专利名称：减少水培中细菌沾染的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过用杀菌剂处理活的饲用生物体来减少水培中加入这些生物体引起的细菌沾染的方法。
在实践中，使用例如轮虫和随后的卤虫幼体作为供水培的活的饲用生物体，更具体地说作为早期海生幼虫饲养中的活的饲料。已经知道在实践中这些卤虫幼体尤其被孵化过程中繁殖旺盛的细菌严重沾染，可达大于107/g湿重的量。由于这种细菌菌群主要由弧菌属的种(潜在的鱼/虾病原体)组成，可以认为卤虫幼体是可能的病原菌携带者，这种细菌在幼虫培养中，尤其当幼虫受胁迫时能引起疾病/死亡爆发。
进行了某些研究以使用化疗剂(尤其是使用抗生素)减少细菌的荷载。然而，由于细菌抗性的危险性，应该避免使用抗生素。另一方面，发现其它广谱化疗剂(如作为例子的二氧化氯)对活的饲用生物体自身十分有害。
因此本发明的目的是提供一种新的方法，其中的细菌沾染可被有效地减少而不抑制饲用生物体的生长。
由此，按照本发明的方法的特征在于所说的饲用生物体用杀菌的异噻唑啉衍生物处理。
已经发现使用杀菌的异噻唑啉衍生物可使细菌(尤其是弧菌)的数目显著地减少而对饲用生物体无副作用。
已知预期使用的异噻唑啉衍生物原来已作为抗生剂用于例如啤酒厂灭菌输送管道等。关于包含在此类杀菌的异噻唑啉衍生物内的化合物，参照GB-A-1,224,661；US-A-3,523,121；US-3,761,488和US-A-4,150,026(这些文献包含的本文中作为参考文献)。
异噻唑啉衍生物优选的是4-异噻唑啉-3-酮衍生物。
本发明还涉及用杀菌剂处理的供水培的活的饲用生物体的孢囊。按照本发明，所说的孢囊(尤其是卤虫孢囊)用杀菌的异噻唑啉衍生物包裹。
本发明也涉及制备供水培的活的饲用生物体的富集培养基的富集产物。这种富集产物的特征在于它包含有效剂量的杀菌的异噻唑啉衍生物，这种剂量的衍生物可减少在所说的富集培养基中细菌的生长。
从下列按照本发明的方法、孢囊和富集产物的某些具体实施方案的描述，会明显看出本发明的另外的优点和特征。
按照本发明的方法预期通过减少与活的饲用生物体有关的细菌数量来抑制水培中的细菌沾染。这些活的饲用生物体如轮虫和卤虫，但其它的活的饲用生物体也可考虑在内。在下面部分中，尤其涉及卤虫。活的饲用生物体可以用于各种水培，尤其用于甲壳纲、软体动物门和鱼类的培养。
按照本发明，活的饲用生物体用杀菌的异噻唑啉衍生物处理。这些异噻唑啉衍生物先前是已知的。为了本发明特定的应用，应基于抗与活的饲用生物体有关的细菌以及它们对活的饲用生物体的可能作用进行选择。
杀菌的异噻唑啉衍生物的优选类型是4-异噻唑啉-3-酮衍生物。尤其优选的是5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮或这两种化合物的组合。异噻唑啉衍生物也可以以如US-A-4,150,026中所述的金属盐复合物使用。
当卤虫用作供水培的活的饲用生物体时是作为孢囊出售的。这些孢囊在孵化培养基中孵化，如在海水中28℃下孵化约24小时，通常在随后在富集培养基中进一步用维生素、脂肪酸等富集，也进行大约24小时。然后富集的卤虫幼体能够用作供水培的活的生物体。
在按照本发明的具体实施方案的方法中，把有效浓度的异噻唑啉衍生物加入生长培养基(即孵化培养基中)中和在将此衍生物用于富集培养基中时，能够减少其中细菌的生长。事实上，已经观察到细菌(包括可能的病原菌，如弧菌属的种)在这些培养基中生长得很好。
为抑制孵化培养基中的细菌沾染，可以直接向其中加入杀菌的异噻唑啉衍生物。
然而，在一个优选的实施方案中，异噻唑啉衍生物粘附到卤虫孢囊上，其数量达到孵化培养基中所需的有效浓度。在这方面，已经发现使用这种灭菌过程的孢囊可以保存几个月而对孵化效率和抗菌活性无任何副作用。
为抑制富集培养基中的细菌沾染，如果使用这种培养基，最好首先洗涤活的饲用生物体。按照本发明，也以减少其中细菌生长有效的量进一步把杀菌的异噻唑啉衍生物加入到富集培养基中。
在一个优选的实施方案中，杀菌异噻唑啉衍生物包含在制备富集培养基的富集产物中。这类富集产物包含如维生素和脂肪酸，尤其是浓缩的乳剂形式。它的一个例子是来自比利时卤虫系统S.A.的商品富集乳剂SuperSelco。
在两种生长培养基(即孵化培养基和富集培养基)中，优选地加入异噻唑啉衍生物直到浓度达到1-7ppm。这种浓度更优选的是1.5-4ppm，使用约2ppm的浓度可获得良好的结果。然而对于轮虫，使用更低的浓度可能是必需的。
下列实施例证明了通过按照本发明的方法(尤其是使用按照本发明的孢囊和富集产物)所获得的对活的饲用生物体的细菌沾染的作用。
实施例1000g的卤虫孢囊(GSL-菌株)用7.5g从S.A.SOPURA N.V.买到的Pastosept包裹，Pastosept包含5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(10.4％)和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(3.5％)。孢囊干燥到5-8％的湿度含量后，真空包裹，在4℃下保存。一批相同的孢囊作为对照。
在不同的时间间隔，即分别在2、4、8和12周后，处理的和对照的孢囊都在标准的条件下孵化，即在28℃下海水中孵化24小时。更具体地说，把2g孢囊加到1升海水中。24小时后收获幼体，用孵化培养基的样品和提取漂洗的幼体测定海琼脂(MA，Difco)上的总量和TCBS(Oxoid)上的弧菌属种的量。同时测定孵化效率(幼体的数目/g)。
为试验富集过程中的抗菌活性，灭菌组和对照组的孵化幼体转移到富集箱中，用商品富集乳剂SuperSelco(比利时卤虫系统S.A.)富集。处理的Selco包含30g/l Pastosept，稀释2000倍得到富集培养基。24小时后，漂洗幼体并取样进行细菌学和脂类分析。
表1卤虫孢囊(对照和处理)温育24小时后和用SuperSelco(对照和处理)富集24小时后MA1和TCBS2上的CFU/g或/ml数目
1海琼脂-海细菌生长的普通培养基2TCBS-弧菌属的一个种生长的特异性培养基3N＝以CUF/g幼体表示的数目4HW＝以CUF/ml孵化水表示的数目5EW＝以CUF/ml富集水表示的数目接受灭菌过程的卤虫孢囊孵化成与对照幼体比较沾染较少的幼体中。24小时后，对照幼体包含多达106-107个细菌/g，而在灭菌的幼体中总数目减少到103-104个细菌/g。弧菌属的种的减少甚至更剧烈(表1)。
这种不同在孵化水中是也是清晰可见的孵化24小时后，由于细菌的生长孵化水有一定的浊度，进行灭菌后水完全澄清。
当考虑细菌数量的变化是时间的函数时，很明显，在4℃下3个月的贮存期数目没有发生大的变化。如在
图1中看到的，那段时期后抗菌活性仍存在。此图显示了细菌数目的变化作为4℃下处理和保存期的函数。对照和灭菌的孢囊之间在孵化效率上没有明显的差别。当富集过程中也应用灭菌处理时，可观察到类似的细菌数目的减少。富集24小时后，在幼体上仍有100到1000倍的减少(表1)。这导致更“干净者”富集而在箱壁上没有粘液形成。
脂类分析表明在处理的和对照的卤虫中，高级不饱和脂肪酸的富集水平是相同的。从本实施例可以得出在卤虫孵化和富集过程中灭菌操作的使用导致幼体的细菌沾染(尤其弧菌属的种)显著减少。这意味着潜在的鱼类病原体通过活的饲料转移到捕食者的机会也减少。
接受灭菌操作的孢囊可以保存几个月而对孵化效率和抗菌活性无任何副作用。
在以前的用海鲈幼虫的饲喂实验中，饲喂灭菌的卤虫的效果使用存活、生长和胁迫抗性作为标准评价。没有表现出副作用。
很清楚，本发明并不限于以上所述的实施方案，而是可以使用一些在本发明范围内的改良方法。
就此而言，应该注意到，在某些情况中优选的是只向富集培养基加入杀菌的异噻唑啉衍生物，而不用它包裹卤虫孢囊。
权利要求
1.一种通过用杀菌剂处理活的饲用生物体来减少由于在水培中加入该生物体引起的细菌沾染的方法，其特征在于用杀菌的异噻唑啉衍生物处理所说的活的饲用生物体。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于在所说的活的饲用生物体加入所说的水培中之前，在生长培养基中，在减少其中细菌生长有效浓度的所说杀菌异噻唑啉衍生物存在下培养该生物体。
3.按照权利要求2的方法，其特征在于在加入了所说的杀菌的异噻唑啉衍生物的孵化培养基中从孢囊培养所说的活的饲用生物体。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于以达到孵化培养基中所说的有效剂量的量将所说的异噻唑啉衍生物粘附到所说的孢囊上。
5.按照权利要求2或3的方法，其特征在于所说的有效剂量在1至7ppm之间，优选地在1.5至4ppm之间，更具体地说是大约2ppm。
6.按照权利要求2到5任一之方法，其特征在于将所说的活的饲用生物体在富集培养基中进一步富集，在此培养基中以减少其中细菌生长有效的量加入所说的杀菌的异噻唑啉衍生物。
7.按照权利要求6的方法，其特征在于将杀菌的异噻唑啉衍生物包含在用于制备所说的富集培养基的富集产物中。
8.按照权利要求1至7任一之方法，其特征在于所说的异噻唑啉衍生物是4-异噻唑啉-3-酮的衍生物。
9.按照权利要求8的方法，其特征在于所说的异噻唑啉衍生物包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和/或2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
10.用杀菌剂处理的供水培的活的生物体的孢囊，其特征在于所说的孢囊用杀菌的异噻唑啉衍生物包裹。
11.按照权利要求10的胞囊，其特征在于所说的孢囊是卤虫孢囊。
12.按照权利要求10或11的孢囊，其特征在于所说的孢囊用有效量的所说异噻唑啉衍生物包裹，以在孵化培养基中达到所述衍生物的减少其中细菌生长的有效浓度。
13.用于制备供水培的活的饲用生物体的富集培养基的富集产物，其特征在于所说的富集产物包含减少所说富集培养基中细菌生长有效量的杀菌的异噻唑啉衍生物。
全文摘要
在按照本发明的方法中，用杀菌的异噻唑啉衍生物处理供水培的活的饲用生物体(如轮虫，尤其是卤虫)以减少细菌沾染。所述异噻唑啉衍生物优选的是4-异噻唑啉-3-酮衍生物，尤其是5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和/或2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮衍生物。这类衍生物可以加到活的生物体的生长培养基中或包裹在生物体的孢囊上和/或包含在制备富集培养基的富集产物中。本发明也涉及用所述杀菌的异噻唑啉衍生物包裹的活的饲用生物体的孢囊和包含这类衍生物的富集产物。
文档编号A23K1/18GK1164176SQ95196358
公开日1997年11月5日 申请日期1995年10月20日 优先权日1994年10月21日
发明者M·德哈斯魁, B·德维里瑟, P·里格尔, P·索格洛斯 申请人:英弗水培公司