产，而较高肥沃力的土壤变得更加多产。
[0186] ?微生物表征（profiling)
[0187] 在真空烘箱中于40°C下干燥来自每个地块的土壤样品，并将其通过Imm的筛子 以除去较大的颗粒。然后在珠磨机中研磨该土壤，以产生〈200微米的颗粒尺寸。使用 PowerSoiIu DNA分离试剂盒（MoBio, USA)从地面土壤的500mg的子样本提取DNA。通过 在 25Hz 使用 Qiagen Retsch Tissuelyser MM301(Qiagen，USA) 20 分钟修改制造商的说明 书。
[0188] ARISA已经被（Fisher和Triplett，1999)先前描述过并依赖于在rRNA操纵子中 的16S和23S rRNA基因之间的基因间转录间隔（ITS)区的长度异质性。
[0189] 六个引物对被用来扩增该基因间隔区以用于ARISA测定，每个引物对扩增涵盖 Western Australia中的农业土壤在内的主要土壤分类群组。三个引物组被用来扩增 16S-23S rRNA ITS区，用于土壤细菌群落（称为Bac I、Bac II和Bac III，分别包括但 并不排他的α变形菌、β变形菌和厚壁菌）。这些引物对为ITSF/ITSReub(Cardinale 等人，2004)、S-D-Bact-1522-b-S-20/L-D-Bact-132-a-A-18 (Ranjard 等人，2001)和 1406F/23Sr (Fisher 和 Triplett，1999)。使用 A751F/UA 1406R(Baker, Smith 和 Cowan， 2003)引物对扩增古生菌微生物群落，使用引物SpF/SpR(Mazza, Monciardini, Cavaletti, Sosio和Donadio, 2003)引物对扩增放线菌群落，并使用ITS1-F/ITS4 (Rooney和Clipson， 2009)扩增双核亚界真菌微生物群落。用FAM(6-羧基罗丹明）亚磷酰胺染剂荧光染料 (GeneWorks，South Australia)对针对每个引物对的正向引物作焚光标记，并且针对每个 引物的序列示于下表4中。
[0190] 表4-ARISA引物序列
[0193] DNA扩增在20 μ 1的最终体积中进行，所述20 μ 1的最终体积含有1.0 U的Taq DNA 聚合酶，I XPCR 缓冲液和 1.0 mM 的每一种 dNTP (Fisher Scientific，Western Australia) 〇 对每个PCR进行优化并因此引物和MgCl2的浓度不同。优化的PCR条件和浓度示于表5中。
[0194] 表5-优化的PCR条件、引物和MgCl2浓度
[0196] 扩增后，将Iml的HiDi甲酰胺（Applied Biosystems，USA)与6 μ 1的内部尺寸 标准物LIZ 1200 (Applied Biosystems，USA)混合。将此混合物的19 μ 1等分试样加入到 每个孔中并在此混入1 μ 1的每一种PCR产物。然后使用ABI 3730自动测序仪（Applied Biosystems，USA)分析样品。使用LIZ 1200尺寸标准物，排除了小于20bp的片段以及大 于1200bp的片段。GeneMapper软件（Applied Biosystems，USA)被用于确定对于每个样 品所存在的峰的峰面积、高度和大小。对所有样品而言，将背景荧光阈值手动设定在100个 相对荧光单位。
[0197] 对于每个引物对的评分代表使用ABI 3730自动系统的大于100RFU的信号数的 AFLP的信号数。当这些分类群可能以每克土壤大于IO4个微生物的数量存在时，出现这样 的信号强度。
[0198] ?根际微生物区系
[0199] 在整个生长季节收集自植物根际的DNA的分析表明多样性以及属于β变形菌的 细菌优势存在相对的减少，而属于双核亚界的占优势分类群的数量有所增加。
[0200] 通过ARISA所揭示的根际微生物的复杂性体现于在根部周围的土壤中存在超出 500种不同的生物体。这些生物体中的绝大多数仅以小种群水平存在，因此被视为是非优势 分类群（图8C)。
[0201] 当只考虑对于那个特定的群组（测量的六个群组中的）而言按大于2%的生物质 存在的那些分类群时，所述发酵产品的应用的影响变得更清晰（图8Α和图8Β)。
[0202] 实施例3 :土壤添加剂的使用
[0203] 在添加和不添加 Bioprime 20/50发酵剂的地块上，采用如上所述的ARISA测定对 小麦根际土壤进行了比较。该实验在西澳洲的Buntine附近进行，并由10米Χ2米的72 个地块组成，其中的每个地块被随机分配至24个析因处理之一。存在三种处理类型：对照 (无添加剂）；按低（2L/公顷）或高（4L/公顷）比率加入的20/50发酵剂；以及按播种时 45kg/公顷、播种时22kg/公顷和分蘖时22kg/公顷或分蘖时45kg/公顷的比率加入的尿素 氮肥料。于2013年5月30日用Mace品种小麦播种地块，在同一天实施处理，并在2013年 6月29日对土壤取样。
[0204] 通过测量在整个核内转录间隔（ITS)区（其是在不同物种之间的序列中高度可变 的DNA区）的序列长度变体的数量，ARISA微生物多样性测定评估土壤样品中的微生物物种 的数量（Fisher和Triplett，1999)。序列长度变体被认为是不同的运算分类单元（OTU)， 并且由ARISA测得的土壤样品中的OTU的数量与该样品中的微生物物种的实际数量正相 关，但不完全一样。ITS区位于小和大亚基核糖体RNA基因（rRNA基因）之间，这两种基因 的DNA序列在物种之间比ITS区更相似（Woese和Fox 1977)。因此ARISA测定可以通过采 用一对围绕对于该群的ITS区的保守rRNA基因特异的引物以特定的微生物群组（例如厚 壁菌，真菌）为目标，并且其因此扩增仅对于该群组的ITS区（Fisher和Triplett，1999)。 在我们的针对特定群组的细菌的ARISA测定中，我们利用通用于所有的细菌反向引物，但 在每种情况下识别出了高度特异性的正向引物。
[0205] 在田野中收集来自每个地块的土壤样品，将其置于湿冰上，运回到实验室，并在分 析前储存在_20°C。土壤样品在湿冰上融化，用手将其均质化，并取出0.25g子样本。按照 生产商的说明书，使用PowerSoil DNA分离试剂盒（MoBio, Carlsbad，USA)从子样本中提取 总 DNA，但是用 TissueLyserII (Qiagen，Hilden，Germany)在 25Hz 下使样品进行溶解 20 分 钟，而且根据在每批样品中的有机污染的平均水平，我们修改了在随后的下游纯化中使用 的溶解的提取物的量（至50-500 μ 1)。
[0206] 十个引物对用于扩增整个ITS区，对应于在下表6中示出的微生物群组。
[0207]
[0208] 土壤样品在20 μ 1反应混合物中扩增，所述反应混合物含有2 μ I (10_40ng) 总提取的DNA、4pmol各种引物、2 μ g BSA、取决于引物对的5-3. 5mM的MgC12 (表 5)、0. 2mM的dNTP和0. 825单位Taq FlDNA聚合酶以及I X反应缓冲液（Fisher Biotech, Wembley, Western Australia)。扩增在 Axygen Maxygene 热循环仪中进行，程序 如下：在94°C下5分钟；30次在94°C下30秒、55°C下30秒、72°C下1分钟的循环；然后在 72°C下的最后10分钟。
[0209] 扩增后，将对于相同的DNA样品不同的引物对的反应物合并入表6所示的PCR后 多重组中，并按照生产商的说明书使用RapidTips2 (Diffinity Genomics, New York, USA) 除去未引入的引物。
[0210] 在澳大利亚基因组研宄平台（Australian Genome Research Facility) (Perth, Western Australia)的 AB 3730x1 上，使用 0.21 μ I LIZ1200 尺寸标准物以及 10 μ I HiDi 甲酰胺中的 1. 2 μ 1 每一种多重池 （Life Technologies, Carlsbad, USA)进行片 段定量。
[0211] 使用 Peak Scanner (2. 0 版；Life Technologies，Carlsbad, USA)在得到的片段 数据集中检测对应于每个扩增的样品中的不同ITS长度变体的峰，其中最小峰高度设定为 50个荧光单位。将数据集手动修整为50-1200个碱基对，并使用在R 3. 0.1 (R Core Team 2013)下运行的Interactive Binner (Ramette 2009)分级成2碱基对箱宽度，以产生针对 每个引物对的OTU数据。
[0212] 在处理过程中采用泊松分布广义线性模型在R 3. 0. 1(R Core Team2013)中对来 自每个引物对的总OTU计数的差异进行了测试。我们通过使用Jaccard指数比较不同OTU 的存在和不存在，以及使用多变量统计（Vegan v2. 07版中的adonis，Oksanen等人2013， 在R 3.0. 1下运行，R Core Team 2013)分析数据，测试了在处理过程中的每个引物对的群 落组成的偏移。群落组成的曲线通过优化多维尺度被可视化（MASS 7. 3版中的metaMDS， Venables 和 Ripley 2002 年，在 R 3. 0· 1 下运行，R Core Team 2013) 〇
[0213]
[0214] 表7报告了使用广义线性模型分析每个引物的OTU计数的结果，以及使用多元统 计在存在/不存在Jaccard指数下分析OTU组成的结果。在每一种情况下，该表报告了 F 统计、概率值（?）并指示显著性（*-?〈0.05，**-?〈0.01，*林-?〈0.001)。对于所述01^计数 分析而言，在所述处理是显著的情况中也表明了处理效果（相对于未进行处理）的方向。
[0215] ARISA测定结果表明，氮和20/50发酵剂处理两者独立地改变了某些微生物群组 的OTU计数，并且还改变了存在或不存在于某些微生物群组内的OTU的组成（表7,图9和 图10)。发现氮和20/50发酵剂对ARISA OTU计数有显著的抑制和刺激效果（表7,图9)。 对放线菌和细菌III而言，氮和20/50发酵剂这两者都对ARISA OTU计数有显著效果，处理 效果以相反的方向起作用（表7,图9)。例如，氮处理抑制了放线菌的ARISA OTU计数，而 20/50发酵剂同时刺激了放线菌的ARISA OTU计数（表7,图9)。放线菌是一个庞大且普遍 的土壤细菌群。它们是需氧菌并且在功能上它们氧化复杂的植物有机化合物。因为许多物 种向土壤中分泌真菌抗生素，所以它们被认为抑制了植物病原真菌的生长（Goodfellow和 Williams，1983)。在ARISA测定中，20/50发酵剂处理使放线菌和双核亚界真菌这两者的 OTU群落组成显著地偏移（表7,图10)。
[0216] 实施例4:洋葱生长
[0217] 试验床为Forrestdale中的Bassendean沙土，用7m中心上的蝴蝶喷头通过井水 灌溉。采用旋转锄准备床，并形成为1米宽和10米长的床。形成两个平行的床，然后将其 划分成用木粧标记的Im区段。
[0218] 20m2的床含有过磷酸钙（IKg)、硫酸镁（300g)、硫酸锰（50g)、硼酸（30g)、硫酸铜 (IOg)、硫酸铁（IOg)、硫酸锌（IOg)和钼酸钠（2g)的播前肥料。在均匀地散播在床之前将 肥料在桶中混合。
[0219] 在每个床中，将洋葱种子（"Bianca"品种）按相隔200mm的三行人工播种。种子 按照相隔约40mm放置。
[0220] -旦种子被播种，对床随机分配处理。存在三种处理，它们是用每公顷IOL或每公 顷20L的比率应用发酵产品20/50或未经处理的对照。将足够体积的产品溶解在自来水中 并使用喷壶均匀地应用。存在每种产品处理的六个重复以及八个对照重复。在洋葱发芽四 周后，再次应用了同样的处理。
[0221] 在床播种六周后，小心地重新获得来自每个Im2的处理区块中的一个幼苗，以保持 附着于根部的土壤。将来自每种处理的样品聚集在一起，并且已经对土壤提取了 DNA。对 DNA进行ARISA分析。
[0222] 在种子被播种22周后，洋葱表现出成熟的迹象，因而关闭灌溉。2周后通过从土壤 中拔出并将其铺在塑料片上晾干来收获洋葱。除去干燥的叶子并对球茎部计数并称重。
[0223] 表 8 :ARISA 结果
[0224]