和人恒定区的抗体。
[0069] 在一个实施方案中，所用的人工基因座包含至少一个人工恒定区基因。例如，示例 性的人工C恒定区基因是编码人IgG CHl结构域和大鼠 IgG CH2和CH3结构域的恒定区基 因。因此，此类转基因动物具有产生免疫球蛋白分子的多样性库的能力，所述免疫球蛋白分 子包括具有人独特型以及包含人和非人组分两者的人工恒定区的抗体。
[0070] 将含有人工Ig基因座的转基因载体引入受体细胞或细胞中，然后通过随机整合 或者通过革G向整合，整合到该受体细胞或细胞的基因组中。
[0071] 对于随机整合，可通过标准的转基因技术将含有人工Ig基因座的转基因载体引 入受体细胞中。例如，可以将转基因载体直接注入受精卵母细胞的原核中。也可以通过在 卵母细胞受精之前精子与转基因载体的共孵育，将转基因载体引入。转基因动物可以从受 精的卵母细胞发育。引入转基因载体的另一种方式是通过转染胚胎干细胞或其他多能细 胞（例如原始生殖细胞）而后将经基因修饰的细胞注入发育中的胚胎中。或者，可以将转 基因载体（裸露的或者与促进剂（facilitating reagent)结合）直接注入发育中的胚胎 中。最后，从该胚胎产生嵌合转基因动物，该胚胎含有被整合在转基因动物的至少一些体细 胞的基因组中的人工Ig转基因。在另一个实施方案中，将转基因载体引入细胞的基因组中 并通过核移植克隆从转染的细胞获得动物。
[0072] 在一个优选的实施方案中，将含有人工Ig基因座的转基因随机地整合到受体细 胞（例如受精的卵母细胞或者发育中的胚胎）的基因组中。在一个优选的实施方案中，获 得这样的后代，其对于内源性Ig重链和/或Ig轻链是无合子的，因此不能产生内源性免疫 球蛋白而能够产生转基因免疫球蛋白。
[0073] 对于靶向整合，可以将转基因载体引入适当的受体细胞中，例如胚胎干细胞、其他 多能细胞或者已经分化的体细胞。而后，可以通过标准方法对已将转基因整合到动物基因 组中的细胞进行选择。然后可以将选定的细胞与去核的核移植单位细胞（例如卵母细胞 或胚胎干细胞）进行融合，所述核移植单位细胞是全能的并能够形成功能性新生儿。融合 是按照得到确认的常规技术进行的。参见，例如，Cibelli等人，S CienCe(1998) 280:1256 ; Zhou等人Science (2003) 301:1179。卵母细胞的去核和核移植还可以利用注射吸量管通过 显微外科手术实施。（参见，例如，Wakayama等人，Nature(1998)394:369。）然后将所得的 细胞在适当的培养基中培养，并且移植到同步受体中以产生转基因动物。或者，可以将选定 的经基因修饰的细胞注入到发育中的胚胎中，所述发育中的胚胎随后发育成嵌合动物。
[0074] 在一个实施方案中，大范围核酸酶用来使在靶点通过双链DNA裂解进行的同源性 重组的频率升高。为了整合到特异性位点中，可以使用位点特异性大范围核酸酶。在一个 实施方案中，靶向内源性Ig基因座的大范围核酸酶用来使同源性重组和用人工Ig基因座 或其部分替代内源性Ig基因座或其部分的频率升高。在一个实施方案中，转基因动物缺乏 功能性Ig轻链基因座并且包含人工Ig重链基因座。
[0075] 具有人独特型的免疫球蛋白
[0076] -旦制得能够产生具有人独特型的免疫球蛋白的转基因动物，通过用抗原使动物 免疫，可以容易地获得针对该抗原的免疫球蛋白和抗体制剂。如本文使用的，"多克隆抗血 清组合物"包括亲和纯化的多克隆抗体制剂。
[0077] 多种抗原可以用来使转基因动物免疫。此类抗原包括但不限于活的、减毒的或死 亡的微生物，例如病毒和单细胞生物（例如细菌和真菌），微生物的片段，或者从微生物分 离的抗原性分子。
[0078] 用于使动物免疫的优选的细菌抗原包括：从金黄色葡萄球菌纯化的抗原例如荚膜 多糖类型5和8、毒力因子的重组形式例如α -毒素、粘连素结合蛋白、胶原结合蛋白以及 纤连蛋白结合蛋白。优选的细菌抗原还包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)的减毒形式，或者 来自这些细菌细胞的培养上清液。可用于免疫的其他细菌抗原包括：纯化的脂多糖（LPS)、 荚膜抗原、荚膜多糖和/或外膜蛋白的重组形式、纤连蛋白结合蛋白、内毒素以及来自铜绿 假单胞菌、肠球菌、肠杆菌和肺炎克雷伯菌的外毒素。
[0079] 用于产生针对真菌的抗体的优选的抗原包括真菌或其外膜蛋白的减毒形式，所述 真菌包括但不限于白色念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌和新型隐球菌。
[0080] 用于免疫以产生针对病毒的抗体的优选的抗原包括包膜蛋白以及病毒的减毒形 式，所述病毒包括但不限于呼吸道合胞病毒（RSV)(特别是F-蛋白）、丙型肝炎病毒（HCV)、 乙型肝炎病毒（HBV)、巨细胞病毒（CMV)、EBV和HSV。
[0081] 通过用分离的肿瘤细胞或肿瘤细胞系以及肿瘤相关的抗原使转基因动物免疫，可 以产生对癌症特异的抗体，所述肿瘤相关的抗原包括但不限于，Her-2-neu抗原（针对该抗 原的抗体用于治疗乳腺癌）；CD20、CD22和CD53抗原（针对该抗原的抗体用于治疗B细胞 淋巴瘤）、前列腺特异性膜抗原（PMSA)(针对该抗原的抗体用于治疗前列腺癌），以及17-1A 分子（针对该分子的抗体用于治疗结肠癌）。
[0082] 可以将抗原以任何方便的方式在有或没有佐剂的情况下施用至转基因动物，并且 可以按照预定的时间表进行施用。
[0083] 为了制备单克隆抗体，将脾细胞从免疫的转基因动物中分离并用在与转化细胞 系的细胞融合中以用于产生杂交瘤，或者将编码抗体的cDNA通过标准分子生物学技术 克隆并在转染细胞中表达。制备单克隆抗体的方法在本领域中是得到确认的。参见，例 如，欧洲专利申请 0 583 980 Al( "Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"）、美国专利号 4,977,081( "Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"）、W0 97/16537( "Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof"）以及 EP 0 491 057 BI ( "Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G"），所述专利的公开内容以引用的方式并入本文中。对 于从克隆的cDNA分子体外产生单克隆抗体，Andris-Widhopf等人，"Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Tmmunol Methods242:159 (2000)和 Burton, D.R·，"Phage display"，Immunotechnologyl:87 (1995) 已经进行了描述。
[0084] 一旦已经产生具有人独特型的嵌合单克隆抗体，利用标准的分子生物学技术，可 以容易地将此类嵌合抗体转变成完全人抗体。完全人单克隆抗体在人中不是免疫原性的， 并且适合用于人受试者的治疗性治疗。
[0085] 本发明的抗体包括仅重链抗体
[0086] 在一个实施方案中，用抗原使缺乏功能性Ig轻链基因座并包含人工重链基因座 的转基因动物免疫以产生与抗原特异性结合的仅重链抗体。
[0087] 在一个实施方案中，本发明提供源于此类动物的产生单克隆抗体的细胞，以及从 中获得的核酸。还提供从中获得的杂交瘤。还提供从中获得的完全仅人重链抗体以及编码 核酸。
[0088] 关于仅重链抗体的教义可在现有技术找到。例如，参见PCT公布W002085944、 W002085945、W02006008548 和 W02007096779。还参见 US 5, 840, 526 ;US 5, 874, 541 ;US 6, 005, 079 ;US 6, 765, 087 ;US 5, 800, 988 ;EP 1589107 ;W0 9734103 ;和 US 6, 015, 695。
[0089] 药物组合物
[0090] 在本发明的进一步的实施方案中，将经纯化的单克隆或多克隆抗体与适合于向患 者施用的适当的药物载体混合，从而提供药物组合物。
[0091] 用本发明的药物组合物治疗的患者优选为哺乳动物，更优选为人，但是兽医用途 也涵盖在内。
[0092] 可用于本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体可以是任何及所有的溶剂、 分散介质、等渗剂等。除非对受体或对包含在其中的抗体的治疗有效性有损，任何常规的介 质、试剂、稀释剂或载体在本发明的药物组合物中的使用是适当的。
[0093] 所述载体可以是液体、半固体（例如糊剂）或者固体载体。载体的实例包括油类、 水、盐溶液、醇、糖、凝胶、脂类、脂质体、树脂、多孔基质、粘合剂、填充剂、包衣、防腐剂等，或 其组合。
[0094] 治疗方法
[0095] 在本发明的另一方面，提供用于治疗脊椎动物，优选为哺乳动物，优选为灵长类动 物的疾病的方法，其中人受试者为一个特别优选的实施方案，所述方法是通过施用适合于 治疗所述疾病的本发明的纯化的抗体组合物进行的。
[0096] 所述抗体组合物可以用来结合并且中和或调节人体组织中的抗原性实体，该抗原 性实体造成或导致疾病或者引起不期望的或异常的免疫应答。本文将"抗原性实体"定义 为涵盖任何可溶的或者细胞表面结合的分子，包括蛋白质以及细胞或者引起传染性疾病的 生物，或者至少能够与抗体结合并且优选地也能够刺激免疫应答的试剂。
[0097] 作为单一疗法或者与化疗法联合，针对传染物的抗体组合物的施用导致传染性颗 粒的消除。抗体的单次施用使传染性颗粒的数量通常降低10至100倍，更普遍地大于1000 倍。相似地，在患有恶性疾病的患者中，作为单一疗法或者与化疗法联合使用的抗体疗法使 恶性细胞的数量通常降低10至100倍，或者大于1000倍。治疗可以在延长的时间量中重 复以确保传染性颗粒、恶性细胞等的完全消除。在一些情况中，在不存在可检测量的传染性 颗粒或不期望的细胞的情况下，用抗体制剂治疗可以继续延长的时间。
[0098] 相似地，对于免疫应答的调节，抗体疗法的使用可以由治疗性抗体的单次或多次 施用组成。在不存在任何疾病症状的情况下，治疗可以继续延长的时间。
[0099] 本主题治疗可以以足以抑制传染性疾病或恶性疾病的剂量与化疗法联用。在自身 免疫性疾病患者或移植受者中，抗体疗法可以以足以抑制免疫反应的剂量与免疫抑制疗法 联用。 实施例
[0100] 在对人免疫球蛋白（Ig)基因座为转基因的小鼠中，完全人抗体的递送的次优效 能已归因于人膜IgH链的恒定区和小鼠细胞信号传导机制之间不完善的相互作用。为了避 免此问题，我们在此描述人源化大鼠株（OmniRat?)，其携带嵌合人/大鼠 IgH基因座[包含 22个人Vh、全部的人D和Jh区段，呈天然构型但连接到大鼠 C 因座]连同完全人轻链基 因座[12个连接至J κ-C κ的V κ和16个连接至J λ-C λ的V λ ]。通过设计者锌指核酸 酶使内源性大鼠 Ig基因座沉默。在免疫后，在产生高亲和血清IgG方面，OmniRat与正常 大鼠同样有效地表现。包含具有亚纳摩尔（sub-nanomolar)抗原亲和力的完全人可变区并 且携带广泛的体细胞突变的单克隆抗体可以容易地获得-与来自正常大鼠的常规抗体的 产量相似。
[0101] 材料和方法
[0102] 在YAC和BAC上修饰的人I g基因座的构建
[0103] a) IgH 基因座
[0104] 人IgH V基因被2个BAC覆盖：含有跨越从VH4-39至VH3-23随后VH3-11的真 实区（authentic region)的BAC6-VH3-11(从可商购获得的BAC克隆3054M17CITB进行修 饰）以及含有跨越从VH3-11至VH6-1的真实区的BAC3(811L16RPCI-11)。被称为Annabel 的BAC是通过将大鼠 CH区基因紧邻连接到人VH6-1-Ds-JHs区的下游进行构建的（图1)。 含有人或大鼠 IgH基因座的部分的所有BAC克隆购自Invitrogen。
[0105] 将BAC6-VH3-11和Annabel二者最初在酿酒酵母中构建为环形YAC(cYAC)并进一 步核查并作为BAC在大肠杆菌中供养。构建细节可以在www. ratltd. net查到。
[0106] 不同于YAC，BAC质粒制备物产生大量期望的DNA。为了将线性的YAC转变成 cYAC或者用重叠端将DNA片段组装成酿酒酵母中的单个cYAC，其还可以作为BAC在大 肠杆菌中供养，构建了两个自我复制的酿酒酵母/大肠杆菌穿梭载体PBelo-CEN-URA和 pBeIo-CEN-HYG。简言之，将酿酒酵母CEM作为AvrII片段从pYAC-RC39切出并连接到 SpeI -线性化pAP5994°。所得的质粒含有克隆在酿酒酵母URA3和潮霉素抗性表达盒（HygR) 之间的CEN4。从该质粒，将含有URA3随后CEM的ApaLI - BamHI片段或者含有CEM随 后HygR的PmlI - SphI片段切出，并连接到ApaLI和BamHI或者HpaI和SphI双重消化的 pBACBeloll (New England Biolabs)从而得到 pBelo-CEN-URA 和 pBelo-CEN-HYG。
[0107] 为了构建 BAC6-VH3-11，首先将两个片段 115kb NotI-PmeI 和 IlOkb RsrII-SgrAI 从BAC克隆3054M17CITB切出。前一片段的3'端与后者的5'端重叠22kb。将NotI-PmeI 片段连接到含有来自PYAC-RC的酿酒酵母CEM以及TRP1/ARS1的NotI-BamHI YAC臂，并 将RsrII-SgrAI片段连接到含有也来自pYAC-RC的酿酒酵母URA3的SgrAI-BamHI YAC臂。 随后，通过原生质球转化，将连接混合物转化到酿酒酵母AB1380细胞41，并且选择URA+TRP+ 酵母克隆。含有从人VH4-39至VH3-23的线性区的被称为YAC6的克隆，通过Southern印 迹分析进行确认。通过在VH3-23的3'添加10. 6kb片段并转变成cYAC，将YAC6进一步延 伸。该10. 6kb延伸含有人VH3-11并且也发生在BAC3的5'端。为了 YAC6的修饰，我们构 建了 pBel〇HYG-YAC6+BAC3(5'）。简言之，通过PCR制备具有重叠端的3个片段：1) '填充 (stuff) '片段，其含有由HpaI位点侧接的酿酒酵母TRP1-ARS1，其中在YAC6中5'尾匹配 VH4-39的上游序列并且3 '尾匹配VH3-23的下游（利用长寡核苷酸561和562以及pYAC-RC 作为模板），2) 10. 6kb延伸片段，其具有如上所述的匹配VH3-23的下游序列的5'尾和在它 的3'端的单一 AscI位点（利用长寡核苷酸570和412以及人基因组DNA作为模板），以 及3)pBel〇-CEN-HYG载体，其具有下游与匹配10. 6延伸片段的3'端的同源尾连接的CEM 以及上游与匹配如上所述的VH4-39的上游序列的尾连接的HygR(利用长寡核苷酸414和 566以及pBelo-CEN-HYG作为模板）。随后，通过与原生质球转化相关的同源性重组，将3 个PCR片段组装进在酿酒酵母中赋予HYGR和TRP+的小cYAC，并将此cYAC进一步转变成 BAC pBeloHYG-YAC6+BAC3 (5'）。最后，将 HpaI 消化的 pBeloHYG-YAC6+BAC3 (5'）用来转化 携带YAC6的酵母细胞，并通过同源性重组产生仅赋予HYGR的cYAC BAC6-VH3-11。通过转 化，参见以下，将此cYAC作为BAC引入大肠杆菌中。将BAC6-VH3-11中的人VH基因切出为 约182kb AsiSI (天然存在于HygR中）- AscI片段，并将BAC3中的VH基因切出为约173kb NotI-片段（图1顶部）。
[0108] 对于C区与VH重叠的组装，必须将人VH6-1-D-JH区紧邻随后为大鼠 C的最后JH 的下游的大鼠基因组序列连接从而得到cYAC/BAC。为了实现这一点，制备5个重叠限制和 PCR片段；人VH6-15'的6. Ikb片段（利用寡核苷酸383和384以及人基因组DNA作为模 板）；含有从BACl (RP11645E6)切出的人VH6-1-D-JH区的约78kb PvuI-PacI片段；将人JH6 与紧邻最后JH的下游的大鼠基因组序列连接并含有大鼠 μ编码序列的部分（利用寡核苷 酸488和346以及大鼠基因组DNA作为模板）的8. 7kb片段；约52kb NotI-PmeI片段，该 片段含有从BAC M5(CH230-408M5)切出的真实大鼠 μ、δ和Y2c区；以及具有在下游与匹 配大鼠 γ 2c区的3'端的同源尾连接的URA3以及在上游与匹配所述人VH6-1的5'区的尾 连接的CEM的pBelo-CEN-URA载体（利用长寡核苷酸385和550以及pBelo-CEN-URA作 为模板）。在酿酒酵母中通过同源性重组的正确组装是通过PCR进行分析的，并将来自正确 克隆的纯化的cYAC转变成大肠杆菌中的BAC。
[0109] 对于Annabel的组装，使用以上含有人VH6-1-D-JH、随后的真实大鼠 μ、δ和 γ 2c区的cYAC/BAC的部分，以及PCR片段。五个重叠片段含有如上所述的在人VH6-1的 5'端处的6. Ikb片段；包含人VH6-1-D-JH且其后紧随最后JH的下游大鼠基因组序列并 含有大鼠 Cy的部分的约83kb SpeI片段；将大鼠 μ的3'端与大鼠 γ 1的5'端连接 的5. 2kb片段（利用寡核苷酸490和534以及大鼠基因组DNA作为模板）；含有从BAC 18(〇1230-162108)切出的真实大鼠丫1、丫213、6、（1和3118!1增强子区的约1181* NotI-SgrAI片段；以及具有在下游