人造血细胞相关基因－1的制作方法

专利名称：人造血细胞相关基因－1的制作方法
一.研究领域本研究涉及人造血细胞分化相关基因-1(以下称Hemagene-1)基因全长cDNA的分子克隆及功能研究。通过构建原核表达载体并转化合适的原核宿主细胞获得表达蛋白质；通过构建真核表达载体并转染合适的宿主细胞，经筛选后获得稳定表达Hemagene-1的细胞株，稳定表达Hemagene-1的细胞发生恶性转变，表明该基因具有转化活性；该基因在白血病细胞高表达，可能应用于白血病细胞的诊断，或成为筛选抗白血病药物的新靶点。
二.国内外相关研究众所周知，基因的选择表达决定了细胞的分化、发育、增殖和死亡等最基本的生命现象，研究胚胎阶段基因选择性表达即基因特定时相的开或关是了解不同发育阶段生理功能调控的关键。在脊椎动物胚胎发育过程中，肝脏有非常特殊的历程。早期的胚胎肝脏具有非常旺盛的增殖和分化能力，同时又是人体重要的造血器官，大约在出生前人体才由肝脏转为骨髓造血。因此，此阶段的肝组织既表达丰富的造血调控基因，也表达肝脏生长发育的调控基因。以往的研究表明从四月龄人胎肝组织中可发现和分离许多重要基因如肝再生增强因子(1)，丝/苏氨酸激酶(2)和其它未知基因(3)等。基于上述理由，比较胚胎肝和成人肝基因表达差异有望发现重要调控基因。
三.本发明总结本发明通过代表性差异显示分析技术(Represention DifferentialAnalysis，RDA)，比较了四月龄人胎肝组织及正常成人肝组织基因表达的差异，首次成功地分离出人胎肝特异表达基因，命名为Hemagene-1，全长cDNA，Hemagene-1基因全长2166bp，包括110bp 5’-非翻译区序列，602bp 3’-非翻译区序列。该基因编码484氨基酸组成的蛋白质，分子量为55.3kd。该基因具有转化活性，高丰度表达在白血病细胞，可能应用于诊断和治疗白血病。
本发明发现了一种新基因，利用分子生物学技术首次提供了Hemagene-1的全长c DNA序列及其生物学功能。
本发明提供了Hemagene-1编码的蛋白质氨基酸序列。
本发明提供了一种重组生产人Hemagene-1的方法，提供了一种含有Hemagene-基因的原核表达载体，利用它可以大量得到Hemagene-1蛋白。
本发明提供了一种含有Hemagene-1基因的真核表达载体及获得稳定表达Hemagene-1的细胞株，利用它可以得到Hemagene-1多肽。
四.主要图表说明为了更好地理解本研究内容，下面对主要附图加以说明

图1显示Hemagene-1的基因组结构图2显示构建的体外翻译载体；图3显示体外翻译结果图4显示PCR检测Hemagene-1mRNA在不同组织中的表达表5显示PCR检测Hemagene-1在白血病患者外周血细胞的表达图6显示Northern杂交检测Hemagene-1mRNA在不同肿瘤细胞株中的表达图7显示GFP-Hema融合表达载体的构建图8显示GFP-Hema融合蛋白在COS-7细胞中的表达图9显示Hemagene-1真核表达载体的构建图10显示Hemagene-1反义真核表达载体的构建图11显示Hemagene-1缺失体真核表达载体的构建图12显示检测Hemagene-1表达载体转染NIH3T3细胞后，Hemagene-1mRNA在不同细胞株中的表达图13显示经G418筛选获得稳定表达细胞株的表型变化；图14显示稳定表达Hemagene-1细胞株侵袭性增加图15显示融合表达载体的构建图16显示Hemagene-1在大肠杆菌中的融合表达结果五.详细描述1.RNA提取用Trizol(Life Technologies，Inc.)分别提取四月龄人胎肝组织和正常成人肝组织总RNA如下，50-100mg肝组织加1mlTrizol，匀浆后在25-30放置5min，加入0.2ml氯仿/1mlTrizol，剧烈震荡15min，取上层水相移入一新的EP管，加入0.5ml/1mlTrizol异丙醇，15-30沉淀10min，然后2-8，1200g离心10min，加入1ml 75％乙醇/Trizol洗涤一次，2-8，7500g离心5min，半干燥RNA，加入50ul无RNA酶去离子水，紫外分光光度计下计OD260/OD280接近2.0。2.差异片段的分离利用RDA(4)(Clontech Laboratories，Inc.)富集胎肝特异基因片段。具体过程如，用cDNA合成引物5’-TTTTGTACAAGTTNN-3’将胎肝和正常成人肝组织mRNA逆转录成cDNA，用Rsal限制性内切酶37消化1.5小时，经过两轮杂交，杂交条件为98变性1.5min.68杂交8小时或过夜。然后取杂交产物1ul进行巢式PCR扩增，扩增体系为25ml，反应条件为94℃ 5min，94℃ 10sec，68℃30sec，72 1.5min，共27个循环。2.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，将已经富集了胎肝特异基因片段转化感受态大肠杆菌DH5，涂板后随机挑取53株克隆，用T7，SP6引物测序(DNA测序仪)，然后进行序列分析，GeneBank Blast及EST库检索发现其中有一个约300bp的克隆片段即本研究Hemagene-1基因的部分序列(图1)，其核苷酸序列与任何已知序列无同源性，随后对其进行了全长cDNA的克隆。1 GGATAGTGGT GGGAACAGAC AAATAAGGAA GCGGGGAGGA CTGGATAATT51 GGTTTTCCCC CCTAAGAACA TTTATTTACG TCTTAAGAGC AGATAAGTGA101 CTAAGACTGA ACACATACAT TTTGTGGAGT ATATAGTTTT CTTGTAAATG151 CTGTTCAATT ATTAATGTAA CAGTAGCATC AAAATTTTAT TCAGGCTTTA201 GTTGACTCTT TTGGTCAGTT TTAACAATTC TCCTTAAAAG ATATTTTGGA251 GTGATGAATG TAGTTTACTT图1 Hemagene-1基因的部分序列3.全长cDNA的分离A.筛选cDNA文库以RDA获得的Hemagene-1cDNA(300bp)片段为探针，32P随机引物法(Promega)标记，菌落原位杂交筛选人四月胚胎肝cDNA文库(5)，获得的阳性克隆以T7、SP6进行序列测定得到一个约1.6kb的核苷酸序列(图2)。1 GAACACTTTT CTGAAATATG TCAAGAAAGT AACATATATC AGGAGAATTT51 TTCTGAGTAC CAAGAAATAG CAGTACAAAA CCATTCTTCT GAAACATGCC101 AACATGTGTC TGAACCTGAA GACCTCTCTC CTAAAATGTA CCAAGAAATA151 TCTGTACTTC AAGACAATTC TTCCAAAATA TGCCAAGACA TGAAGGAACC201 TGAAGACAAC TCTCCTAACA CATGCCAAGT AATATCTGTA ATTCAAGACC251 ATCCTTTCAA AATGTACCAA GATATGGCTA 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4sec共20个循环。巢式PCR反应体积为25ul，反应条件为94℃10sec，68℃30sec，72℃30sec，共25循环。PCR产物经1％琼脂糖中电泳分离，亚克隆pGEM-T载体，T7、SP6进行序列测定得到一个约0.6kb的核苷酸序列(图3)，电子拼接获得Hemagene-1全长cDNA(图4)。1 GGTTATGAAG ATAGGTACTG TGGGTGTTAG AAAGATTCAC GGCAAAACAG51 GGAAGCATCT AGGCTGCTTG TGGAAGTCAG ACCAAAATAG CAGGAAGGTA101 TTGCAGCAAG ATGGATTTGG GAAAGGACCA ATCTCATTTG AAGCACCATC151 AGACACCTGA CCCTCATCAA GAAGAGAACC ATTCTCCAGA AGTCATTGGA201 ACCTGGAGTT TGAGAAACAG AGAACTACTT AGAAAAAGAA AAGCTGAAGT251 GCATGAAAAG GAAACATCAC AATGGCTATT TGGAGAACAG AAAAAACGCA301 AGCAGCAGAG AACAGGAAAA GGAAATCGAA GAGGCAGAAA GAAACAACAA351 AACACAGAAT TGAAGGTGGA GCCTCAGCCA CAGATAGAAA AGGAAATAGT401 GGAGAAAGCA CTGGCACCTA TAGAGAAAAA AACTGAGCCA CCTGGGAGCA451 TAACCAAAGT ATTTCCTTCA GTAGCCTCCC CGCAAAAAGT TGTGCCTGAG501 GAACACTTTT CTGAAATATG TCAAGAAAGT AACATATATC AGGAGAATTT551 TTCTGAGTAC CAAGAAATAG CAGTACAAAA图3显示5’-RACE获DNA序列1 GGTTATGAAG ATAGGTACTG TGGGTGTTAG AAAGATTCAC GGCAAAACAG51 GGAAGCATCT AGGCTGCTTG TGGAAGTCAG ACCAAAATAG CAGGAAGGTA101 TTGCAGCAAG ATGGATTTGG GAAAGGACCA 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extract from sequence NEW_FILE.001All frames 2166 base pairs Posltion1 to 2166. . . . . .1 GGT TAT GAA GAT AGG TAC TGT GGG TGT TAG AAA GAT TCA CGG CAA AAC AGG GAA GCA GCA TCT 6061 AGG CTG CTT GTG GAA GTC AGA CCA AAA TAG CAG GAA GGT ATT GCA GCA AGA TGG ATT TGG120M D L G121 GAA AGG ACC AAT CTC ATT TGA AGC ACC ATC AGA CAC CTG ACC CTC ATC AAG AAG AGA ACC180K D Q S H L K H H Q T P D P H Q E E N H181 ATT CTC CAG AAG TCA TTG GAA CCT GGA GTT TGA GAA ACA GAG AAC TAC TTA GAA AAA GAA240S P E V I G T W S L R N R E L L R E P K241 AAG CTG AAG TGC ATG AAA AGG AAA CAT CAC AAT GGC TAT TTG GAG AAC AGA AAA AAC GCA300A E V H E K E T S Q W L F C E Q E K N K301 AGC AGC AGA GAA CAG GAA AAG GAA ATC GAA GAG GCA GAA AGA AAC AAC AAA ACA CAG AAT360Q Q R T G K G N R R G R K K Q Q H T B I361 TGA AGG TGG AGC CTC AGC CAC AGA TAG AAA AGG AAA TAG TGG AGA AAG CAC TGG CAC CTA420K V E P Q P Q I E K E I V E K A L A P Z421 TAG AGA AAA AAA CTG AGC CAC CTG GGA GCA TAA CCA AAG TAT TTC CTT CAG TAG CCT CCC480E K K T E P P G S I 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表1白血病患者外周血Hemagene-1表达编号 诊断 Hemagene-1表达1 急淋 ++2 急淋 +3 非急淋-4 急淋 +++5 非急淋-6 急淋 ++7 急淋 ++8 非急淋-9 急淋 +++10 正常人-11 正常人-12 正常人-6.Northern杂交检测Hemagene-1在不同肿瘤细胞株中的表达K562，HL60和MO7e(人白血病细胞株)细胞悬浮培养于含10％新生牛血清(GiBco)的RPMI1640培养液，MO7e另加G-CSF(5ng/ml)；KBV细胞(人喉癌细胞株)，HTC细胞(鼠肝癌细胞株)，HepG2细胞(人肝癌细胞株)，HLE细胞(人肝癌细胞株)，Hep2细胞(人喉癌细胞株)，NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞株)，7402细胞(人肝癌细胞株)均贴壁培养于含10％新生牛血清的DMEM培养基。培养液均含各100mg/L的氨苄青霉素和链霉素，37℃，5％CO2完全饱和湿度下培养。
用Trizol TM试剂盒提取各种细胞总RNA。1mlTrizol裂解1×107细胞，然后加入氯仿200ml抽提一次，1200g4离心15min，取上清，用0.5ml无水乙醇沉淀，75％乙醇洗2次，干燥后用DEPC处理的无菌去离子水溶解RNA。紫外分光光度仪测定其浓度。
取总RNA20μg进行1％甲醛变性凝胶电泳，转印硝酸纤维素膜，膜在80℃烘干2h，加入6×SSC，5×Denhardt’s，0.5％SDS，100μg/ml鲑精DNA，在68℃预杂交1h，加入变性探针，68℃杂交过夜；以含0.5％SDS的2×SSC室温下洗膜2次，再用含0.5％SDS的0.5％×SSC 50℃洗膜2次，室温干燥后-70℃下放射自显影。结果发现Hemagene-1仅在K562和MO7e细胞中高表达，而在其余多种细胞株中不表达(附图5)。7.Hemagene-1的细胞定位 以构建的pGEM-Hemagene-1质粒模扳，利用PCR扩增Hemagene-1编码区cDNA，PCR引物为P15’CGG AAT TCA TGG ATT TGGGAA AGG AC-3’；P25’-GGG GTA CCT AAA ACA AAA CAT AAC TAT AG-3；PCR条件为94℃ 30sec，50℃ 60sec，72℃ 90sec，共25循环。PCR产物经EcoRI，Kpen I酶切后亚克隆到pGFP-C1质粒(附图6)，质粒经序列分析确认无误后，以脂质体法转染cos-7细胞，细胞在含10％FCS DMEM，5％CO237℃条件下培养24-48小时，荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况。同时，转染转录因子ETS GFP表达载体及荷空pGFP-C1载体作为对照。发现发绿色荧光的表达产物主要集中在细胞核，与已知表达在细胞核的转录因子ETS-1一致(7)，而GFP转染细胞荧光为弥漫性(附图7)，提示Hemagene-1基因表达产物定位于细胞核内。8.表达质粒的构建 利用PCR扩增Hemagene-1编码区cDNA，条件同上，将其亚克隆于pcDNA3.1(+)CMV启动子下游，构建成真核表达载体(附图8)，同时将cDNA反向插入pcDNA3.1(+)CMV启动子下游，构建成反向真核表达载体(附图9)；此外，利用PCR构建成N端缺失175个氨基酸的缺失体表达载体(Hemagene-)(附图10)。上述质粒均经序列分析确认后用于实验。H-ras-V12-pBabe表达载体由Huibin Sun博士惠赠(7)。9.细胞培养及稳定表达细胞株建立 将构建的不同载体(各20μg)以脂质体法分别转染NIH3T3细胞，细胞在含10％FCS的DMEM，5％CO237℃条件下培养24小时，以G418(400μg/ml)筛选2周后挑取单克隆，继续在含G418(200μg/ml)条件下培养。10.稳定表达细胞株的鉴定 提取转染不同质粒细胞的RNA，以RT-PCR检测Hemagene-1mRNA表达情况。以Oligo(dT)为起始引物，加入总RNA 1ug，72℃10mins后，依次加入无RNase水，10×RT buffer，25mM MgCl2，250uM dNTPs，RNasin和AMV逆转录酶，反应体系为20ul，42℃保温15mins后，加去离子水至100ul。并以此为模板进行PCR。PCR引物为P1 5’-ATG TAC CAA GAA ATA TCTGTA-3；P25’-TAA AAC AAA ACA TAA CTA TAG-3’。PCR反应体积为25ul，循环条件为94℃ 1min，50℃ 1min，72℃ 1min，共30循环，PCR产物经1.5％琼脂糖电泳，凝胶成像仪扫描成像。特异扩增带分子量为1.0kb.将成功构建的Hemagene-1正向、反向及N-端缺失175个氨基酸缺失体的真核表达载体质粒转染NIH3T3细胞，G418筛选4周后，PCR法检测不同细胞株Hemagene-1 mRNA的表达，发现NIH3T3细胞本身不表达Hemagene-1，但在转染特定质粒后细胞表达Hemagene-1 mRNA(附图11)。细胞形态观察发现转染正向表达载体的细胞株(两株)发生明显的形态改变(附图12)，细胞表面变得平滑而折光性增加，并失去了正常成纤维细胞平行生长的走向及接触抑制现象，细胞之间相互交叉并形成多层，而转染反向、缺失体及荷空载体的细胞株形态无明显的变化，提示Hemagene-1可能具有使细胞转化的活性。
11.软琼脂集落形成实验将G418筛选后分别转染不同质粒的NIH3细胞用胰酶消化，通过25G 5/8的无菌注射针头分散成单个细胞，以每35mm直径培养皿种植1×103个细胞的密度将细胞均匀分布于1ml作为顶层的含20％FCS、0.3％超纯琼脂的DMEM培养液中，随后均匀铺在已铺好1ml作为底层的含0.6％超纯琼脂、20％FCS的DMEM上，两层琼脂中均含G418(400ug/ml)，每组各三皿。每4-5天添加一次新的顶层琼脂，两周后在显微镜下统计集落超过50个细胞的克隆数。将所建不同细胞株接种软琼脂，培养14天后计数超过50个细胞集落数，结果见表2，两株正向克隆细胞株，软琼脂形成独立克隆效率分别为32.5％和33.6％，而转染反向、缺失体、荷空载体的细胞株则无锚定独立生长的能力，不能形成独立的克隆。
表2不同细胞软琼脂培养克隆形成数细胞 克隆形成(％)pcDNA3.1 0Hemagene-132.5Hemagene-233.6Hemagene-as 0Hemagene- 0H-RasV12-pBabe50.212.鼠成瘤实验分别将转染有不同质粒的NIH3T3细胞(1×106)注射到4周雌性裸鼠的背部皮下，每组三只，每周观察两次，至接种后20周。成瘤鼠照相后处死，取瘤作病理组织学检查。四周后六只注射高表达Hemagene-1 NIH3T3细胞株的裸鼠均形成肿瘤(附图13)，并迅速长大。病理组织学检查显示该瘤具有纤维细胞瘤样特性，提示该肿瘤源于转染的NIH3T3细胞。其它各组观察20周未见肿瘤生长(表3)。
表3裸鼠肿瘤形成细胞 肿瘤形成pcDNA 0/3Hemagene-1 3/3Hemagene-2 3/3Hemagene-as 0/3Hemagene- 0/313.侵袭实验(8)分别将转染不同质粒的NIH3T3细胞以1.0×105/ml的密度接种在含0.1％BSA DMEM的0.gum孔径包被基质胶的培养杯(购自BectonDickinsono)中，下层为无血清DMEM，5％CO2、37℃条件培养12小时后，刮去内层细胞，外层用含1％结晶紫的甲醇染色，倒置培养杯，光镜下观察穿越底膜的细胞并计数。将建立的不同NIH3T3细胞株接种0.8um孔径包被基质胶的培养杯，培养12小时后观察细胞透膜能力以评价细胞的侵袭性，结果显示稳定表达Hemagene-1细胞株较荷空载体的细胞株侵袭性增强约10倍左右，而转染反向、缺失体及荷空载体的细胞株之间侵袭性无显著性差异(附图14)。14.Hemagene-1在大肠杆菌中的表达利用PCR扩增Hemagene-1编码区DNA，将其亚克隆到PGEX-4T-2质粒的KpnI和EcoRI位点(附图15)，转化EcoliDH5α，利用酶切，PCR鉴定重组质粒，其序列用核苷酸序列分析确定。将含重组质粒的细菌在含100Ug/ml氨苄青霉素的LB培养液过液培养，次日按1∶10稀释用新鲜含100Ug/ml氨苄青霉素的LB培养液培养至OD600＝0.8，加IPTG至终浓度为1.0mM，继续培养4小时后，收集细菌，用SDS-PAGE电泳检测表达蛋白，结果表明表达蛋白约占细菌总蛋白的42％(图16)。
总之，本发明克隆了一种新的基因序列，并确认其具有转化活性。通过构建原核表达载体并转化合适的原核宿主细胞获得表达蛋白质；通过构建真核表达载体并转染合适的宿主细胞，经筛选后获得了稳定表达Hemagene-1的细胞株。稳定表达Hemagene-1的NIH3T3细胞发生恶性转变，表明该基因具有转化活性；该基因在白血病细胞高表达，可能应用于白血病细胞的诊断，或成为筛选抗白血病药物的新靶点。
参考文献1.杨晓明，谢玲，邱兆华，胡志远，吴祖泽，贺福初。新型肝再生增强因子的分子克隆及其性能研究。中国科学(C辑)1997；27463-4682.Jun-ichi Nezu，Asuka Oku，Michael H.Jones，and Miyuki Shimane.ldentification of two novel human putative serine/threonine kinases，VRK1AND VRK2，with structural similarity to vaccinia virus B1R kinase Genomics1997；45327-3313.Wei Qisheng，Wu Chutse，Cao Jurong.Translation of poly(A)mRNAencoding CFU-S proliferation stimulator of human fetal liver origin in Xenopuslaevis oocytes.Exp Hematol，1989；171044-10504.Hubank M，Schatz DG.cDNA representational difference analysisasensitive and flexible method for identification of differentially expressed genes.Methods Enzymol 1999；303325-495.金冬雁，黎孟枫，等译。分子克隆实验指南。科学出版社p60-666.Chenchik A，Moqadam F，Siebert P.A new method for full-length cDNAcloning by PCR.ln a laboratory guide to RNAlsolation，analysis，andSynthesis.Ed.Krieg PA.Pp.273-321.5.Sun HB，Zhu YX，Yin T，Sledge G，Yang YC.MRG1，the product of amelanocyte-specific gene related gene，is a cytokine-inducible transcriptionfactor with transformation activty.Proc Natl Acad Sci USA 1998 Nov 10；95(23)13555-606.Nobuyuki O，Mayumi A，Yasufumi S.ETS-1 converts endothelial cells to theangiogenic phenotype by inducing the expression of matrix metalloproteinasesand integrin β3.J Cell physiol.1999，178121-13权利要求
1.一种具有转化活性基因—人造血细胞分化相关基因-1(Hemagene-1)，具有以下核苷酸序列1 GGTTATGAAG ATAGGTACTG TGGGTGTTAG AAAGATTCAC GGCAAAACAG51 GGAAGCATCT AGGCTGCTTG TGGAAGTCAG ACCAAAATAG CAGGAAGGTA101 TTGCAGCAAG ATGGATTTGG GAAAGGACCA ATCTCATTTG AAGCACCATC151 AGACACCTGA CCCTCATCAA GAAGAGAACC ATTCTCCAGA AGTCATTGGA201 ACCTGGAGTT TGAGAAACAG AGAACTACTT AGAAAAAGAA AAGCTGAAGT251 GCATGAAAAG GAAACATCAC AATGGCTATT TGGAGAACAG AAAAAACGCA301 AGCAGCAGAG AACAGGAAAA GGAAATCGAA GAGGCAGAAA GAAACAACAA351 AACACAGAAT TGAAGGTGGA GCCTCAGCCA CAGATAGAAA AGGAAATAGT401 GGAGAAAGCA CTGGCACCTA TAGAGAAAAA AACTGAGCCA CCTGGGAGCA451 TAACCAAAGT ATTTCCTTCA GTAGCCTCCC CGCAAAAAGT TGTGCCTGAG501 GAACACTTTT CTGAAATATG TCAAGAAAGT AACATATATC AGGAGAATTT551 TTCTGAGTAC CAAGAAATAG CAGTACAAAA CCATTCTTCT GAAACATGCC601 AACATGTGTC TGAACCTGAA GACCTCTCTC CTAAAATGTA CCAAGAAATA651 TCTGTACTTC AAGACAATTC TTCCAAAATA TGCCAAGACA TGAAGGAACC701 TGAAGACAAC TCTCCTAACA CATGCCAAGT AATATCTGTA ATTCAAGACC751 ATCCTTTCAA AATGTACCAA GATATGGCTA AACGAGAAGA TCTGGCTCCT801 AAAATGTGCC AAGAAGCTGC TGTACCCAAA ATCCTTCCTT GTCCAACATC851 TGAAGACACA GCTGATCTGG CAGGATGCTC TCTTCAAGCA TATCCAAAAC901 CAGATGTGCC TAAAGGCTAT ATTCTTGACA CAGACCAAAA TCCAGCAGAA951 CCAGAGGAAT ACAATGAAAC AGATCAAGGA ATAGCTGAGA CAGAAGGCCT1001 TTTTCCTAAA ATACAAGAAA TAGCTGAGCC TAAAGACCTT TCTACAAAAA1051 CACACCAAGA ATCAGCTGAA CCTAAATACC TTCCTCATAA AACATGTAAC1101 GAAATTATTG TGCCTAAAGC CCCCTCTCAT AAAACAATCC AAGAAACACC1151 TCATTCTGAA GACTATTCAA TTGAAATAAA CCAAGAAACT CCTGGGTCTG1201 AAAAATATTC ACCTGAAACG TATCAAGAAA TACCTGGGCT TGAAGAATAT1251 TCACCTGAAA TATACCAAGA AACATCCCAG CTTGAAGAAT ATTCACCTGA1301 AATATACCAA GAAACACCGG GGCCTGAAGA CCTCTCTACT GAGACATATA1351 AAAATAAGGA TGTGCCTAAA GAATGCTTTC CAGAACCACA CCAAGAAACA1401 GGTGGGCCCC AAGGCCAGGA TCCTAAAGCA CACCAGGAAG ATGCTAAAGA1451 TGCTTATACT TTTCCTCAAG AAATGAAAGA AAAACCCAAA GAAGAGCCAG1501 GAATACCAGC AATTCTGAAT GAGAGTCATC CAGAAAATGA TGTCTATAGT1551 TATGTTTTGT TTTAACAATT CTCAACCATA AAGTTGTGGT CCAATGGAAC1601 ATACAGCTTA ATAGTTTATG CGTGATTTTC TCAAAATATT GTAAAACTTT1651 TGACAATGCT CATTAATATT ATTTTTTCTA TTTGTAGACC ATATCTGAAA1701 GAAATAACAT TTTTTAAGGC TCTACCACAT AGACAATATC ATGCTAGAAT1751 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTAT GTATGTATAG GTCGGGGAGA1801 GGATAGTGGT GGGAACAGAC AAATAAGGAA GCGGGGAGGA CTGGATAATT1851 GGTTTTCCCC CCTAAGAACA TTTATTTACG TCTTAAGAGC AGATAAGTGA1901 CTAAGACTGA ACACATACAT TTTGTGGAGT ATATAGTTTT CTTGTAAATG1951 CTGTTCAATT ATTAATGTAA CAGTAGCATC AAAATTTTAT TCAGGCTTTA2001 GTTGACTCTT TTGGTCAGTT TTAACAATTC TCCTTAAAAG ATATTTTGGA2051 GTGATGAATG TAGTTTACTT TTGTATTTGA ATTTTGATTT TCTATTTTTA2101 TTTTTTAAAT ATTGTATTTG TGCACAATGT ACATTAAATC ATTATTACAT2151 GAAAAAAAAA AAAAAA
2.根据权利要求1所述核苷酸序列，它包括所列DNA序列的互补链，以及类似的人工合成序列；
3.权利要求1所述DNA序列，它编码人造血细胞分化相关蛋白-1(Hemagene-1)，具有以下氨基酸序列1 MDLGKDQSHL KHHQTPDPHQ EENHSPEVIG TWSLRNRELL RKRKAEVHEK51 ETSQWLFGEQ KKRKQQRTGK GNRRGRKKQQ NTELKVEPQP QIEKEIVEKA101 LAPIEKKTEP PGSITKVFPS VASPQKVVPE EHFSEICQES NIYQENFSEY151 QEIAVQNHSS ETCQHVSEPE DLSPKMYQEI SVLQDNSSKI CQDMKEPEDN201 SPNTCQVISV IQDHPFKMYQ DMAKREDLAP KMCQEAAVPK ILPCPTSEDT251 ADLAGCSLQA YPKPDVPKGY ILDTDQNPAE PEEYNETDQG IAETEGLFPK301 IQEIAEPKDL STKTHQESAE PKYLPHKTCN EIIVPKAPSH KTIQETPHSE351 DYSIEINQET PGSEKYSPET YQEIPGLEEY SPEIYQETSQ LEEYSPEIYQ401 ETPGPEDLST ETYKNKDVPK ECFPEPHQET GGPQGQDPKA HQEDAKDAYT451 FPQEMKEKPK EEPGIPAILN ESHPENDVYS YVLF*
4.一种重组生产权利要求3所述蛋白的方法，其特征是将权利要求1-2所述DNA序列置于合适载体，转化原核或真核宿主细胞，得到Hemagene-1多肽；
全文摘要
通过比较四月龄人胎肝组织及成年人肝组织基因表达差异,成功分离一种新基因,命名为造血细胞分化相关基因－1(Hemagene－1)。该基因mRNA全长2166bp核苷酸,包括110bp5’－非翻译序列,602bp3’－非翻译序列,Hemagene－1基因编码484氨基酸组成,分子量为55.3kd的蛋白质。该基因具有转化活性,高丰度表达在白血病细胞,与造血细胞分化密切相关。该基因可能用于诊断和治疗白血病。
文档编号C12N15/11GK1388130SQ0111826
公开日2003年1月1日 申请日期2001年5月25日 优先权日2001年5月25日
发明者杨晓明, 闾军, 许望翔, 江岩, 李长燕 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所