节物，即在基因座末端的Εμ和3' E (Pettersson等人，Nature, 344, 165 [1990])。 在小鼠中，整个3'调节区（含有1183&、1181，2、118313和1184)的去除容许正常的早期8细 胞发育但是消除了类别转换重组（Vincent-Fabert等人，Blood, 116, 1895[2010])并 且可能阻碍体细胞超突变的优化（Pruzina等人，Protein Engineering, Design and Selection，1，[2011])。当使用转基因的人IgH基因时，实现最佳的同种型表达的调节 功能性是特别适合的。具有不完全3' E区的通常仅提供hsl，2元件的转基因构建体，即 使在内源性IgH基因座被敲除时，也导致在转基因小鼠中令人失望的表达水平。因此，从 在过去20年中生产的构建体中已经分离出仅仅几个抗原特异性完全人IgG(Lonberg等 人，Nature 368, 856 [1994] ;Nicholson 等人，J. Immunol.，163, 6898 [1999] ;Davis 等人， Cancer Metastasis Rev. 18, 421 [1999] ;Pruzina等人，Protein Engineering, Design and Selection，1，[2011])。在大鼠 IgH基因座中，仅对3'E区进行了欠佳地分析。小鼠和 大鼠序列的比较不容许鉴定hs4, hs4为更下游的具有附加重要调节序列的关键第4元件 (Chatterjee等人，J. Biol. Chem.，286, 29303[2011])。因为缺乏3'增强子的嵌合多核苷 酸导致受损的同种型转换和低IgG表达，所述本发明的多核苷酸至少部分地由于包含了此 大鼠3'增强子而有利地提供优化的表达。在一个实施方案中，大鼠3'增强子具有包含如 SEQ ID NO: 1所示的序列或其部分或与其基本同源的序列。
[0033] 如本文使用的，具有包含第二序列（例如，SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2等）的一部 分（例如小于整体）或与其基本同源的序列的多核苷酸优选地保留该第二序列的生物活性 (例如，保留3'增强子的生物活性以提供免疫球蛋白的优化表达和/或同种型转换，能够重 排以提供人源化嵌合重链等）。在一个实施方案中，包含含有SEQ ID NO: 1的一部分或与其 基本同源的序列的核酸包含至少8kB，优选至少IOkB的与SEQ ID NO: 1基本同源的连续核 酸。
[0034] 如本文使用的，"人工Ig基因座"可以指未重排、部分重排或者重排的多核苷酸 (例如，在重链的情况中包含V-、D-和/或J区的序列，或者在轻链的情况中包含V-和/ 或J区的序列，以及对于重链和轻链之一或两者，任选地包含恒定区的序列）。人工Ig基因 座包括人工Ig轻链基因座和人工Ig重链基因座。在一个实施方案中，本发明的人工免疫 球蛋白基因座是功能性的并且能够重排并产生免疫球蛋白链的库。在一个优选的实施方案 中，本文公开的多核苷酸的可变结构域或其部分包含呈天然构型的基因，即，人Ig基因区 段的天然存在的序列、人Ig基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及编码与由人Ig基 因区段的天然存在的序列编码的多肽基本相同的多肽序列的合成序列。在另一个优选的实 施方案中，该多核苷酸包含在人中发现的呈天然构型的可变结构域或其部分。例如，编码如 本文公开的人工Ig重链的多核苷酸可以包含呈天然构型的至少两个人V基因、至少两个D 基因、至少两个J基因或其组合。
[0035] 在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含非人C区基因并且能够产生包括具 有非人C区的嵌合免疫球蛋白的免疫球蛋白库。在一个实施方案中，人工Ig基因座包含人 C区基因并且能够产生包括具有人C区的免疫球蛋白的免疫球蛋白库。在一个实施方案中， 人工Ig基因座包含"人工恒定区基因"，其是指组成源于人和非人恒定区基因的核苷酸序 列的恒定区基因。例如，示例性人工C恒定区基因是编码人IgG CHl结构域和大鼠 IgG CH2 和CH3结构域的恒定区基因。
[0036] 在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含3'增强子序列，其包括hsl，2、 hs3a、hs3b以及hs3b的下游序列（500-2500nt)。在转基因动物中，包含从Calpha至3'hs3b 的全长约30kb 3' E区的人工基因座导致高水平IgG表达、广泛超突变以及大量的具有高 (PM)亲和力的抗原特异性杂交瘤。然而，较短的增强子序列减低Ig表达。
[0037] 在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含图Ia中所示的3'增强子序列。此 序列源于大鼠 Ig重链基因座并且含有从Calapha至3' hs3b的3'区的约30kb。大鼠3' 增强子序列的序列如SEQ ID NO: 1所示。在另一个实施方案中，人工Ig基因座包含含有如 SEQ ID NO: 1所示的序列或其一部分或与其基本同源的序列。
[0038] 在一些实施方案中，人工Ig重链基因座缺乏CHl或者容许所得的免疫球蛋白包围 典型的免疫球蛋白的等效序列：分子伴侣联合。此类人工基因座在缺乏功能性Ig轻链基因 座的转基因动物中提供仅重链抗体的产生，并因此不表达功能性Ig轻链。将此类人工Ig 重链基因座用于在本文涵盖的方法中以产生缺乏功能性Ig轻链基因座并且包含人工Ig重 链基因座的转基因动物，该动物能够产生仅重链抗体。或者，可以将人工Ig基因座原位操 作以破坏CHl或等效区，并产生人工Ig重链基因座，其提供仅重链抗体的产生。关于在轻 链缺陷小鼠中仅重链抗体的产生，参见例如Zou等人，JEM，204:3271-3283, 2007。
[0039] 所谓"人独特型"是指存在于由免疫球蛋白V-基因区段编码的人抗体上的多肽序 列。如本文使用的，术语"人独特型"包括人抗体的天然存在的序列，以及与在天然存在的 人抗体中发现的多肽基本相同的合成序列。所谓"基本"是指氨基酸序列同一性的程度是 至少约85% -95%。优选地，氨基酸序列同一性的程度大于90%，更优选大于95%。
[0040] 所谓"嵌合抗体"或"嵌合免疫球蛋白"是指包含人免疫球蛋白多肽序列的一部分 (或者由人Ig基因区段编码的多肽序列）和非人免疫球蛋白多肽序列的一部分的免疫球蛋 白分子。本发明的嵌合免疫球蛋白分子是具有非人Fc-区或者人工Fc-区和人独特型的免 疫球蛋白。可从已经被工程化以产生嵌合免疫球蛋白分子的本发明的动物中分离此类免疫 球蛋白。
[0041] 所谓"人工Fc-区"是指由人工恒定区基因编码的Fc-区。
[0042] 如本文使用的，术语"Ig基因区段"是指编码Ig分子的各个部分的DNA的区，其 存在于非人动物和人的种系中，并且使其在B细胞中结合在一起以形成重排的Ig基因。因 此，如本文使用的Ig基因区段包括V基因区段、D基因区段、J基因区段和C基因区段。
[0043] 如本文使用的，术语"人Ig基因区段"包括：人Ig基因区段的天然存在的序列、人 Ig基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及合成序列，该合成序列编码与由人Ig基因 区段的天然存在的序列编码的多肽基本相同的多肽序列。所谓"基本"是指氨基酸序列同 一性的程度是至少约85 %-95 %。优选地，氨基酸序列同一性的程度大于90 %，更优选大于 95%〇
[0044] 本发明涉及的多核苷酸可以包括DNA或RNA，并且可以是完全或部分地合成的。除 非上下文另外要求，提及如本文所述的核苷酸序列涵盖具有指定序列的DNA分子，并且涵 盖具有其中U取代T的指定序列的RNA分子。
[0045] 对两个序列之间的"同源性"或"序列同一性"（术语在此可互换地使用）的计算按 如下进行。为了最佳的比较目的，将序列比对（例如，为了最佳的比对，可以将空位引入第 一和第二氨基酸或核酸序列之一或二者中，并且为了比较目的可以不考虑非同源性序列）。 在一个优选的实施方案中，为比较目的而比对的参考序列的长度是该参考序列长度的至少 30 %，优选至少40 %，更优选至少50 %，甚至更优选至少60 %，并且甚至更优选至少70 %、 80 %、90 %、100 %。然后比较在相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。 当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则在 该位置处分子是相同的（如在此使用的，氨基酸或核酸"同一性"相当于氨基酸或核酸"同 源性"）。两个序列之间的同一性百分比是由所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑 为了两个序列的最佳比对需要引入的空位的数量以及每个空位的长度。
[0046] 两个序列之间的序列比较以及序列同一性百分比的确定可以利用数学算法完 成。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一"性百分比是利用Needleman和 Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-53)算法进行确定的，所述算法已经被并入GCG软件包 中的GAP程序中（在gcg. com可在线获得），该程序使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵， 以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。在另一个优选的 实施方案中，两个核苷酸序列之间的同一性百分比是利用GCG软件包中的GAP程序进行确 定（可在WWW. gcg. com获得）的，该程序使用NWSgapdna. CMP矩阵以及40、50、60、70或80 的空位权重以及1、2、3、4、5或6的长度权重。特别优选的参数组（并且若操作者不确定应 该应用什么参数来确定分子是否在本发明的序列同一性或同源性限制内，则应采用该参数 组）是具有空位罚分12、空位延伸罚分4以及移码空位罚分5的Blossum 62记分矩阵。两 个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比还可以利用Meyers和Miller的算法（（1989) CABIOS 4:11-17)进行确定，所述算法其已经被并入ALIGN程序（2.0版）中，该程序利用 PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。
[0047] 人工Ig基因座
[0048] 本发明还涉及人工Ig基因座以及它们在制备能够产生具有人独特型的免疫球蛋 白的转基因动物中的用途。每个人工Ig基因座包含多个免疫球蛋白基因区段，其包括至少 一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、在重链基因座的情况中一个或多个D基因区 段，以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，V基因区段中的至少一个编码种系或超突变 的人V-区氨基酸序列。因此，此类转基因动物具有产生包括具有人独特型的抗体的免疫球 蛋白分子的多样化库的能力。在重链基因座中，可以将人或非人源的D-基因区段包括在人 工Ig基因座中。此类基因座中的基因区段在未重排的构型（或者"种系构型"）中或者在 部分或完全重排的构型中相对于彼此并置。人工Ig基因座具有在受试动物中进行基因重 排（若该基因区段没有完全重排）的能力，由此产生具有人独特型的免疫球蛋白的多样化 库。
[0049] 调节元件如启动子、增强子、转换区、重组信号等可以为人或非人起源。为了赋予 人工基因座功能性，需要的是该元件在相关的动物物种中可操作。本文更详细地描述优选 的调节元件。
[0050] 在一个方面，本发明提供转基因构建体，其含有能够在宿主动物中进行基因重排 的人工重链基因座，由此产生具有人独特型的重链的多样化库。该转基因的人工重链基因 座含有具有至少一个人V基因区段的V-区。优选地，该V-区包括至少约5-100个人重链 V(或者"VH"）基因区段。如上所述，人VH区段涵盖：人VH基因区段的天然存在的序列、人 VH基因区段的天然存在的序列的简并形式，以及编码与人重链V结构域域多肽基本（即，至 少约85% -95% )相同的多肽序列的合成序列。
[0051] 在一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有至少一个或几个大鼠恒定区基 因，例如，CS、Cy和Cy (包括Cy子类中的任一个）。
[0052] 在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有人工恒定区基因。在一个优选 的实施方案中，此类人工恒定区基因编码人CHl结构域和大鼠 CH2CH3结构域，或者人CHl 和大鼠 CH2、CH3和CH4结构域。具有人CHl结构域的杂交重链与完全人轻链有效地配对。
[0053] 在一个优选的实施方案中，人工Ig基因座包含3'增强子序列，包括hsl，2、hs3a、 hs3b以及介于大鼠 Calpha和3' hs3b之间的序列。
[0054] 在另一个优选的实施方案中，人工重链基因座含有缺乏CHl结构域的人工恒定区 基因。在一个优选的实施方案中，此类人工恒定区基因编码缺乏CHl结构域但是包含CH2 和CH3或者CH1、CH2、CH3和CH4结构域的截短的IgM和/或IgG。缺乏CHl结构域的重链 不能与Ig轻链有效地配对并形成仅重链抗体。
[0055] 在另一方面，本发明提供转基因构建体，其含有能够在宿主动物中进行基因重排 的人工轻链基因座，由此产生具有人独特型的轻链的多样化库。转基因的人工轻链基因座 含有具有至少一个人V基因区段的V-区，例如，具有至少一个人VL基因和/或至少一个重 排的人VJ区段的V-区。优选地，该V-区包括至少约5-100个人轻链V (或"VL"）基因区 段。一致地，人VL区段涵盖：人VL基因区段的天然存在的序列、人VL基因区段的天然存在 的序列的简并形式以及编码与人轻链V结构域多肽基本（即，至少约85% -95% )相同的 多肽序列的合成序列。在一个实施方案中，人工轻链Ig基因座具有C-区，其具有至少一个 大鼠 C基因（例如，大鼠 CA或Ck)。
[0056] 本发明的另一方面涉及制备含有人工Ig基因座的转基因载体的方法。此类方法 包括：分离Ig基因座或其片段，并将所述基因座或其片段与包含编码人V区元件的序列的 一个或几个DNA片段组合。按照保留该基因座在受试动物中进行有效的基因重排的能力这 样的方式，通过连接或同源性重组而将Ig基因区段插入人工Ig基因座或其部分中。
[0057] 优选地，通过筛选从质粒、粘粒、YAC或BAC等的基因组DNA制备的质粒、粘粒、YAC 或BAC等的文库来分离非人Ig基因座。YAC克隆可以携带多达2兆碱基的DNA片段，因此 整个动物重链基因座或其大部分可以在一个YAC克隆中进行分离，或者进行重建以被包含 在一个YAC克隆中。BAC克隆能够携带较小尺寸（约50-500kb)的DNA片段。然而，可以将 含有Ig基因座的重叠片段的多个BAC克隆单独改变，并随后一起注入动物受体细胞中，其 中重叠片段在受体动物细胞中重组以产生连续的Ig基因座。
[0058] 通过多种方法，包括DNA片段的连接或者通过同源性重组的DNA片段的插入，可以 将人Ig基因区段整合到载体（例如，BAC克隆）上的Ig基因座中。以这样一种方式进行 人Ig基因区段的整合，即将该人Ig基因区段可操作地连接到转基因中的宿主动物序列，以 产生功能性人源化Ig基因座，即，能够进行导致产生具有人独特型的抗体的多样化库的基 因重排的Ig基因座。同源性重组可以在细菌、酵母以及其他具有高频率同源性重组事件的 细胞中进行。可以容易地从细胞中分离工程化的YAC和BAC，并将其用于制备转基因动物
[0059] 包含人工Ig基因座并能够产生具有人独特型的抗体的啮齿动物卵母细胞和转基 因动物
[0060] 在一个方面，本发明提供能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，以 及制备所述转基因动物的方法。
[0061] 所用的转基因动物选自啮齿动物（例如，大鼠、仓鼠、小鼠和豚鼠）。
[0062] 在本发明中用于人源化抗体产生的转基因动物在内源性Ig基因座中携带种系突 变。在一个优选的实施方案中，对于突变的内源性Ig重链和/或内源性Ig轻链基因，转基 因动物是纯合的。此外，这些动物携带至少一个人工Ig基因座，所述人工Ig基因座是功能 性的并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白分子的库。在本发明中所用的人工Ig基因 座包括至少一个人V基因区段。
[0063] 在一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座和至少 一个人工Ig轻链基因座，其每个都是功能性的并且能够在转基因动物中产生免疫球蛋白 分子的库，该免疫球蛋白分子的库包括具有人独特型的抗体。在一个实施方案中，使用包括 至少一个非人C基因的人工基因座，并且提供能够产生具有人独特型和非人恒定区的嵌合 抗体的动物。在一个实施方案中，使用包括至少一个人C基因的人工基因座，并且提供能够 产生具有人独特型和人恒定区的抗体的动物。
[0064] 在另一个优选的实施方案中，转基因动物携带至少一个人工Ig重链基因座，并且 缺乏功能性Ig轻链基因座。此类动物可用于产生仅重链抗体。
[0065] 此类转基因动物的产生包括将一个或多个人工重链Ig基因座和一个或多个人工 轻链Ig基因座整合到具有至少一个内源性Ig基因座的转基因动物的基因组中，通过一个 或多个大范围核酸酶的作用，已经或将会使所述内源性Ig基因座失活。优选地，对于内源 性Ig重链和/或内源性Ig轻链，转基因动物是无合子的（nullizygous)，因此不能产生内 源性免疫球蛋白。无论染色体位置如何，本发明的人工Ig基因座具有进行基因重排并由此 产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力。具有进行基因重排的能力的Ig基因座在本文也 被称为"功能性" Ig基因座，并且具有由功能性Ig基因座产生的多样性的抗体在本文也被 称为"功能性"抗体或者抗体的"功能性"库。
[0066] 用来产生此类转基因动物的人工基因座各包括多个免疫球蛋白基因区段，其包括 至少一个V区基因区段、一个或多个J基因区段、在重链基因座的情况中一个或多个D基因 区段，以及一个或多个恒定区基因。在本发明中，V基因区段中的至少一个编码种系或超突 变的人V-区氨基酸序列。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能 力，所述免疫球蛋白分子包括具有人独特型的抗体。
[0067] 在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个非人C区基因区段。因此，此 类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有 人独特型的嵌合抗体。
[0068] 在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人C区基因区段。因此，此类 转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样化库的能力，所述免疫球蛋白分子包括具有人 独特型