专利名称：利用基因工程技术提高紫杉醇含量的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生理学、药物学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种紫杉醇生物合成关键酶(紫杉二烯合成酶)基因cDNA序列，以及利用构建的高效表达载体和工程菌株在宿主细胞中表达该基因、筛选转化子的具体程序。本发明还涉及利用基因工程获得的转紫杉二烯合成酶基因的红豆杉冠瘿细胞和毛状根及其培养的子代、再生植株、植物组织或种子。
到目前为止，发现紫杉醇只存在于裸子植物红豆杉科的红豆杉属植物中。由于红豆杉数量稀少(红豆杉是国家保护的珍稀濒危植物，严禁砍伐)，生长缓慢(20-30年才能成材)，紫杉醇的含量又非常低(仅为红豆杉干重的十万分之几到万分之几，树龄为100年的红豆杉只能提供一个癌症患者所需的紫杉醇)，所以从天然的红豆杉中提取紫杉醇的方法远远不能满足人们对紫杉醇日益增长的需要(全世界紫杉醇的需求量约为1000公斤/年，而产量却不到100公斤/年)。紫杉醇的神奇疗效和药源的严重短缺使其价格极为昂贵，高达5000-6000美元/克。
近几年来对寻找及扩大紫杉醇药源途径的研究取得了极大的进展，主要途径大致包括(1)筛选高产量红豆杉(Taxus)栽培品种；(2)化学合成；(3)微生物生产；(4)生物技术。
在这些研究领域中，筛选高产量红豆杉栽培品种所需周期太长，效率很低，而且红豆杉的生殖生物学中还有许多重大问题不清楚，这些都限制了筛选高产量红豆杉栽培品种的实际应用；紫杉醇化学全合成虽然已经成功，但是合成的步骤太多，其他有毒或无用的副产品太多、紫杉醇产率太低，使得紫杉醇的全化学合成成本太高而不具有商业前景；生产紫杉醇的微生物绝大多数是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的大规模发酵培养极为困难，菌株的衰退也是一个无法克服的难题。
相比之下，利用现代生物技术，特别是基因工程技术改良有机体，生产紫杉醇就具有很大的优势(1)在生物技术研究领域中，研究人员对红豆杉离体培养长期广泛而深入的研究和红豆杉遗传转化的屡屡成功，为利用生物技术生产紫杉醇奠定了良好的理论和实践基础；(2)由于目前基本阐明了紫杉醇生物合成代谢途径及其关键酶，故利用基因工程技术在基因水平上快速、高效地改良红豆杉和其他生命体，获得遗传修饰的高含量紫杉醇的红豆杉(包括幼苗、毛状根、细胞系等)和其他生命体成为可能，因而利用基因工程技术是生产紫杉醇及其药源的最佳途径。
在本发明中，我们首次从曼地亚红豆杉中克隆紫杉二烯合成酶基因cDNA序列，并构件了植物强表达载体，导入农杆菌并遗传转化红豆杉，使紫杉二烯合成酶基因在红豆杉中表达并提高了红豆杉中紫杉醇的含量。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的应用基因工程技术提高紫杉醇含量的专利报道。
本发明的第一目的就是提供一种新的在紫杉醇生物合成中起到关键酶作用的基因，该基因为紫杉二烯合成酶基因。
本发明的第二目的是提供转移紫杉二烯合成酶基因到生命体中的方法；本发明的第三目的是提供一种获得转紫杉二烯合成酶基因的生命体的方法；本发明的第四目的是提供一种在生命体中表达紫杉二烯合成酶基因的方法，该方法有利于提高紫杉烷类化合物和紫杉醇的含量。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码紫杉二烯合成酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ IDNO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一利紫杉二烯合成酶蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，还提供了一种表达载体，它包含上述的DNA分子。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是红豆杉。还提供了一种利用基因工程技术转化生命体以提高生命体中紫杉烷类化合物和紫杉醇含量的方法，其步骤如下(1)采用任何可能的手段(如基因克隆、人工合成基因等方法)获得紫杉烷类化合物和紫杉醇生物合成途径关键酶基因，如紫杉二烯合成酶基因。
(2)将编码具有紫杉二烯合成酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成紫杉二烯合成酶活性蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列有至少75％的同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列杂交。
(3)采用任何转基因方法(包括发根农杆菌Ri质粒介导法、根癌农杆菌Ti质粒介导法等)转移紫杉二烯合成酶基因或其载体到可产生紫杉烷类化合物和紫杉醇的任何宿主细胞中；在发根农杆菌Ri质粒介导法中，将步骤(2)中的表达载体转入发根农杆菌，将含表达载体的农杆菌同宿主细胞共培养培养8-24小时(22-28℃)后，筛选和鉴定转化子，获得表达紫杉二烯合成酶蛋白基因的转化子。
(4)对转化子中的紫杉烷类化合物和紫杉醇含量进行测定，培养紫杉烷类化合物和紫杉醇含量提高的转化子，获得转基因组织。
一种由上述方法获得的细胞，它是可生产紫杉醇的细胞。
一种由上述方法获得的紫杉烷类化合物和紫杉醇含量提高的转基因生命体的后代。
在本发明中，术语“紫杉二烯合成酶”指具有与野生型紫杉二烯合成酶相同活性的SEQID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与紫杉二烯合成酶在植物中表达相同功能的SEQ IDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
本发明的紫杉二烯合成酶基因的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与紫杉二烯合成酶基因DNA杂交的DNA所编码的蛋白。
在本发明中，“紫杉二烯合成酶保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的在植物中表达的紫杉二烯合成酶基因时，可以将紫杉二烯合成酶基因编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成紫杉二烯合成酶基因表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“生命体”指可以产生紫杉烷类化合物或紫杉醇的植物(如红豆杉属的各种红豆杉、榛子等)、植物细胞、植物器官、真菌、细菌等。
在本发明中，术语“任何可能的手段”为获得紫杉二烯合成酶基因的方法，具体包括同源性克隆(如RT-PCR、RACE等)、文库筛选及人工合成紫杉二烯合成酶基因及其变异体。
在本发明中，术语“任何转基因方法”包括根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化、发根农杆菌Ri质粒介导基因转化、植物病毒载体介导基因转化、如PEG介导基因转化、脂质体介导基因转化、电击法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化、花粉管通道介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化。
在本发明中，术语“在特定的条件下筛选和鉴定转化子”是指用在离体培养的条件下用抗生素(卡那霉素、潮霉素、G418等)或其它化合物选择出含目的基因的转化子；可以使用PCR、Southern杂交、Northern杂交和Western印迹等方法来鉴定转化子。
在本发明中，术语“在适合的条件下培养紫杉烷类化合物和紫杉醇含量提高的转化子，获得转基因组织”是指对经过鉴定的转化子离体培养，并检测紫杉烷类化合物和紫杉醇含量，筛选高含量的优良转化子进行培养，获得转基因组织。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
紫杉二烯合成酶基因由本实验室使用TaKaRa公司的One Step RT-PCR试剂盒，按照使用手册的说明从曼地亚红豆杉的总RNA提取物中克隆紫杉二烯合成酶，然后连入pGEM-5zf载体测序。
2.酶切(restriction enzyme cutting)将含紫杉二烯合成酶基因的质粒载体用限制性内切酶如Bam HI及Sac I双酶切，切下紫杉二烯合成酶基因；3.连接(ligation)将切下的基因连入已经用BamHI及SacI切好的质粒pCAMBIA2300植物表达载体大片段中，用蓝白筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。
4.基因的PCR检测将基因转入表达载体后用以下引物对所含基因进行PCR检测紫杉二烯合成酶基因P15’-cgggatccatggctcagctctcatttaatg-3’ (SEQ ID NO.1)紫杉二烯合成酶基因P25’-cgagctcttacatgatatatcatacttg-3’ (SEQ ID NO.2)PCR条件为94℃ 3分钟，随之以94℃ 1分钟、54℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为2604bp。
实施例2基因的序列信息与同源性分析本发明的紫杉二烯合成酶基因的全长为2589bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于1-2589位核苷酸。根据推导出的全长紫杉二烯合成酶基因的氨基酸序列，共862个氨基酸残基，分子量为98303.97，pI为5.56，详细序列见SEQ ID NO.4。
将克隆的紫杉二烯合成酶基因全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant+GenBank +EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与来自于Taxus brevifolia和Taxus chinensis的紫杉二烯合成酶及其基因存在很高的同源性。在核苷酸水平上，紫杉二烯合成酶基因Taxus chinensis的紫杉二烯合成酶基因核苷酸序列(GenBank Accession No.U48796)的全编码序列分别有98％的相同性(见表2)，在氨基酸水平上，它与Taxus chinensis的紫杉二烯合成酶的氨基酸残基分别有97％的相似性(GenPeptAccession No.AAG02257)(见表3)。由上可见，我们从曼地亚红豆杉中克隆的紫杉二烯合成酶基因无论在核酸还是在蛋白水平上都与已有的序列存在较高的同源性，可以认为两者在有相同的功能功能，我们进一步的研究证实了这一点。
实施例3获得转基因曼地亚红豆杉含目的基因(紫杉二烯合成酶基因)表达载体的构建将含紫杉二烯合成酶基因的中间载体PGEM-5zf进一步克隆到植物双元表达载体(如pCAMBIA2300)中，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌(如EHA105、LBA4404、A4、R1000、ATCC15834等)中，利用幼嫩的茎段转化曼地亚红豆杉。利用发根农杆菌Ri质粒介导的曼地亚红豆杉的遗传转化1.发根农杆菌A4。使用前自冰箱取出，传代2次，传代用固体培养基为YEB培养基。菌种在使用前接种于YEB液体培养基中，27℃培养过夜。2.经种子萌发生长8周左右的曼地亚红豆杉的无菌嫩枝条。3.经过夜培养的菌液，用转化液(B5培养液中加入100μmol/L乙酰丁香酮，10mg/mL的甜菜碱)稀释为100个细菌/mL。取无菌红豆杉顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，60rpm/min振荡培养8h取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素和不同浓度6-BA(0.5mg/L-3mg/L)的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出毛状根后分离毛状根，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4-5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。4.把在固体培养基中的毛状根的继代培养物，接种于装有100mL无激素B5，培养基的500mL三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同，培养20天，将毛状根从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。毛状根中的紫杉醇抽提按Richard(1993)、Saito(1992)的方法。紫杉醇含量的测定采用HPLC(Catalatic，1993)和紫杉醇单克隆抗体(Hawaii Biotechnology GroupInc.)间接联酶免疫法(蒋成淦，1984)。培养物紫杉醇含量(紫杉醇/细胞冻干重)愈伤组织 0.020％毛状根0.29％利用根癌农杆菌Ti质粒介导的曼地亚红豆杉的遗传转化1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5-1.0左右；4.取经种子萌发生长8周左右的曼地亚红豆杉的无菌嫩枝条，去掉针叶，将茎切成1cm小段，分别放于含2.5mg/L2，4-D的B5培养基中，在黑暗、26℃条件下诱导形成愈伤组织。5.经过夜培养的菌液，用转化液(B5培养液中加入100μmol/mL乙酰丁香酮，10mg/mL的甜菜碱)稀释为100个细菌/mL。取无菌红豆杉顶芽、侧芽、叶、茎、根等植物不同部位，用无菌的解剖刀划以“+”字形伤口，放入上述转化液中，60rpm/min振荡培养8h后取出，用无菌水冲洗3次，放入含250-500mg/L卡那霉素的B5培养基中，每2周转移到新鲜培养基中1次，待长出冠瘿组织后分离冠瘿组织，转移至含250-500mg/L卡那霉素无激素的B5培养基中培养，转移4～5次直至无细菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的无激素B5培养基中培养。6.用PCR和Southern blotting检测转化子，用Northern blotting检测紫杉二烯合成酶基因的表达水平。7.诱导出的愈伤组织块放入到增殖培养基中(B5+Phytagel 2.0g/L+葡萄糖30g/L，pH5.8)中，于26-28度恒温下培养，每隔一个月转一次培养基。8.紫杉醇含量的测定。红豆杉冠瘿细胞和愈伤组织固体培养20天后，将培养物从培养基上取出放入冷冻干燥机中进行干燥，然后称重，贮存于-70℃备用。培养物中的紫杉醇抽提按Richard(1993)、Saito(1992)的方法。紫杉醇含量的测定采用HPLC(Catalatic，1993)和紫杉醇单克隆抗体(Hawaii Biotechnology Group Inc.)间接联酶免疫法(蒋成淦，1984)。培养物 紫杉醇含量(紫杉醇/细胞冻干重)愈伤组织 0.019％转基因冠瘿细胞 0.18％
序列表<110> 复旦大学<120> 利用基因工程技术提高紫杉醇含量的方法<130> 11<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2589<212> 核苷酸<213> 红豆杉<220><221> 编码序列<222> (1)..(2589)<223><400> 1atg gct cag ctc tca ttt aat gca gcg ctg aag atg aac gca ttg ggg 48Met Ala Gln Leu Ser Phe Asn Ala Ala Leu Lys Met Asn Ala Leu Gly1 5 10 15aac aag gca atc cac gat cca acg aat tgc aga gcc aaa tct gag cgc 96Asn Lys Ala Ile His Asp Pro Thr Asn Cys Arg Ala Lys Ser Glu Arg20 25 30caa atg atg tgg gtt tgc tcc aga tca ggg cga acc aga gta aaa atg 144Gln Met Met Trp Val Cys Ser Arg Ser Gly Arg Thr Arg Val Lys Met35 40 45tcg aga gga agt ggt ggt cct ggt cct gtc gta atg atg agc agc agc 192Ser Arg Gly Ser Gly Gly Pro Gly Pro Val Val Met Met Ser Ser Ser50 55 60act ggc act agc aag gtg gtt tcc gag act tcc agt acc att gtg gat 240Thr Gly Thr Ser Lys Val Val Ser Glu Thr Ser Ser Thr Ile Val Asp65 70 75 80gat atc cct cga ctc tcc gcc aat tat cat ggc gat ctg tgg cac cac 288Asp Ile Pro Arg Leu Ser Ala Asn Tyr His Gly Asp Leu Trp His His85 90 95aat gtt ata caa act ctg gag aca ccg ttt cgt gag agt tct act tac 336Asn Val Ile Gln Thr Leu Glu Thr Pro Phe Arg Glu Ser Ser Thr Tyr
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权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括具有编码紫杉二烯合成酶的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列有至少75％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第1-2589位的核苷酸序列。
3.一种由权利要求1所述的DNA编码的酶，其特征在于具有SEQ ID NO.4氨基酸序列、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
4.一种利用转基因技术提高生命体中紫杉烷类化合物和紫杉醇含量的方法，特征在于其步骤如下(1)采用基因克隆或人工合成基因方法获得紫杉烷类化合物和紫杉醇生物合成途径关键酶基因紫杉二烯合成酶基因；(2)把关键酶基因可操作地连于表达调控序列，形成含关键酶基因的表达载体；(3)采用任何转基因方法转移关键酶基因或其表达载体到可产生紫杉烷类化合物和紫杉醇的任何宿主细胞中；筛选和鉴定转化子，获得表达紫杉二烯合成酶蛋白基因的转化子；(4)对转化子中的紫杉烷类化合物和紫杉醇含量进行测定，培养紫杉烷类化合物和紫杉醇含量提高的转化子，获得转基因组织。
5.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
6.一种由权利要求5所述方法获得的细胞，其特征在于它是可生产紫杉醇的细胞。
7.一种由权利要求5所述方法获得紫杉烷类化合物和紫杉醇含量提高的转基因生命体的后代。
全文摘要
本发明提供了紫杉醇生物合成中限速步骤的关键酶之一的紫杉二烯合成酶基因的cDNA及其在利用基因工程技术提高紫杉醇含量方面的应用。涉及包含所说基因的cDNA的获得及利用基因工程技术提高紫杉烷类化合物如紫杉醇含量的方法。
文档编号C12N15/52GK1385530SQ0211194
公开日2002年12月18日 申请日期2002年6月4日 优先权日2002年6月4日
发明者唐克轩, 廖志华, 孙小芬, 游学军 申请人:上海复旦迪恩生物技术有限公司