] (4)不定苗的再生及生根培养
[0147] 将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生 根培养基中进行培养。
[0148] 培养条件均为：温度为25°C，光照16h/d，光强25001x。
[0149] 4、实验结果
[0150] 本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
[0151] 实施例4本发明黄瓜子房的离体再生方法
[0152] 1、实验材料
[0153] 同实施例3。
[0154] 2、实验用培养基
[0155] 愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为40g/L的蔗糖、 4g/L 的琼脂、2. Omg/L 的 TDZ、0. 5mg/L 的 NAA ;
[0156] 愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的 鹿糖、4g/L 的琼脂、3. Omg/L 的 6-BA、0. lmg/L 的 NAA ;
[0157] 不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、5g/ L 的琼脂、0. lmg/L 的 6-BA ;
[0158] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/ L 的琼脂、0· 05mg/L 的 IBA。
[0159] 3、实验方法
[0160] (1)材料处理
[0161] 于黄瓜开花前5h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75 %乙醇表面 消毒30s，用10 %的NaClO溶液灭菌lOmin，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
[0162] (2)愈伤组织的诱导
[0163] 将步骤（1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱 导培养基中；
[0164] 首先热激处理：温度35°C，黑暗下48h ;然后转至光下培养：培养温度为25°C，光 照16h/d，光强25001x，30天继代1次。
[0165] 在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大，培养30天后子房腔内壁出现很 多松脆的淡黄色愈伤组织。
[0166] (3)愈伤组织的增殖及分化
[0167] 将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大， 由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm 2的愈伤组织再切割为大小为0. 5cm 2的小愈伤 团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈 伤组织。40天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到90天左右见 到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
[0168] 培养条件：温度为25°C，光照16h/d，光强25001x。
[0169] (4)不定苗的再生及生根培养
[0170] 将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生 根培养基中进行培养。
[0171] 培养条件均为：温度为25°C，光照16h/d，光强25001x。
[0172] 4、实验结果
[0173] 本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
[0174] 实施例5本发明黄瓜子房的离体再生方法
[0175] 1、实验材料
[0176] 华北型黄瓜品种'川翠 3号'，种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内， 株行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
[0177] 2、实验用培养基
[0178] 愈伤组织诱导培养基：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为35g/L的蔗糖、 7g/L 的琼脂、I. 2mg/L 的 TDZ、0. 2mg/L 的 NAA ;
[0179] 愈伤组织增殖及分化培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的 鹿糖、7g/L 的琼脂、2. 5mg/L 的 6-BA、0. lmg/L 的 NAA ;
[0180] 不定苗伸长培养基：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/ L 的琼脂、0· 5mg/L 的 6-BA ;
[0181] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的蔗糖、7g/ L 的琼脂、0· 05mg/L 的 IBA。
[0182] 3、实验方法
[0183] (1)材料处理
[0184] 于黄瓜开花前8h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75%乙醇表面 消毒30s，用10 %的NaClO溶液灭菌lOmin，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
[0185] (2)愈伤组织的诱导
[0186] 将步骤（1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱 导培养基中；
[0187] 首先热激处理：温度34°C，黑暗下48h ;然后转至光下培养：培养温度为24°C，光 照16h/d，光强20001x，30天继代1次。
[0188] 在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大，培养60天后子房腔内壁出现很 多松脆的淡黄色愈伤组织。
[0189] (3)愈伤组织的增殖及分化
[0190] 将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大， 由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm 2的愈伤组织再切割为大小为0. 5cm 2的小愈伤 团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈 伤组织。60天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到120天左右见 到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
[0191] 培养条件：温度为24°C，光照16h/d，光强20001x。
[0192] (4)不定苗的再生及生根培养
[0193] 将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生 根培养基中进行培养。
[0194] 培养条件均为：温度为24°C，光照16h/d，光强20001x。
[0195] 4、实验结果
[0196] 本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
[0197] 实施例6本发明黄瓜子房的离体再生方法
[0198] 1、实验材料
[0199] 华北型黄瓜品种'津优35'，种植于四川省农业科学院园艺研究所塑料大棚内，株 行距、水肥管理按照一般水平进行管理。
[0200] 2、实验用培养基
[0201] 同实施例1。
[0202] 3、实验方法
[0203] (1)材料处理
[0204] 于黄瓜开花前6h取未授粉子房，自来水冲洗2h，在超净工作台上用75%乙醇表面 消毒30s，用10 %的NaClO溶液灭菌lOmin，再用无菌水冲洗3遍，得到处理好的子房。
[0205] (2)愈伤组织的诱导
[0206] 将步骤（1)得到的处理好的子房纵剖为两半，果皮接触培养基接种于愈伤组织诱 导培养基中；
[0207] 首先热激处理：温度36°C，黑暗下72h ;然后转至光下培养：培养温度为26°C，光 照16h/d，光强20001x，30天继代1次。
[0208] 在愈伤组织诱导培养基上，子房切片胚珠不膨大，培养60天后子房腔内壁出现很 多松脆的淡黄色愈伤组织。
[0209] (3)愈伤组织的增殖及分化
[0210] 将淡黄色愈伤组织转移到愈伤组织增殖及分化培养基上培养，愈伤团面积增大， 由淡黄色逐渐变为黄绿色。将面积大于3cm 2的愈伤组织再切割为大小为0. 5cm 2的小愈伤 团，愈伤组织可继续生长并持续分化。通过这种方式，1个愈伤组织可持续扩繁，得到大量愈 伤组织。60天后愈伤组织由黄绿色变绿色，并且开始出现绿色突起的芽点，到120天左右见 到叶、芽分化，继续培养得到丛生芽。
[0211] 培养条件：温度为26°C，光照16h/d，光强20001x。
[0212] (4)不定苗的再生及生根培养
[0213] 将丛生芽转移到不定苗伸长培养基中培养，使不定苗伸长至2cm高时切下转入生 根培养基中进行培养。
[0214] 培养条件均为：温度为26°C，光照16h/d，光强20001x。
[0215] 4、实验结果
[0216] 本发明方法可得到黄瓜的离体再生植株。
[0217] 以下用试验例的方式说明本发明的有益效果：
[0218] 试验例1本发明方法得到的再生植株倍性鉴定
[0219] 1、实验材料
[0220] 取实施例1得到的'白丝条'再生植株20株，以'白丝条'正常二倍体植株叶片为 对照，利用流式细胞仪对20棵再生植株进行倍性鉴定。
[0221] 2、实验方法
[0222] 配制 LBOl 解离液：15mM Tris，2mM Na2EDTA,0. 5mM 四盐酸精胺，80mM KCl，20mM NaCl，0.1% (v/v)TritonX-100，15mMP 疏基乙醇，pH 7.0 ~8·0〇
[0223] 1)取黄瓜再生植株幼嫩叶片lg，蒸馏水洗净，滤纸吸干后放入预冷的培养皿里， 加入预冷的LBOl解离液1~2mL，用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程，材料须浸没在 解离液里，以便更好的游离细胞核；
[0224] 2)吸取培养皿内的解离液，用400目的滤膜过滤到I. 5mL离心管中，然后置于4°C 冰箱中孵育5min ;
[0225] 3)离心，转速：1000r/min，温度：4°C，时间：5min ;
[0226] 4)弃上清后，再加入100 μ 1预冷的解离液，同时加入150 μ L预冷的染料，每个样 共约250 μ 1细胞核悬浮液，然后置4°C冰箱避光染色IOmin ;
[0227] 5)移至上样管，上机检测，收集5000-10000个颗粒。
[0228] 3、实验结果
[0229] 见图8,流式细胞仪测定'白丝条'正常二倍体植株Gl、S、G2期平均PE-A值（图 8a，8c)，再生植株Gl、S、G2期平均PE-A值（图8b，8d)，表明再生植株与正常植株各时期 DNA的含量基本一致。
[0230] 8c和8d表明，'白丝条'正常植株、再生植株处于G1、G2、S等不同细胞周期的细胞 含量及对应阶段的DNA含量水平相当，表明20棵再生植株均为二倍体。由于'白丝条'为 基因型纯合的地方品种（基因型aa或者AA)，其再生植株不论是否由雌核细胞或者是由体 细胞发育而来，基因型均与'白丝条'相同（aa或者AA)，无需进行基因型鉴定。
[0231] 试验例2本发明方法得到的再生植株基因型鉴定
[0232] 1、实验材料
[0233] 华南型地方品种黄瓜品种'川绿1号'的父本、母本和5株再生植株。
[0234] 2、实验方法
[0235] 取幼嫩叶片用CTAB法小量提取DNA。DNA在I %琼脂糖凝胶上检测DNA质量，并稀 释到适当浓度的工作液，-20°C保存备用。进行分子标记ssrl6005、ssrl9165的基因型鉴 定。PCR反应体系如下：总共25yL，包括：20ng模板DNA，正向、反向引物各1.0μΜ(各自引 物序列见表2)，1父？0?131^€61，1.01]139酶，0.