为自来水。在本发明中，所述苦瓜的添加量为200～250g/l，优选为225g/l。在本发明中，所述6-ba的添加量为0.01～0.03mg/l，优选为0.02mg/l。在本发明中，所述naa的添加量为0.01～0.03mg/l，优选为0.02mg/l。在本发明中，所述蔗糖的添加量为20～30g/l，优选为25g/l。在本发明中，所述琼脂的添加量为6～7g/l，优选为6.5g/l。在本发明中，所述专用培养基的ph值为5.6～6.0，优选为ph值为5.8。本发明还提供了一种藜蒿不定芽继代的专用培养基的制备方法，包括如下步骤：(1)将苦瓜进行处理，得到苦瓜汁；(2)将6-ba、naa加入到基础培养基中，得到具有生长调解功能的基础培养基；(3)将苦瓜汁、具有生长调节功能的基础培养基、蔗糖和琼脂混合后，定容，加热直至琼脂融化，得到藜蒿不定芽继代的专用培养基。在本发明中，所述苦瓜汁的制备方法为：用自来水将苦瓜洗净、去籽、切碎后放入带水的锅中煮，直至苦瓜烂熟后，用纱布过滤得到苦瓜汁。在本发明中，所述煮苦瓜的锅优选为钢精锅。在本发明中，所述煮苦瓜时优选为在电磁炉上煮。在本发明中，所述带水的锅中的水量按每升专用培养基放入600～800ml自来水，优选为700ml。在本发明中，所述将切碎的苦瓜放入带水的锅中煮的时间为：煮沸到100℃后，再连续煮13～17min，优选为再连续煮15min。在本发明中，所述过滤苦瓜汁的时机为待煮沸苦瓜汁冷却至40～50℃时过滤，优选为45℃。在本发明中，所述加热直至琼脂融化的加热时间为：煮沸到100℃后，再连续煮3～7min，优选为再连续煮5min。在本发明中，所述将融化后的专用培养基冷却至40～50℃时，分装至组培瓶中，优选为冷却至45℃时分装。在本发明中，所述藜蒿不定芽继代培养的培养条件优选为温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实验例1优选藜蒿不定芽继代专用培养基中基础培养基ms的用量采用单因子试验法。按照配制1升基本培养基中基础培养基所添加ms培养基的比例，分别设置1/5ms、1/4ms、1/3ms、1/2ms的4种处理，，以ms培养基为对照。用纯净水依次将藜蒿不定芽继代培养的培养基设置为：(1)1/5ms培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l构成的ph5.8的1/5ms的藜蒿不定芽继代培养基；(2)1/4ms培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l构成的ph5.8的1/3ms的藜蒿不定芽继代培养基；(3)1/3ms培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l构成的ph5.8的1/3ms的藜蒿不定芽继代培养基；(4)1/2ms培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l构成的ph5.8的1/2ms的藜蒿不定芽继代培养基；(5)对照，由ms基本培养基、6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l构成的ph5.8的ms基础培养基的藜蒿不定芽继代培养基。分别将5种培养基置于121℃、0.11mpa条件下进行高温湿热灭菌处理20min。以阳新湖蒿不定芽为外植体，接种到不同处理的培养基中进行培养，三次重复。培养条件为：温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux。接种培养20天后测定藜蒿不定芽生长量。结果见表1。所述的每个处理的培养基中接种外植体150株。表1藜蒿不定芽继代专用培养基中ms用量优选结果从表1可以看出，1/4ms的藜蒿不定芽继代培养基、1/3ms藜蒿不定芽继代培养基、1/2ms藜蒿不定芽继代培养基与对照ms藜蒿不定芽继代培养基相比，培养藜蒿外植体20天后，不定芽的平均生长量都没有明显差异。1/5ms的藜蒿不定芽继代培养基较对照组不定芽的平均生长量减少0.7cm。实验例2优选藜蒿不定芽继代专用培养基中基础培养基的苦瓜用量按苦瓜的添加量设置100g/l、150g/l、200g/l、250g/l、300g/l五种处理，以不加苦瓜为对照，以ms藜蒿不定芽继代培养基进行培养，用纯净水配制培养基。配制培养基时，按照不同苦瓜添加量，依次加入6-ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l，分别配制成：(1)苦瓜含量100g/l的藜蒿不定芽继代培养基；(2)苦瓜含量150g/l的藜蒿不定芽继代培养基；(3)200g/l的藜蒿不定芽继代的培养基；(4)苦瓜含量250g/l的藜蒿不定芽继代培养基；(5)苦瓜含量300g/l的藜蒿不定芽继代培养基；(6)对照ck1为未灭菌、不含苦瓜的藜蒿不定芽继代培养基；(7)对照ck2为灭菌、不含苦瓜的藜蒿不定芽继代培养基，灭菌条件：121℃、0.11mpa条、20min。各培养基的ph值为5.8。。以阳新湖蒿不定芽为外植体，接种到不同处理的培养基中进行培养，三次重复。培养条件为：温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux。接种培养20天后测定藜蒿不定芽生长量和培养基染菌率。所述的每个处理的培养基中接种外植体150株。结果见表2。表2藜蒿不定芽继代专用培养基中苦瓜用量优选结果从表2可以看出，处理苦瓜用量100g/l，培养基染菌率为12.67％，受污染的影响，不定芽生长量较少，仅为4.5cm；处理苦瓜用量150～300g/l，各处理培养基都没有污染，染菌率均为0，但不定芽生长量存在差异，其中：处理苦瓜用量200g//l和处理苦瓜用量250g//l的不定芽生长量较优；处理苦瓜用量150g//l的不定芽生长量次之，不定芽生长量与对照ck1(培养基不含苦瓜，常规灭菌)接近；处理苦瓜用量300g/l，不定芽生长量明显低于对照ck1，这可能是苦瓜含量过高对不定芽的抑制作用所致。与对照ck1(培养基不含苦瓜，灭菌)相比，苦瓜含量量为200～250g/l时，各处理不定芽生长量都明显优于ck1。然而ck2由于未添加具有杀菌作用的苦瓜，也未进行灭菌，培养基中含有的菌与藜蒿外植体进行竞争生长，导致不定芽平均生长量大大降低。表明一定量的苦瓜与ms培养基配合使用，不仅能够防止培养基污染，而且对不定芽生长具有增效作用。实验例3纯净水和自来水配制藜蒿不定芽继代专用培养基的培养效果比较分别采用纯净水和自来水配制藜蒿不定芽继代培养基，培养基组分为：ms培养基、ba0.02mg/l、naa0.02mg/l、蔗糖25g/l、琼脂6.5g/l。培养基ph值都为5.8。分别将两种培养基置于121℃、0.15mpa条件下高温湿热灭菌处理20min。以阳新湖蒿不定芽为外植体，接种到不同处理的培养基中进行培养，三次重复。培养条件为：温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux。接种培养20天后，比较用纯净水制备的培养基和用自来水制备的培养基藜蒿不定芽伸长生长量和长势。结果见3。所述的每个处理的培养基中接种外植体150株。表3自来水和纯净水配制藜蒿不定芽继代培养的效果比较处理组不定芽平均生长量(cm)不定芽生长状态自来水5.3叶片舒展，嫩茎壮实纯净水5.3叶片舒展，茎杆壮实从表3可以看出，用自来水和纯净水制备的培养基，藜蒿不定芽的继代培养效果没有明显差异，从成本考虑，用自来水更为经济。实验例4藜蒿不定芽继代专用培养基中ms用量与苦瓜用量配比优化实验根据实验例1～3的试验结果，本实验按照藜蒿不定芽继代培养中ms用量选取1/4ms、1/3ms、1/2ms3个水平和苦瓜用量选取150g/l、200g/l、250g/l3个水平，进行配合试验，筛选藜蒿不定芽继代专用培养基中ms用量与苦瓜用量最优配比，三次重复，用自来水配制培养基。培养基的ph都设置为5.8。培养基免灭菌。以阳新湖蒿不定芽为外植体，接种到不同处理的培养基中进行培养，每个处理的培养基中接种外植体150株。培养条件为：温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux。接种培养20天后测定不定芽生长量，比较各处理中培养基的污染情况及藜蒿不定芽伸长生长量。结果见表4。表4ms用量与苦瓜用量配比藜蒿不定芽继代优选效果比较结果显示，处理5和处理6组以1/3ms的用量与苦瓜200～250g/l的用量进行配比培养得到的藜蒿不定芽的长度最长，较表1不加苦瓜单独的1/3ms配制成的藜蒿不定芽继代培养基培养的藜蒿不定芽的长度的5.1cm，增加了1cm以上的长度，增加18.9％。实施例1一种藜蒿不定芽继代的专用培养基，其组成为：1/3ms培养基、200g/l苦瓜、0.01mg/l6-ba、0.02mg/lnaa、30g/l蔗糖、7g/l琼脂。按照如下方法配制成藜蒿不定芽继代的专用培养基5l。(1)取新鲜老熟的苦瓜，用自来水洗净后，去籽，切碎，称量800g，置于带有4l自来水的钢精锅内，电磁炉上煮沸到100℃后，连续再煮17min，至苦瓜烂熟；(2)待冷却至50℃时，用普通纱布过虑，收集滤液，得到苦瓜汁；(3)将0.05mg的6-ba、0.15mg的naa加入到1/3ms培养基中，得到具有生长调节功能的基础培养基；(4)将苦瓜汁、具有生长调节功能的基础培养基与150g蔗糖和35g琼脂混合后，自来水定容至5l，加热煮沸到100℃，连续再煮沸3min，直至琼脂融化，调节ph至5.6，得到藜蒿不定芽继代培养的专用培养基。将藜蒿不定芽继代的专用培养基放冷至40℃时，立刻分装到50个干净的组培瓶中。以阳新湖蒿不定芽为外植体，每个组培瓶中接种10个外植体，以温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux进行培养。接种后定期观察不定芽生长和培养基染菌情况，接种后定期观察不定芽生长情况，培养20天后测定不定芽生长量，统计培养基污染率，比较培养成本。结果见表5。实施例2一种藜蒿不定芽继代的专用培养基，其组成为：1/3ms培养基、250g/l苦瓜、0.02mg/l6-ba、0.02mg/lnaa、25g/l蔗糖、6g/l琼脂。按照如下方法配制成藜蒿不定芽继代的专用培养基10l。(1)取新鲜老熟的苦瓜，用自来水洗净后，去籽，切碎，称量2500g，置于带有7l自来水的钢精锅内，电磁炉上煮沸到100℃后，连续再煮13min，至苦瓜烂熟；(2)待冷却至40℃时，用普通纱布过虑，收集滤液，得到苦瓜汁；(3)将0.2mg的6-ba、0.2mg的naa加入到1/3ms培养基中，得到具有生长调节功能的基础培养基；(4)将苦瓜汁、具有生长调节功能的基础培养基与250g蔗糖和60g琼脂混合后，自来水定容至10l，加热煮沸到100℃，连续再煮沸7min，直至琼脂融化，调节ph至6.0，得到藜蒿不定芽继代培养的专用培养基。将藜蒿不定芽继代培养的专用培养基放冷至45℃时，赶紧分装到100个干净的组培瓶中。以阳新湖蒿不定芽为外植体，每个组培瓶中接种10个外植体，以温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux进行培养。接种后定期观察不定芽生长和培养基染菌情况，接种后定期观察不定芽生长情况，培养20天后测定不定芽生长量，统计培养基污染率，比较培养成本。结果见表5。实施例3一种藜蒿不定芽继代的专用培养基，其组成为：1/3ms培养基、225g/l苦瓜、0.03mg/l6-ba、0.01mg/lnaa、20g/l蔗糖、6.5g/l琼脂。按照如下方法配制成藜蒿不定芽继代的专用培养基20l。(1)取新鲜老熟的苦瓜，用自来水洗净后，去籽，切碎，称量4500g，置于带有12l自来水的钢精锅内，电磁炉上煮沸到100℃后，连续再煮15min，至苦瓜烂熟；(2)待冷却至50℃时，用普通纱布过虑，收集滤液，得到苦瓜汁；(3)将0.6mg的6-ba、0.2mg的naa加入到1/3ms基本培养基中，得到具有生长调节功能的基础培养基；(4)将苦瓜汁、具有生长调节功能的基础培养基与400g蔗糖和130g琼脂混合后，自来水定容至20l，加热煮沸到100℃，连续再煮沸5min，直至琼脂融化，调节ph至5.8，得到藜蒿不定芽继代培养的专用培养基。将藜蒿不定芽继代培养的专用培养基放冷至50℃时，赶紧分装到200个干净的组培瓶中。以阳新湖蒿不定芽为外植体，每个组培瓶中接种10个外植体，以温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux进行培养。接种后定期观察不定芽生长和培养基染菌情况，接种后定期观察不定芽生长情况，培养20天后测定不定芽生长量，统计培养基污染率，比较培养成本。结果见表5。对比例1以为改进的藜蒿不定芽继代培养基为对照，其组成为：ms基本培养基、0.02mg/l6-ba、0.02mg/lnaa、25g/l蔗糖、6.5g/l琼脂、自来水组成。采用上述组分，配制藜蒿不定芽继代培养基10l，调节至ph5.8，采用121℃、0.13mpa对培养基进行高热湿热灭菌20min后得到对比例的培养基。灭菌完成后的培养基放冷至45℃后，分装至100个干净的组培瓶中，以阳新湖蒿不定芽为外植体，每个组培瓶中接种10个外植体，以温度25±2℃、湿度75％、光照时数14小时/昼夜、光照强度3000lux进行培养。接种后定期观察不定芽生长和培养基染菌情况，接种后定期观察不定芽生长情况，培养20天后测定不定芽生长量，统计培养基污染率，比较培养成本。结果见表5。表5藜蒿不定芽继代培养的专用培养基的培养效果从表5可以看出，实施例1～3的培养基用于培育藜蒿不定芽20天后，染菌率为0与对比例1经过高压高湿灭菌后的染菌率相当；芽的平均生长和成苗率也与对比例1的培养基的生长相当。但是每株外植体的培养成本较对比例1每株的培养成本减少54.8％。由以上实施例可以看出，本发明的专用培养基以及制备方法与现有技术相比具有以下优点：(1)培养基免灭菌，利用本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基，不经过灭菌也能达到培养基灭菌后同样的灭菌效果，培养20天后培养基染菌率均为0。(2)生产成本降低，本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基中，基础培养基用1/3ms培养基加入苦瓜代替ms培养基，用自来水代替纯水制备培养基，以及减少培养基灭菌设施和能源的投入，组培苗生产成本降低54.8％。(3)简化操作程序，本发明培养基制备过程中省去了灭菌环节，组培苗生产工序明显简化。(4)促进不定芽生长。利用本发明制备藜蒿不定芽继代的专用培养基，不定芽生长量比对照灭菌、不加苦瓜的ms培养基增加了1cm，增加18.9％。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12