长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法，长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法包括；将供体麻醉，将供肝从供体切取出；将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。本发明施行长爪沙鼠原位肝移植，观察长爪沙鼠原位肝移植模型的变化，计算成活率。一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括：用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将供肝从供体切取出；从供肝中分离得到的肝星状细胞。本发明分离方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度。
【专利说明】
长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及长爪沙鼠肝移植和细胞分离技术领域，具体涉及长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法及肝星状细胞的分离方法。
【背景技术】
[0002]稳定、可靠的肝移植动物模型是临床肝移植和免疫耐受研究的基础。只有成熟稳定的动物模型作为技术平台，器官移植和免疫耐受研究的发展才能有质的飞跃。虽然大鼠肝移植模型是目前较为常用的动物模型，但封闭群大鼠用于该模型，其稳定性和重现性有待进一步提高，而近交系大鼠模型稳定性提高了，但由于资源相对匮乏，不易获取，而且较为昂贵，因此进一步寻求稳定，易得的实验动物肝移植模型，对于研究工作的进行至关重要。
[0003]小动物肝移植模型目前最常用的手术方式有单套管法(S卩门静脉行套管吻合)，双套管法(门静脉、肝下下腔静脉行套管吻合，而肝上上腔静脉采用缝合法)，三套管法(门静脉、肝下下腔静脉、肝上上腔静脉均用套管吻合法)。单套管法最主要的缺点是无肝期及受体总体手术时间相对较长，目前公认这两个时间的长短是术后存活情况的关键，缩短手术期及无肝期可减轻受体血流动力学、生化等方面的病理生理改变，减轻供肝的缺血再灌注损伤，因此，目前已经较少采用该术式。而三套管法虽然能有效减少无肝期(较双套管法平均缩短5?6分钟)，但在该法中，肝上上腔静脉较容易发生套管扭曲、脱落及血管通而不畅的并发症。
[0004]长爪沙鼠又称蒙古沙鼠(Mer1nesUnguieulataus,Mongolian gerbil)，分类学上属于啮齿目、仓鼠科、沙鼠亚科、沙鼠属。近年来，作为重要的实验动物资源，长爪沙鼠在国内的使用率越来越高，其应用领域也不断扩大，国家“十一五”、“十二五”科技支撑计划，相继将长爪沙鼠的标准化及其动物模型开发纳入实验动物领域重大资助项目。长爪沙鼠由于其独特的生理、解剖学和行为学特征，成为一种正在进行开发有着广阔应用前景的多功能实验动物。
【申请人】前期研究表明长爪沙鼠脂质代谢与人类相似，连续16周高脂饲料喂养，长爪沙鼠可发生脂肪肝系列病变最终导致肝纤维化的发生，提示长爪沙鼠在肝硬化方面的研究是很有价值的模型动物，而肝移植是临床上治疗终末期肝硬化的根本解决办法，因此，长爪沙鼠原位肝移植模型的建立将为终末期肝硬化疾病的肝移植治疗与观察提供动物模型及技术支持。
[0005]另现有大量文献表明，长爪沙鼠对多种细菌、病毒和寄生虫等病原体(如幽门螺旋杆菌、流行性出血热病毒、布鲁丝虫等)的感染非常敏感，是理想的感染性疾病模型动物。因此本文所建立的长爪沙鼠原位肝移植模型将进一步用于观察长爪沙鼠肝移植后的免疫反应，填补长爪沙鼠在器官移植中免疫学研究的空白。目前，国内外尚无文献报道长爪沙鼠应用于器官移植，故本文以长爪沙鼠作为供、受体，为长爪沙鼠在肝移植中的应用搭建良好的技术平台，填补该动物在器官移植中的空白。
【发明内容】
[0006]针对现有不足，本发明的目的是提供一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，施行长爪沙鼠原位肝移植，观察长爪沙鼠原位肝移植模型的变化，计算成活率。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0008]一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，包括；
[0009]I)将供体麻醉，将供肝从供体切取出；
[0010]2)将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中；
[0011]3)计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。
[0012]步骤I)中，所述的供体麻醉的条件为:采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射，即采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉后进行供肝切取，进一步优选，采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射。
[0013]将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0?6.0mm，外径为0.8?1.2mm，进一步优选，长为5.0mm，外径为1.0mm。
[0014]将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5?2.5mm，门静脉血管套管的内径为1.5?2.3mm，外径为1.8?2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2?2.6mm，外径为2.4?3.2mm，进一步优选，套管柄的长度为2.0mm，门静脉血管套管的内径为1.8mm，外径为2.1mm,肝下下腔静脉血管套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。
[0015]将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝。
[0016]将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。
[0017]将供肝从供体切取过程中，胆管支架和血管套管均放置在O?4°C的生理盐水冰浴中进行。
[0018]进一步优选地，所述的生理盐水的温度为O?4°C、含20?30U/ml肝素;灌注速度为2.0?3.0ml/min ；灌注用量为10?30ml。更进一步优选，所述的生理盐水的温度为O?4°C、含25U/ml肝素;灌注速度为2.5ml/min;灌注用量为20ml。
[0019]步骤2)中，所述的受体麻醉的条件为:采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉，即采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉下进行切除肝脏、植入供肝的，进一步优选，采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。
[0020]—种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，包括:
[0021]a)用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将供肝从供体切取出；
[0022]b)将供肝，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物；
[0023]c)向搅拌消化后的产物中加入第一 Hank’s液，过滤，得肝组织;然后向肝组织中加第二Hank’ s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’ s液重悬沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。
[0024]本发明的分离方法，成功地分离了长爪沙鼠的肝星状细胞，简便可行，并为进一步研究HSC与肝纤维化的关系奠定了基础。同时，本发明方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度，为进一步研究肝星状细胞在肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化的形成奠定了基础。
[0025]步骤a)中，将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0?6.0mm，外径为0.8?1.2mm，进一步优选，长为5.0mm，外径为1.0mm。
[0026]将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5?2.5mm，门静脉血管套管的内径为1.5?2.3mm，外径为1.8?2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2?2.6mm，外径为2.4?3.2mm，进一步优选，套管柄的长度为2.0mm，门静脉血管套管的内径为1.8mm，外径为2.1mm,肝下下腔静脉血管套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。
[0027]将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝。
[0028]将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。
[0029]将供肝从供体切取过程中，胆管支架和血管套管均放置在O?4°C的生理盐水冰浴中进行。
[0030]所述的供肝从供体切取出具体包括以下步骤:
[0031]1、用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将雄性长爪沙鼠仰卧位固定，消毒，腹部行十字切口，止血钳夹住剑突向头侧牵引固定，充分暴露肝脏，以生理盐水纱布覆盖供肝，切断镰状韧带，以缝合线结扎紧贴着肝上下腔静脉的左膈下静脉；
[0032]I1、将肝脏翻向头侧，用棉签游离胃小弯背腹侧的乳头叶和尾状叶，暴露胆总管，在左右肝管汇合处下2.8?3.2mm处剪一V形切口，插入胆管支架，缝合线结扎固定，远端离断胆总管；
[0033]II1、将肠道切断后腹膜与右下叶间的联系，从右肾静脉以上水平游离肝下下腔静脉，右肾动脉，以缝合线结扎右肾静脉及右肾上腺静脉。
[0034]IV、暴露腹主动脉及其分叉，从髂静脉处穿刺，注射含肝素的生理盐水，使全血肝素化，以头皮针穿刺肾下端的腹主动脉，并快速剪破左侧膈肌进胸，阻断胸主动脉，同时剪开胸段下腔静脉，让灌流液流出，供体鼠经腹主动脉用O?4°C生理盐水灌注，速度为2.0?
3.0ml/min，肝脏呈土黄色时即表示灌注良好；
[0035]V、钝性分离肝动脉，门静脉及其分支，用缝合线结扎幽门静脉，远端离断，在幽门静脉结扎线以下1.8?2.2mm处切断门静脉，切断左肾静脉水平的肝下下腔静脉、右肾上腺静脉及右肾静脉，紧贴膈肌离断肝上下腔静脉，取出供肝，并置于O?4°C的生理盐水中。之后将供肝用于肝星状细胞的分离。
[0036]步骤2)中，所述的联合酶液，由以下体积百分数的组分组成:0.02%?0.08%的链酶蛋白酶和0.05 %?0.2 %的胶原酶以及余量的Hank ’ s液，进一步优选，由以下体积百分数的组分组成:0.05%的链酶蛋白酶、0.1 %的胶原酶以及余量的Hank’ s液。
[0037]所述的灌注消化的条件为:35°C?39°C灌注消化5?20min;进一步优选，所述的灌注消化的条件为:37°C灌注消化lOmin。
[0038]所述的混合酶液，由以下体积百分数的组分组成:0.02%?0.08%的链酶蛋白酶、
0.05%?0.2%的胶原酶、0.0005%?0.003%的DNaseI以及余量的Hank’s液。进一步优选为，由以下体积百分数的组分组成:0.05%的链酶蛋白酶、0.1 %的胶原酶、0.001 %的DNaseI以及余量的Hank’s液。
[O O3 9 ]所述的搅拌消化的条件为:3 5 °C?3 9 °C搅拌消化1?2 O m i η;进一步优选，所述的搅拌消化的条件为:3 7 °C搅拌消化1?15m i η。
[0040]步骤3)中，第一Hank’s液、第二Hank’s液和第三Hank’s液均为Hank’s液，可采用现有技术。
[0041]所述的过滤采用80目?120目的钢丝筛，进一步优选，所述的过滤采用100目钢丝筛。
[0042]所述的初步离心的条件为:300g?400g、5min?20min，进一步优选，所述的初步离心的条件为:350g、10min。
[0043]所述的再次离心的条件为:2°C?6°C、1200g?1600g、13min?23min。进一步优选，所述的再次离心的条件为:4°C、1400g、18min。
[0044]所述的Nycodenz液可选用20%Nycodenz液，由体积百分比20%的Nycodenz分离液和体积百分比80%的Hank’s液，即20%Nycodenz液由体积比20%:80%的Nycodenz分离液和Hank’s液制成。
[0045]与现有技术相比，本发明具有如下改进之处和有益效果:
[0046](I)为减少长爪沙鼠在手术中的死亡率，麻醉深度(尤其是受体)的掌握是关键。常用的乙醚开放麻醉具有简单易操作的优点，但具有诱导期长，动物反抗激烈，不易固定的缺点。本发明受体采用氯胺酮(50mg/kg，腹腔注射)与乙醚(吸入)联合用药的方法，可有效避免上述缺点。术中偶尔会出现麻醉过深可导致呼吸抑制，或阻断肝上下腔静脉时，钳夹膈肌过多或下拉膈肌过猛，可造成呼吸骤停，此时采用1ml注射筒联合胸腔按压进行类似人工呼吸的紧急抢救，效果理想。
[0047](2)套管/支架的选择应视动物大小、血管/胆管粗细而异。总体原则是套管/支架在有一定硬度的条件下越薄越好，套管的内径与血管外径接近，过细或过粗都会发生回流不畅，静脉腔张开不全，甚至发生套管扭转、脱落。为方便结扎固定，需要加刻横槽。我们选用硬膜外导管和聚乙烯管分别作为套管和支架的材料，在加热后拉伸出不同的直径。
[0048](3)在血管的吻合/缝合过程中，必需要用生理盐水冲洗管腔，可以防止血管壁粘连引起的血管狭窄，并用以排出气泡，避免由于空气栓塞导致的肝叶坏死，肝脓肿。在吻合胆管时亦应冲洗管腔，可减少术后胆道梗阻的发生。在缝合/吻合过程中，生理盐水的冲洗，还可使术野清晰，提高缝合/吻合的速度与质量。
[0049](4)在肝移植术中，由于感染引起的肾功能、呼吸功能衰竭亦是术后死亡的主要原因。因此发明人在术中十分注重无菌操作。首先，手术器械、棉签、纱布、手术衣等均经过20min 121°C高压灭菌。不可高压的物品如套管、胆管支架等均用戊二醛浸泡消毒;冰块亦用无菌手术巾包裹。其次手术在屏障系统实验室的超净工作台中完成。超净工作台按细胞无菌培养的有关规范进行环境控制。整个手术实验室亦定期用万洁进行喷雾消毒并擦拭天花板与墙面，术前用紫外灯照射。以上措施可有效减少感染的发生。
[0050](5)长爪沙鼠的肝脏极为娇嫩，在供肝的获取过程中的任何接触均可造成局部微循环障碍，激活Kuffer细胞，释放大量的ROS及炎症因子，最终加重肝脏的缺血再灌注损伤。因此发明人在手术时动作轻柔，对供肝的保护始终放在重要位置。
[0051](6)本发明提供了长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法能够提高肝星状细胞的产量和活率，可以保证HSCs纯度。
【附图说明】
[0052]图1为供体肝脏灌注过程中的照片；
[0053]图2为供体肝脏修整过程中的照片；
[0054]图3为供体肝脏套管插入与固定过程中的照片；
[0055]图4为受体肝脏切除过程中的照片；
[0056]图5为受体进入无肝期的照片；
[0057]图6为受体植入供肝过程中的照片。
【具体实施方式】
[0058]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
[0059]实施例1:
[0060]1、材料与方法
[0061 ] 1.1实验动物:长爪沙鼠，雄性，体重40?50g由浙江实验动物中心提供，生产许可证 SCXK(浙)2014-0001;
[0062]饲养条件:实验过程在屏障系统实验室中完成(空气洁净度万级，换气次数10?20次/小时，温度20?26 °C，日温差彡3 °C，相对湿度40?70 % )。使用许可证SYXK(浙)2014-
0008。长爪沙鼠饲喂60Co灭菌的营养配合饲料，饮用超滤水，笼器具、垫料等均经121°C高压灭菌，消毒20分钟。
[0063]1.2实验器材:乙醚(杭州市化学试剂厂)、氯胺酮针(1001^/21111，杭州市第一制药厂)，肝素注射液(5000U/2ml，杭州市第一制药厂)，显微手术器械(上海医药器械厂)，缝合线(杭州华威医疗器械有限公司)均购自华东医药股份有限公司。超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)。
[0064]1.3术前准备:供体和受体术前均禁食24h，自由饮水。供体体重约等于或略小于受体。供体采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，受体采用小剂量氯胺酮(50mg/kg)腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。手术在屏障系统实验室超净工作台内进行无菌操作。
[0065]1.3.1血管套管和胆管支架的制备
[0066]胆管支架长5.0mm，外径1.0mm，由硬膜外导管制成，两端修成斜面。
[0067]门静脉、肝下下腔静脉套管由聚乙烯塑料管制成，包含2.0mm的套管柄和套管体。套管体上刻有横纹，以方便结扎固定。门静脉套管内径为1.8mm，外径为2.1mm。肝下下腔静脉套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。
[0068]1.3.2供肝切取、肝脏暴露
[0069]长爪沙鼠备皮麻醉后仰卧位固定，消毒，腹部行大十字切口。止血钳夹住剑突向头侧牵引固定，充分暴露肝脏，以生理盐水纱布覆盖供肝。切断镰状韧带，以8-0缝合线结扎紧贴着肝上下腔静脉的左膈下静脉。
[0070]1.3.3处理胆管与肝门
[0071 ]将肝脏翻向头侧，用棉签游离胃小弯背腹侧的乳头叶和尾状叶，暴露胆总管，在左右肝管汇合处下3.0mm处剪一 “V”形切口，插入胆管支架，5-0缝合线结扎固定，远端离断胆总管。
[0072]1.3.4肝周血管的处理
[0073]将肠道推向左侧，切断后腹膜与右下叶间的联系，从右肾静脉以上水平游离肝下下腔静脉，右肾动脉，以8-0缝合线结扎右肾静脉及右肾上腺静脉。
[0074]1.3.5全血肝素化及肝灌流(图1)
[0075]暴露腹主动脉及其分叉，从髂静脉处穿刺，注射含100U肝素的生理盐水2ml(含50U/ml肝素)，使全血肝素化。以头皮针穿刺肾下端的腹主动脉，并快速剪破左侧膈肌进胸，阻断胸主动脉，同时剪开胸段下腔静脉，让灌流液流出。供体鼠经腹主动脉用O?4°C20ml生理盐水(含25U/ml肝素)灌注，速度为2.5ml/min，肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。
[0076]钝性分离肝动脉，门静脉及其分支，用8-0缝合线结扎幽门静脉，远端离断，在幽门静脉结扎线以下2.0mm处切断门静脉，切断左肾静脉水平的肝下下腔静脉、右肾上腺静脉及右肾静脉。紧贴膈肌离断肝上下腔静脉，取出供肝，并置于O?4°C的生理盐水中。
[0077]1.3.5修肝及套管的安置(图2，图3)
[0078]修肝及套管的安置均在O?4°C的生理盐水冰浴中进行。去除门静脉及肝下下腔静脉周围的脂肪组织，将自制套管管柄朝下，用显微直颞将肝下下腔静脉从套管中拉出，并将血管壁外翻套于套管上，用5-0的缝合线结扎固定。同法安装门静脉套管。在肝上下腔静脉两角用8-0带针缝合线各吊一针，作为两点式缝合的支持线，完毕后置于4°C冰箱保存。
[0079]1.3.6受体肝切除(图4，图5)
[0080]与供肝同法暴露，游离肝脏，区别在于开腹切口略小，游离肝门内结构时应尽量靠近肝脏，受体内留有足够长度的胆道与血管，分离肝下下腔静脉时则在右肾静脉上缘水平。具体如下:腹部正中切口，用自制拉钩暴露肝脏，向左侧外移肠道并用生理盐水纱布覆盖。离断镰状韧带，缝扎左膈下静脉，游离左三角韧带，结扎离断食管与左肝之间的交通支。同供肝方法暴露胆总管并结扎离断，以8-0缝合线结扎肝动脉。游离右肾静脉平面之上的肝下下腔静脉，远离下腔静脉结扎右肾上腺静脉丛。离断右三角韧带，游离肝上下腔静脉，并在其后方放置一细橡皮条以备牵引。用动脉夹先后阻断右肾静脉水平以上的肝下下腔静脉以及幽门静脉以上的门静脉。于门静脉分叉处注入2ml生理盐水将肝内血液驱入长爪沙鼠体内。牵引肝上预留的橡皮条，用动脉夹阻断肝上下腔静脉，切断近肝的肝上下腔静脉、门静脉和肝下下腔静脉，移出原肝，密切注意后腹膜有无出血点。
[0081 ] 1.3.7供肝的植入(图6)
[0082]从冰水浴中取出供肝，置入上腹部，调整供肝和受体，使肝上下腔静脉处于最佳吻合位置。利用供肝肝上下腔静脉的二根预埋缝合线，从左到右连续缝合血管后壁再到前壁，结束吻合前用生理盐水冲洗管腔以排出气泡。肝上下腔静脉吻合完成后，将肝向头侧翻起，将门静脉动脉夹下移至脾静脉水平处，用生理盐水冲净血管腔内的血块和气泡，夹住供肝门静脉套管柄，将门静脉套管套入受体门静脉内，以5-0缝合线结扎固定。同法连接肝下下腔静脉。开放受体门静脉及肝上上、下腔静脉，结束无肝期。轻拉受体胆总管，在近结扎处前剪一“V”形切口，将供肝胆总管支架插入受体胆总管内，6-0缝合线结扎固定。将肠道放回原位，逐层关腹。术后保温，单笼饲养，待恢复正常饮食方可合群。
[0083]2、结果
[0084]正式实验，共行长爪沙鼠原位肝移植60例。手术成功52例。供体手术时间为34.56±5.1211^11，修肝及安置套管时间为15.43±2.7511^11，受体手术时间为58.37±8.5411^11，其中无肝期为23.66±4.47min。
[0085]实施例2
[0086]2、材料与方法
[0087]1.1实验动物:长爪沙鼠，雄性，体重40?50g由浙江实验动物中心提供，生产许可证 SCXK(浙)2014-0001;
[0088]饲养条件:实验过程在屏障系统实验室中完成(空气洁净度万级，换气次数10?20次/小时，温度20?26 °C，日温差彡3 °C，相对湿度40?70 % )。使用许可证SYXK(浙)2014-
0008。长爪沙鼠饲喂60Co灭菌的营养配合饲料，饮用超滤水，笼器具、垫料等均经121°C高压灭菌，消毒20分钟。
[0089]2.2实验器材:乙醚(杭州市化学试剂厂)、氯胺酮针(1001^/21111，杭州市第一制药厂)，肝素注射液(5000U/2ml，杭州市第一制药厂)，显微手术器械(上海医药器械厂)，缝合线(杭州华威医疗器械有限公司)均购自华东医药股份有限公司。超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)。链霉蛋白酶E(Pronase E)，IV型胶原酶(TypeIV collagenase)，DNase
1、Nycodenz分离液购自Sigma公司;DMEM培养液购自Invitrogen公司；胎牛血清为杭州四季青公司产品。
[0090]2.3术前准备:供体和受体术前均禁食24h，自由饮水。供体体重约等于或略小于受体。供体采用120mg/kg氯胺酮腹腔注射麻醉，受体采用小剂量氯胺酮(50mg/kg)腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。手术在屏障系统实验室超净工作台内进行无菌操作。
[0091 ] 2.3.1血管套管和胆管支架的制备
[0092]胆管支架长5.0mm，外径1.0mm，由硬膜外导管制成，两端修成斜面。
[0093]门静脉、肝下下腔静脉套管由聚乙烯塑料管制成，包含2.0mm的套管柄和套管体。套管体上刻有横纹，以方便结扎固定。门静脉套管内径为1.8mm，外径为2.1mm。肝下下腔静脉套管内径为2.6mm，外径为2.8mm。
[0094]2.3.2供肝切取、肝脏暴露
[0095]长爪沙鼠备皮麻醉后仰卧位固定，消毒，腹部行大十字切口。止血钳夹住剑突向头侧牵引固定，充分暴露肝脏，以生理盐水纱布覆盖供肝。切断镰状韧带，以8-0缝合线结扎紧贴着肝上下腔静脉的左膈下静脉。
[0096]2.3.3处理胆管与肝门
[0097]将肝脏翻向头侧，用棉签游离胃小弯背腹侧的乳头叶和尾状叶，暴露胆总管，在左右肝管汇合处下3.0mm处剪一 “V”形切口，插入胆管支架，5-0缝合线结扎固定，远端离断胆总管。
[0098]2.3.4肝周血管的处理
[0099]将肠道推向左侧，切断后腹膜与右下叶间的联系，从右肾静脉以上水平游离肝下下腔静脉，右肾动脉，以8-0缝合线结扎右肾静脉及右肾上腺静脉。
[0100]2.3.5全血肝素化及肝灌流
[0101]暴露腹主动脉及其分叉，从髂静脉处穿刺，注射含100U肝素的生理盐水2ml(含50U/ml肝素)，使全血肝素化。以头皮针穿刺肾下端的腹主动脉，并快速剪破左侧膈肌进胸，阻断胸主动脉，同时剪开胸段下腔静脉，让灌流液流出。供体鼠经腹主动脉用O?4°C20ml生理盐水(含25U/ml肝素)灌注，速度为2.5ml/min，肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。
[0102]钝性分离肝动脉，门静脉及其分支，用8-0缝合线结扎幽门静脉，远端离断，在幽门静脉结扎线以下2.0mm处切断门静脉，切断左肾静脉水平的肝下下腔静脉、右肾上腺静脉及右肾静脉。紧贴膈肌离断肝上下腔静脉，取出供肝，并置于O?4°C的生理盐水中。
[0103]2.3.6将供肝移入37 °C水浴中的250ml烧杯，循环灌注预温至37 °C的联合酶液50ml(联合酶液由体积百分数0.05%链霉蛋白酶E、0.1 % IV型胶原酶以及余量的Hank ’ s液组成)，消化肝脏10分钟。在培养皿中去除肝包膜和Glisson鞘。将肝脏粉碎成糊状，放入混合酶液(混合酶液由体积百分比0.05 %链霉蛋白酶E、0.1 % IV型胶原酶、0.001 % DNaseI以及余量的Hank’s液)中，37°C水浴用镊子搅拌10?15min，使肝组织充分得到消化，得到消化好的肝组织。
[0104]将消化好的肝组织加入4°CHank’ s液50ml，用100目钢丝筛过滤。滤过的肝组织分装入两支50ml离心管中，加Hank’s液至50ml，350g离心1min。取沉淀重悬于50ml Hank’s液中，再次350g离心lOmin。合并沉淀加50ml Hank’s液1ml重悬，吸取2ml置于1ml玻璃离心管中，加入3ml的20 %Nycodenz液(由体积比20 %: 80 %的Nycodenz分离液和Hank ’ s液制成)混匀，按此比例分装完全部沉淀，每管液面覆盖2ml Hank，s液，1400g，4°C离心18min，轻轻取出，不要摇动液面，可见在Hank.s液下有一混浊带。用16号针头插入液面下此处抽吸混浊带于1ml离心管，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。加DMEM培养液，900g离心lOmin，沉淀重悬于1ml左右DMEM培养液中，然后加入1.1Iml胎牛血清。计数细胞产量并且行台盼蓝拒染试验，判断活力。
[0105]2.3.7细胞鉴定
[0106]325nm波长紫外光激发细胞自发荧光。光镜观察细胞形态。免疫组织化学方法鉴定肝星状细胞的Desmin(结蛋白)、A-SMA(a_平滑肌肌动蛋白)的表达情况。表明得到的为肝星状细胞(HSC)。
[0107]2.3.8 HSC的存活率与得率
[0108]采用Nycodenz密度梯度离心法分离长爪沙鼠HSC，长爪沙鼠平均体重为45克，每只鼠肝的细胞得率约为(0.7?0.8) X 17个。根据台盼蓝拒染试验，细胞活力为(99.6)%。
[0109]以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
【主权项】
1.一种长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，包括； 1)将供体麻醉，将供肝从供体切取出； 2)将受体麻醉，切除肝脏，将供肝植入切除肝脏的受体中； 3)计算长爪沙鼠原位肝移植模型的存活率。2.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤I)中，所述的供体麻醉的条件为:采用100?140mg/kg氯胺酮腹腔注射。3.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤I)中，将供肝从供体切取过程中，采用的胆管支架由硬膜外导管制成，两端修成斜面，长为4.0?6.0mm，外径为0.8?1.2mm。4.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤I)中，将供肝从供体切取过程中，采用的血管套管由聚乙烯塑料管制成，血管套管包括套管体以及与所述套管体连接的套管柄，套管柄的长度为1.5?2.5mm，门静脉血管套管的内径为.1.5?2.3mm，外径为1.8?2.4mm，肝下下腔静脉血管套管内径为2.2?2.6mm，外径为2.4?.3.2mm.5.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤I)中，将供肝从供体切取过程中，供体腹部被打开、暴露供肝后，用生理盐水纱布覆盖供肝； 将供肝从供体切取过程中，供体经腹主动脉用生理盐水灌注至肝脏呈土黄色时即表示灌注良好。6.根据权利要求5所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤I)中，所述的生理盐水的温度为O?4°C、含20?30U/ml肝素；灌注速度为2.0?3.0ml/min ；灌注用量为10?30ml。7.根据权利要求1所述的长爪沙鼠原位肝移植模型的建立方法，其特征在于，步骤2)中，所述的受体麻醉的条件为:采用40?60mg/kg氯胺酮腹腔注射联合乙醚吸入联合用药麻醉。8.一种长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于，包括: a)用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将供肝从供体切取出； b)将供肝，先移入联合酶液中灌注消化，然后去除肝包膜和Glisson鞘，粉碎肝脏呈糊状，再移入混合酶液，搅拌消化，得到搅拌消化后的产物； c)向搅拌消化后的产物中加入第一Hank’ s液，过滤，得肝组织;然后向肝组织中加第二Hank’s液，初步离心，得沉淀；用第三Hank’s液重悬沉淀，再向其加入Nycodenz液混勾，再次离心，得浑浊带，浑浊带即为分离得到的肝星状细胞。9.根据权利要求8所述的长爪沙鼠的肝星状细胞的分离方法，其特征在于，步骤a)中，所述的供肝从供体切取出具体包括以下步骤: I、用水合氯醛腹腔内注射麻醉雄性长爪沙鼠或选用刚刚死亡的雄性长爪沙鼠，将雄性长爪沙鼠仰卧位固定，消毒，腹部行十字切口，止血钳夹住剑突向头侧牵引固定，充分暴露肝脏，以生理盐水纱布覆盖供肝，切断镰状韧带，以缝合线结扎紧贴着肝上下腔静脉的左膈下静脉； I1、将肝脏翻向头侧，用棉签游离胃小弯背腹侧的乳头叶和尾状叶，暴露胆总管，在左右肝管汇合处下2.8?3.2mm处剪一V形切口，插入胆管支架，缝合线结扎固定，远端离断胆总管； II1、将肠道切断后腹膜与右下叶间的联系，从右肾静脉以上水平游离肝下下腔静脉，右肾动脉，以缝合线结扎右肾静脉及右肾上腺静脉。 IV、暴露腹主动脉及其分叉，从髂静脉处穿刺，注射含肝素的生理盐水，使全血肝素化，以头皮针穿刺肾下端的腹主动脉，并快速剪破左侧膈肌进胸，阻断胸主动脉，同时剪开胸段下腔静脉，让灌流液流出，供体鼠经腹主动脉用O?4°C生理盐水灌注，速度为2.0?3.0ml/min，肝脏呈土黄色时即表示灌注良好； V、钝性分离肝动脉，门静脉及其分支，用缝合线结扎幽门静脉，远端离断，在幽门静脉结扎线以下1.8?2.2mm处切断门静脉，切断左肾静脉水平的肝下下腔静脉、右肾上腺静脉及右肾静脉，紧贴膈肌离断肝上下腔静脉，取出供肝。
【文档编号】C12N5/071GK105941329SQ201610375000
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】楼琦, 石巧娟, 卢领群, 李巍, 郭红刚, 杜江涛, 应华忠
【申请人】浙江省医学科学院