一种铁皮石斛化学消毒组培方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种植物组织培养方法，具体涉及一种铁皮石斛化学消毒组培方法， 属生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科气生草本植物，又名 黑节草，为石斛之极品，具有独特的药用价值，铁皮石斛生长环境特殊及其自我繁殖能力较 为低下，加之人们的过度采挖，造成其野生资源日趋减少甚至濒临绝种，因此通过组织培养 技术，对铁皮石斛进行集约化人工栽培，是保护和利用铁皮石斛资源的必要途径。建立高 效的铁皮石斛组织快繁体系成为解决种苗问题，推进铁皮石斛良性发展的有效途径。
[0003]采用铁皮石斛的茎段进行丛生芽的诱导培养，具有取材易、繁殖系数高、遗传变异 率低、繁殖速度快等优点，能在较短时间内为商业栽培提供大量标准化优良种苗。实现铁皮 石斛的商业栽培不但为种植者创造丰厚的经济效益，还一定程度上对保护野生资源和生态 环境具有重要意义。
[0004] 铁皮石斛组织培养，一方面可以扩大其繁殖系数，从而实现规模化繁殖；另一方 面，可以在保存其原有的优良性状的基础上，实现铁皮石斛的种质资源保存和转基因研宄 等。铁皮石斛组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备、供电成本、耗 材和人工成本。常规的铁皮石斛组织培养方法要求外植体接种在高温高压灭菌后的无菌培 养基中才能正常生长，耗能大，人工操作成本高。如果能通过化学消毒的方法来改造培养 基，使培养基在不需要进行高温高压灭菌，就能够获得铁皮石斛的正常生长。这样，一方面 可以降低铁皮石斛组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压 锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用这种培养基开展铁皮 石斛组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外， 由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，能有效控制组织培养过程中的污染 问题，又不会对铁皮石斛生长产生毒害或抑制，即不影响铁皮石斛的正常生长，从根本上简 化了铁皮石斛组织培养。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种铁皮石斛化学消毒组培方法。
[0006]本发明的目的是通过以下技术方案实现的。
[0007] 本发明的一种铁皮石斛化学消毒组培方法，包括培养容器消毒、培养基配制、诱导 培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
[0008] 1.培养容器消毒：将培养瓶瓶盖及接种用的不锈钢盘在100mg/L次氯酸钠+IOmg/ L乳酸链球菌素+100mg/L丙酸钙的水溶液中浸泡不少于10h，保存备用；
[0009] 2.培养基配制：诱导培养基为MS+1~3mg/L6-BA+0. 1~I. 0mg/LNAA+40~ 100mg/L次氯酸钠+1~5mg/L乳酸链球菌素+10~50mg/L丙酸1? +20g/L鹿糖+3. 0g/L琼 脂粉，pH5. 8 ;增殖培养基为：MS+1.O~2mg/L6-BA+O. 1~I.Omg/LNAA+40~lOOmg/L次氯 酸钠+1~5mg/L乳酸链球菌素+10~50mg/L丙酸1? +20g/L鹿糖+3.Og/L琼脂粉，pH5. 8 ; 壮苗培养基为 MS+0. 1~0? 5mg/L6-BA+0. 5~I.Omg/LNAA+40~100mg/L次氯酸钠+1~ 5mg/L乳酸链球菌素+10~50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.Og/L琼脂粉，pH5. 8 ;生根培养 基为1/2MS+0. 5~I. 5mg/LNAA+40~100mg/L次氣酸纳+1~5mg/L乳酸链球菌素+10~ 50mg/L丙酸钙+20g/L蔗糖+3.Og/L琼脂粉，pH5. 8 ;所述MS培养基为1962年，Murashige 和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述NAA，指^-萘乙酸；配制培 养基时，先称各培养基配方中蔗糖和琼脂粉，加培养基总体积1/2的自来水，加热至琼脂粉 完全溶解，再按各培养基配方配齐其他原料后，定容、然后用lmol/L的NaOH或lmol/L的 HCl调pH值至5. 8,分装到消毒过的培养容器中，封口，冷却凝固后备用；
[0010] 3.诱导培养：取健壮的铁皮石斛茎段，剪除叶、根，洗净后在无菌操作台上切成带 有莖节的1~2cm小段，于体积比为75%酒精中浸20s，然后在重量比为0. 1 %升采溶液中 消毒10~20min，取出用无菌水冲洗3次后，接种于诱导培养基上，培养40d后出现黄绿色 斑点，60d后斑点变绿出现小芽；培养室温度为26°C，光照12h，光照强度为14001x ;
[0011] 4.增殖培养：将诱导培养的小芽转入增殖培养基中，每30d转接一次，大量增殖丛 生芽；培养室温度为26°C，光照12h，光照强度为14001x ;
[0012] 5.壮苗培养：将增殖培养的丛生芽接种到壮苗培养基上，培养30d成为丛生芽苗； 培养室温度为26°C，光照12h，光照强度为14001x ;
[0013] 6.生根培养：取壮苗培养的高度为4~6cm的丛生芽苗，切成单株，接种到生根培 养基上，25d后形成完整植株；培养室温度为25°C，光照12h，光照强度为15001x ;
[0014] 7.瓶苗移栽：将生根培养获得的完整植株取出，洗净根部的培养基，用800倍的多 菌灵浸泡30min后移栽至铁皮石斛的栽培基质，所述栽培基质，指含有占基质体积为1/2的 发酵后的花生壳、或发酵后的松树皮（或泥炭、或锯末、或上述各原料的混合物，以及占基 质体积1/2的碎石、珍珠岩，然后，在基质表面覆以苔藓；大棚上层用遮光网遮盖，移栽的环 境温度为15~30 °C。
[0015] 本发明的应用效果：
[0016] 由于本发明的化学消毒组培方法，利用化学试剂添加到各种培养基中，达到灭菌 或抑菌的效果。所以，配制的培养基无需高温高压灭菌。因此，在铁皮石斛诱导培养、增殖 培养、壮苗培养、生根培养各个阶段的影响，除了要考虑常用的评价指标外，还要考虑污染 率的问题。
[0017] 1.诱导培养：通过实验证实，本发明的一种铁皮石斛的化学消毒组培方法与常规 的铁皮石斛组培方法比较，结果如表1所示，诱导培养阶段的外植体培养的成活率和污染 率都没有太大差异。
[0018] 表1本发明的化学消毒组培方法对铁皮石斛诱导培养的影响
[0019]
[0020] 2.增殖培养：本发明的化学消毒组培方法与常规组培铁皮石斛的增殖倍数和污 染率的比较，结果如表2所示，增殖倍数和污染率二个指标都没有显著差异。
[0021] 表2本发明的化学消毒组培方法对铁皮石斛增殖倍数和污染率的影响
[0022]
[0023] 3.壮苗培养：壮苗培养的试验结果如表3所示，本发明的铁皮石斛化学消毒组培 方法的每瓶平均壮苗数明显高于常规的铁皮石斛组培方法，瓶苗也更壮、更绿。在污染率方 面没有差异。
[0024] 表3本发明的化学消毒组培方法对铁皮石斛壮苗数和污染率的影响
[0025]
[0026] *苗高大于5cm的瓶苗为壮苗。
[0027] 4本发明的化学消毒组培方法对铁皮石斛生根率和污染率的影响：在生根过程 中，本发明的化学消毒组培方法与常规的铁皮石斛组培方法相比，结果如表4所示，生根率 和污染率都没有差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的方法，铁皮石斛组培苗茎更粗，叶 片更大。
[0028] 表4本发明的化学消毒组培方法的铁皮石斛瓶苗生根情况
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[0030] 5.成本分析：本发明的化学消毒组培方法与常规组培的成本分析见表5。
[0031] 本发明组培省去了高压灭菌环节，简化了组培程序，提高了工作效率。从可以直 接计算出来的费用来算，每年可以节约5万元左右（以每天配制50L培养基计算）。另外， 还有一些不容易计算的项目，如高压锅维修，安全，节约空间等：
[0032] 表5本发明的铁皮石斛简便组培方法培养与常规组培的成本分析表
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[0034] 本发明具有如下优点和有益效果：
[0035] 1.本发明的铁皮石斛化学消毒组培方法中，培养容器和培养基都无需高温高压灭 菌，减少了工作量和能源消耗，简化了铁皮石斛组培环节，降低了铁皮石斛组培成本。
[0036] 2.本发明的铁皮石斛化学消毒组培方法，操作简单，只要按不同的培养基配方配 制后即可，实用性强，推广性好。
[0037] 3.本发明的铁皮石斛化学消毒组培方法与常规的铁皮石斛组培方法对比，可以降 低成本1