专利名称：利用味精发酵废液中的菌体来生产核糖核酸的生产方法
技术领域：
本发明涉及生物化工领域中的核糖核酸(RNA)的制备，尤其涉及利用味精发酵废液中的菌体来生产核糖核酸的生产方法。
味精菌体本来是作为一种菌体蛋白饲料添加剂或用作生产饲料酵母的原料而加以利用(章练红，《我国饲料酵母开发利用的趋势与发展前景》，饲料与畜牧2000，第5期12-14)。本发明利用生产味精的发酵废液，经汽浮法(谷氨酸菌体复合调味汁生产条件的研究，《山东食品发酵》1993(3)，P11-19)分离出的菌体为原料来生产核糖核酸。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案生产味精的发酵废液用絮凝汽浮法分离出菌体，收集，同时用水冲洗，沥干后，称重投料。将菌体悬浮于水中，用离子膜碱调PH至6-7，在搅拌下加入固体氯化铵，加热至沸，使温度保持在90-95℃，搅拌2-3小时，趁热进行板框压滤，滤液加0.5-1.0％活性炭处理(搅拌0.5小时)，再进行板框过滤，滤液冷却至10-20℃，用6mol/l盐酸调PH至2-2.5，得核糖核酸(RNA)沉淀。
本发明还对产品进行了光谱测定，以及含量、水分、浊度和重金属含量等的测定。
本发明的效果1、利用本发明的生产方法，一吨湿的菌体，可得8-10公斤RNA，湿菌体含水量在70％左右，味精菌体的核糖核酸的含量在7.5％左右，折成干的菌体，得率为2.7-3.3％，也就是说菌体中的RNA已有近一半被回收。
2、对制得的产品进行分析结果，RNA的含量在90％左右，水分在8％以下，260nm及280nm光吸收的比值在1.9-2.0，完全符合企业质量要求，且经有关专业机构检测，产品的重金属含量及微生物含量远低于国家对食品的质量标准。
3、对不断改进工艺所得的产品连同从酵母得来的RNA进行电泳分析比较，结果无甚差异。用酶解和离子交换柱层析的方法对产品及酵母RNA作了四种核苷酸组分的分析，发现从味精菌体得来的RNA，鸟苷酸的含量相对较高，达到35％左右。
4、本发明菌体分离出核酸后的残渣，仍可作蛋白饲料添加剂，传统用食盐提取核酸后的菌体蛋白质灰份增高，超过了饲料标准，影响了菌体的再利用。我们改用氯化铵代替食盐，解决了这一问题，这也是本发明的特点之一(传统的方法是用大量水洗涤该残渣)。
5、生产工艺中所用的辅助原料为常用的酸、碱、盐，因此不会造成对环境的二次污染。
6、用定磷法测定核酸含量的过程中，还设计改良了凯氏烧瓶，首创用微波消化法代替传统的用煤气或电炉的消化法，使消化时间由原来的2-4小时缩短到10分钟左右。
7、核酸作为营养保健品，生产核苷和核苷酸的原料，其水解物用于特鲜味精的添加剂，农作物增产的生长促进剂，医药工业的药物中间体，有着广阔的市场前景，因此其产业化的经济效益是明显的。
图2各RNA产品的电泳比较图。其中1-发明人用NaCl提取味精菌体中的RNA2-本发明用NH4Cl提取味精菌体中的RNA3-发明人用NH4Cl+C提取味精菌体中的RNA4-福建莆田糖厂生产的RNA5-哈尔滨啤酒厂生产的啤酒酵母RNA
2.篮框式离心机。
3.热风干燥箱。
4.岛津160-1型分光光度计。
5.板框压滤机。
二.方法1.提取核糖核酸用的是浓盐法；2.评价核糖核酸质量的是紫外吸收及含磷量测定的方法。
实施例1 核糖核酸的生产生产味精的发酵废液用絮凝汽浮法分离出菌体，收集，同时用水冲洗，沥干后，称重投料。在3吨的反应罐内加水1.2吨，搅拌下投入菌体0.8吨(菌体含水量约70％)；在搅拌下缓缓加入离子膜碱(含NaOH为30％)24-28公斤，使菌体悬浮液的PH达6-7；加入氯化铵100公斤，仍不断搅拌，并开启蒸汽阀加热至沸腾；调节蒸汽阀，使菌体悬浮液温度维持在90-95℃，保持2-3小时；趁热进行板框压滤，除菌体残渣(这是一种优质蛋白质饲料)，滤液泵入另一反应罐内，搅拌下加入活性炭10-20公斤，搅拌0.5小时，并用冷水冷却滤液；进行第二次板框压滤，去活性炭，滤液呈浅黄清澈透明，泵入沉淀槽内；这时滤液的温度在20-30℃，加入6mol/l盐酸调PH至2.0-2.5，有大量白色沉淀生成，静置12小时；沉淀沉于槽底，上清液从沉淀上面的放水口放出，进入污水处理池；刮出沉淀，用离心机脱水；沉淀浸渍于95％乙醇中，进一步脱水，当乙醇浓度降至60％左右，再用离心机分出沉淀，并摊晾在木盘内挥去残留的乙醇；然后在60-70℃烘箱中烘干；粉碎机粉碎，得6.5-8.0公斤浅黄色产品，以干菌体计算，收率为2.7-3.3％。
实施例2 光谱测定配制10mg/ml的产品RNA溶液，取25μl用水稀释至3.0ml，对重蒸水进行紫外光谱扫描，其吸收峰在258-260mm，将260mm和280mm的光吸收值作A260mm/A280mm比值测定，其数值为1.9-2.0。
实施例3 紫外吸收法(UV法)测定含量精确称量样品500mg，放入50ml容量瓶，加少量重蒸水和2mol/lNaOH500μl，充分混匀，使样品完全溶解，然后再加重蒸水定容至50ml，备用；取两支10ml离心管，分别加2ml上述溶液，并编号为甲、乙，在甲管加2.0ml重蒸水，乙管加2ml RNA沉淀剂(称取1g钼酸钠-溶于水中14ml70％过氯酸中，加386ml重蒸水稀释为400ml沉淀剂溶液)混匀，冰浴放置30分钟，将乙管离心10分钟(4000ppm)，取上清液备用；分别吸取甲乙两管清液50μl，用重蒸水稀释至3.0ml，对重蒸水测定甲、乙两管溶液在260mm的光吸收值；计算RNA的含量 实施例4 钼蓝定磷法测定含量基本上参照张龙翔等编著的《生物化学实验方法和技术》(人民教育出版社，1981年)，但对总磷测定的消化作了改进，用微波消化法代替煤气或电炉消化法，使消化时间由原来的2-4小时缩短到10分钟左右。其操作取改良的微量凯氏烧瓶4只，编号，在#1瓶中加0.5ml水作空白校正，其余#2、#3、#4瓶中分别加入大约10mg/ml的样品液0.2ml、0.3ml和0.4ml，然后分别用水补足至0.5ml，再在各管分别加入1.5ml 5mol/l的H2SO4溶液，装上盛有碱石灰的磨口干燥管，将这四套凯氏烧瓶放入1000ml的烧杯内干燥管悬在烧杯外，用微波炉在高温档加热30秒，停1分钟后再加热30秒，如此重复3-4次，将烧杯自微波炉中取出，瓶内溶液呈棕色或深棕色，稍冷，在每瓶中加30％H2O2100μl，再在微波炉中高温加热30秒，此时瓶内溶液成无色透明，稍冷后，每瓶各加H2O 2.0ml，再于微波炉中高温加热30秒，至此样品消化完成。以后的操作按原文献进行。
实施例5 水分测定按中国药典2000年版附录53烘干法取样品约4g，平铺于干燥恒重的扁形称量瓶中，精确称出样品质量，打开瓶盖，在100-105℃烘5小时，盖好瓶盖，移至干燥器中冷却至室温，精确称量，然后再在100-105℃干燥1小时，再冷却、称重，直至两次称量差异不超过5mg为止，根据失重，计算样品中的含水量(％)。
实施例6 溶解性测定样品用0.02mol/l NaOH配成1％溶液，在660mm波长测定其透光率(T％)，100-T％即为其浊度，以表示该样品的溶解性。
通过上述实施例2-5样品的分析，我们确定产品的质量指标为光谱吸收最大吸收峰258-260mm；A260mm/A280mm比值1.9-2.0含量UV法100％±10％钼蓝定磷法90％±5％水分≤8％浊度＜10％为了对我们的产品内在质量有更多的了解，我们还请有关单位作了重金属和微生物含量的检测，其指标均达到食品级水平。见表一。
表一
另外，对我们的产品在分子水平上与酵母来源的RNA作了琼脂糖凝胶电泳和核苷酸组成的比较，在电泳行为上两者没有什么差别(参见图2)；在核苷酸组成比例方面，样品经麦芽根5′-磷酸二酯酶水解，阴离子交换树脂柱的分离分析，其结果见下表表二
权利要求
1.一种利用味精发酵废液中的菌体来生产核糖核酸的生产方法，其特征在于，包括如下步骤a.菌体分离用絮凝汽浮法从生产味精的发酵废液分离出菌体，收集，同时用水冲洗，沥干后，称重投料；b.菌体预处理将菌体悬浮于水中，用离子膜碱调PH至6-7；c.抽提在搅拌下加入固体氯化铵，加热至沸，使温度保持在90-95℃，搅拌2-3小时；d.板框压滤趁热进行板框压滤，滤液加0.5-1.0％活性炭处理，搅拌0.5小时，再进行板框过滤，滤液冷却至10-20℃，用6mol/l盐酸调PH至2-2.5，得核糖核酸(RNA)沉淀。
2.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于，进一步为，将所得的核糖核酸(RNA)沉淀静置10-15小时，去除上清夜，将沉淀离心脱水。
3.如权利要求2所述的生产方法，其特征在于，进一步为，将沉淀浸渍于95％的乙醇中，进一步脱水，当乙醇浓度降至60％，再离心，摊晾，然后在60-70烘箱中烘干，粉碎。
全文摘要
本发明公开了一种利用味精发酵废液中的菌体来生产核糖核酸的生产方法,其特征在于,包括如下步骤:用絮凝汽浮法从生产味精的发酵废液分离出菌体,收集,同时用水冲洗,沥干后,称重投料;将菌体悬浮于水中,用离子膜碱调pH至6－7;在搅拌下加入固体氯化铵,加热至沸,使温度保持在90－95℃,搅拌2－3小时;趁热进行板框压滤,滤液加0.5－1.0%活性炭处理,搅拌0.5小时,再进行板框过滤,滤液冷却至10－20℃,用6mol/l盐酸调pH至2－2.5,得核糖核酸(RNA)沉淀。
文档编号C12P19/34GK1389568SQ02112088
公开日2003年1月8日 申请日期2002年6月14日 优先权日2002年6月14日
发明者姚连生 申请人:姚连生