一种快速得到纤用大麻再生植株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速得到纤用大麻再生植株的方法。
【背景技术】
[0002] 大麻（Cg/zaaAis L.)是大麻科（Cannabinaceace)大麻属（Cannabis) -年 生草本植物，在我国有数千年的种植利用历史。大麻浑身是宝，既能生产优质的纺织纤维， 在食品、药用和建材工业等方面也有巨大应用价值。大麻根据其四氢大麻酚（THC)含量分为 毒品大麻、中间型大麻和纤用大麻三种，我国是纤用大麻种植大国，种植面积占世界的30% 左右。
[0003] 由于上世纪很多国家禁止种植一切大麻，导致许多珍贵种质资源遗失，对大麻的 研宄也远远落后于其他经济作物。而且，大麻是雌雄异株的常异花授粉作物，种质杂合度 高。使用常规的系统育种方法进行品种选育和改良进展缓慢。基因工程技术是植物育种 中普遍应用的方法，但要获得目标性状改良的转基因植物，建立一个高效的再生体系是前 提。
[0004] 在大麻再生体系研宄中，外植体的选择十分重要。现有技术主要受制于外植体的 选择，目前用于大麻再生的外植体有茎尖、带节茎段、下胚轴、叶片，这些材料的取材周期和 便捷性受到限制。选用大田采摘的实生苗的茎尖、茎段等作为外植体，将受到生长季节和消 毒程序繁琐的限制〔参见尹品训，杨明，郭鸿彦，刘振博，胡学礼，陈裕，大麻的离体培养 与快速繁殖[J].西南农业学报.2005(04)〕。选用种子消毒后(未去种皮)播种产生的无菌 苗的茎尖、下胚轴、带节茎段作为外植体，从播种到无菌苗长大到适宜取材时期，需要15-20 天，影响实验周期的紧密性〔参见张利国，宋宪友，房郁妍，郑楠，吴广文.大麻新品种龙 大麻一号再生体系初探[J].中国麻业科学.2012(03)〕。申请号为200610088353.7的中 国专利申请，将种子消毒后接种于培养基，20天后才能获得茎尖外植体，30天后获得侧芽， 培养周期较长。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是，克服现有技术的不足，提供一种周期较短，操作方便 的快速得到纤用大麻再生植株的方法。
[0006] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种快速得到纤用大麻再生植株的方 法，包括如下步骤： (1) 将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗； 参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研宄[J]. 中国麻业科学.2011(01); (2) 在超净工作台上，将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下（不宜切下，否 则会影响再生频率)，切去叶尖，正置于含噻苯隆（TDZ)和α -萘乙酸（NAA)的芽诱导培 养基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养基，噻苯隆浓度为0. 1-0. 2mg/L， α -萘乙酸浓度为0· 01-0. 05mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂（6-7) g/L，ρΗ5· 5-6. 0,光照强度 2200-26001χ，光照时间14-16h/d，温度24±2°C，培养时间为18-24天； (3)经步骤（2)培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含 有吲哚丁酸（IBA)的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS (即MS营养物质减 半）基础培养基，其中吲哚丁酸（IBA)浓度为0. 3-0. 5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂（6-7) g/ L，pH5. 5-6. 0,光照强度2200-26001x，光照时间14-16h/d，温度24±2°C;培养时间为35-42 天，得到生根小苗。
[0007] 所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。
[0008] 进一步，步骤（2)中，所述去尖子叶优选为1/2子叶。
[0009] 本发明所指"大麻"，均为纤用大麻，其四氢大麻酚（THC)质量含量〈0. 3%。
[0010] 本发明的方法特别适用纤用大麻品种，再生植株诱导率为46%-48%。
[0011] 本发明基于种子的消毒、剥皮处理，第一次提出用子叶作为外植体建立再生体系， 可以便捷、快速地得到再生植株。使用2天苗龄或3天苗龄的无菌苗子叶作为外植体，这些 外植体为无菌状态，生长势均一，可在28天内得到大量再生芽，可比原有方法减少实验周 期7-14天，这可为将来的遗传转化工作提供很大的便利。
[0012] 本发明采用2天苗龄或3天苗龄无菌苗的子叶作为外植体，从播种到获得子叶只 需要3天时间，子叶再生频率达到46%-48%，可以快速、便捷地得到再生植株。
[0013] 采用本发明，外植体取材方便、快捷，获得子叶外植体，只需要3天，获得健壮的再 生丛芽，只需要18-24天，周期短，并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过 程等因素的制约，非常适合用于遗传转化研宄。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明实施例1所得3天苗龄的大麻无菌苗图； 图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图； 图3是本发明实施例1子叶基部长出的丛生芽图； 图4是本发明实施例1丛生芽伸长图； 图5是本发明实施例1再生植株生根图； 图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
[0016] 实施例1 本实施例之快速得到纤用大麻再生植株的方法，包括如下步骤： (1) 将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗； 参见程超华，李育君，赵立宁，唐蜻，臧巩固，三重处理法获得大麻种子无菌苗研宄[J]. 中国麻业科学.2011(01); (2) 在超净工作台上，将子叶从3天苗龄的无菌苗上撕下（不宜切下，否则会影响再生 频率)，切去叶尖，留下1/2子叶，正置于含噻苯隆（TDZ)和α-萘乙酸（NAA)的芽诱导培养 基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养基，噻苯隆浓度为0. 2mg/L，α -萘乙 酸浓度为0. 〇5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，pH5. 8,光照强度23001X，光照时间16h/ d，温度24 ±2 °C，培养时间为20天； (3)经步骤（2)培养20天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有 吲哚丁酸（IBA)的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS (即MS营养物质减半） 基础培养基，其中吲哚丁酸（IBA)浓度为0. 5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂6. 5g/L，pH5. 8,光 照强度23001x，光照时间16h/d，温度24±2°C ;培养时间为35天，得到生根小苗。
[0017] 所得到的生根小苗按常规方法移植栽培。图1是本发明实施例1所得3天苗龄的 大麻无菌苗图；图2是本发明实施例1用作外植体的1/2子叶图；图3是本发明实施例1子 叶基部长出丛生芽图；图4是本发明实施例1丛生芽伸长图；图5是本发明实施例1再生植 株生根图；图6是本发明实施例1再生植株移栽成活图。说明采用本发明，可以顺利的得到 外植体，产生再生植株，并且生根移栽成活。
[0018] 本实施例中，外植体取材方便、快捷，获得子叶外植体，只需要3天，获得健壮的再 生丛芽，只需要20天，周期短，并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过程等 因素的制约，非常适合用于遗传转化研宄。
[0019] 实施例2 分别选取2天、4天、5天、6天苗龄的无菌苗，将子叶撕下进行处理，其他处理步骤同实 施例1。采用2 - 6天不同苗龄外植体的再生频率结果见表1中。可见采用2天、3天苗龄 外植体更适合。
[0020] 表1不同苗龄外植体的再生频率_ 对照例
【主权项】
1. 一种快速得到纤用大麻再生植株的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗； (2) 在超净工作台上，将子叶从2天苗龄或3天苗龄的无菌苗上撕下，切去叶尖，正置于 含噻苯隆和a-萘乙酸的芽诱导培养基上培养出不定芽；所述芽诱导培养基为MS基础培养 基，噻苯隆浓度为0. 1-0. 2mg/L，a-萘乙酸浓度为〇. 01-0. 〇5mg/L，附加蔗糖30g/L，琼脂 6-7g/L，pH5. 5-6. 0,光照强度2200-26001x，光照时间14-16h/d，温度24±2°C，培养时间为 18-24 天； (3) 经步骤（2)培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含 有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根，所述生根培养基为1/2MS基础培养基，其中吲哚丁 酸浓度为 〇? 3-0. 5mg/L，附加蔗糖 30g/L，琼脂 6-7g/L，pH5. 5-6. 0,光照强度 2200-26001x， 光照时间14-16h/d，温度24±2°C;培养时间为35-42天，得到生根小苗。
2. 根据权利要求1所述的快速得到纤用大麻再生植株的方法，其特征在于，步骤（2) 中，所述去尖子叶为1/2子叶。
【专利摘要】一种快速得到纤用大麻再生植株的方法，包括如下步骤：（1）将纤用大麻种子经无菌处理、播种得到无菌苗；（2）从2-3天苗龄的无菌苗上撕取子叶，切去叶尖，正置于含噻苯隆和α-萘乙酸的芽诱导培养基上培养；（3）经步骤（2）培养18-24天后，待不定芽伸长至1-2厘米高时，将不定芽切下，转到含有吲哚丁酸的生根培养基上培养生根，培养时间为35-42天，得到生根小苗。采用本发明，外植体取材方便、快捷，周期短，诱导再生率较高，获得子叶外植体，只需要3天；获得健壮的再生丛芽，只需要18-24天。并且随时可以播种、获取外植体，不受取材季节、消毒过程等因素的制约，适用于大麻遗传转化研究。
【IPC分类】A01H4-00
【公开号】CN104782502
【申请号】CN201510238469
【发明人】程超华, 臧巩固, 赵立宁, 高春生, 唐蜻, 李育君, 范志芳
【申请人】中国农业科学院麻类研究所
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月12日