B组链球菌的分子分型的制作方法

专利名称：B组链球菌的分子分型的制作方法
技术领域：
本发明涉及B组链球菌分型的分子学方法，以及该方法中使用的多核苷酸。
背景技术：
B组链球菌(Group B streptococcus，GBS)——无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)——是新生儿及产妇脓毒血症最常见病因，而且是中老年及免疫缺陷患者败血症越来越重要的病因。近年来，由于在分娩期预防性使用抗生素，所以新生儿脓毒症的发病已呈下降趋势，但是该方法带来了许多问题。将来接种可能是优选的手段，而且缀合型多糖GBS疫苗已取得明显进展。
在引入缀合疫苗前，都需要进行大量的流行病学及其他相关研究，这不仅是评估疾病负荷，也是评估GBS型(包括荚膜多糖基因血清型、血清亚型；蛋白抗原基因亚型；可移动遗传元件(mobile genetic element)亚型)的分布，以确定疫苗抗原的最佳制剂。根据一个地理学区域或少数患者进行分型通常是不可行的。需要连续监测，评定GBS疫苗抗原组合对于不同地理区域不同目标人群的适合度。
现已报道了9种荚膜多糖GBS血清型(Harrison等，1998；Hickman等，1999)。各种分型方法都已被使用，包括免疫沉淀(Wilkinson和Moody，1969)，酶免疫测定(Holm和Hakansson，1988)，共凝集(Hakansson等，1992)，反向免疫电泳，以及毛细管沉淀(Triscott和Davies，1979)，乳胶凝集(Zuerlein等，1991)，荧光显微镜(Cropp等，1974)以及抑制ELISA(Arakere等，1999)。这些方法劳动强度大而且需要高滴度的血清型特异性抗血清，这些方法花费大，难以操作，而且只有6个血清型-(Ia到V)实现了商业化(Arakere等，1999)。分子基因分型方法，例如脉冲场凝胶电泳(Rolland等，1999)，限制性内切酶分析(Nagano等，1991)都可用于流行病学研究，但是通常不能用于鉴定血清型。因此，需要一种可靠的分子学方法用来鉴定GBS血清型。

发明内容
我们已经从B组链球菌的基因组中鉴定出了具有型间序列异质性(inter-type sequence heterogeneity)的特异性区域，该区域能够被用于区分不同的型(包括荚膜多糖基因血清型、血清亚型；蛋白抗原基因亚型；可移动遗传元件亚型)。我们已经查明检测这些序列异质性的方法能够将B组链球菌准确地区别及分型。
因此，本发明的第一方面提供了一种分型B组链球菌的方法，该方法包括对所述细菌的cpsD、cpsE、cpsF、cpsG、cpsI/M基因中的一个或多个区域进行核苷酸序列分析，所述区域包括一或多个核苷酸，其序列在型与型之间各不相同。
具体而言，所述核苷酸序列可以用于对对应于下列位点的一或多个位点进行分析图1所示的第62，78-86，138，139，144，198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196位。
优选地，至少一个区域位于下述序列内即所述B组链球菌cpsE-cpsF-cspG基因簇中从cpsE基因的3’端第136位碱基与cpsG基因5′端第218位碱基之间的序列。具体而言，所述核苷酸序列可以用于对对应于下列位点的一或多个位点进行分析图1所示的第1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187以及和2196位。
在一个实施方案中，至少一个区域位于所述B组链球菌cpsI/M基因内。
我们还已查明大量表面抗原基因，包括rib，alp2或alp3基因，以及5个可移动遗传元件可以用于确定GBS的分子亚型。因此，本发明还提供了一种对B组链球菌进行分型的方法，该方法包括测定所述细菌中是否存在有一个或多个选自rib、alp2或alp3的表面抗原基因，和/或一个或多个选自IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的可移动遗传元件。优选地，例如将该方法与本发明上述方法联用。
核苷酸序列分析步骤可以包括对所述的一个或多个区域测序。可或者，或者除此之外，核苷酸序列分析步骤可以包括测定获自所述细菌的多核苷酸是否与含一个或多个所述区域的多核苷酸选择性杂交，优选地，测定是否与对应于一个或多个所述区域的一系列多核苷酸探针选择性杂交。
一个优选实施方案中，将与一系列探针杂交用作分析手段，所述系列多核苷酸探针以微阵列形式存在。
另一实施方案中，核苷酸序列分析步骤包括用一对或多对引物扩增的步骤，这些引物中的至少有一对能与在各型之间有变化的序列特异性杂交。通常，使用的引物对中，至少有一对能与在各型之间有变化的序列特异性杂交。优选地，所述引物对选自表2和/或表6和/或表10所示的引物。
第二方面，本发明提供了一基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，这些核苷酸对应于B组链球菌cpsD-cpsE-cpsF-cpsG基因中一区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型GBS型之间有变化的核苷酸。
优选地，所述的在各型GBS型之间有变化的核苷酸对应于下列位点中的一个或多个如图1所示的第62，78-86，138，139，144，198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196位。
本发明还提供了一基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，这些核苷酸对应于B组链球菌cpsE-cpsF-cspG基因簇中从cpsE基因的3’端第136位碱基到cpsG基因5′端第218位碱基限定的序列中的一区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型GBS型之间有变化的核苷酸。
优选地，上述在各型GBS型之间有变化的核苷酸对应于下列如图1所示位置中的一个或多个1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196。
本发明还提供了一基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，这些核苷酸对应于B组链球菌cpsI/M基因中的区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型GBS型之间有变化的核苷酸。
优选地，所述多核苷酸选自表2所列的核酸序列。
本发明进一步提供了一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，这些核苷酸对应于B组链球菌rib，alp2或alp3基因中的区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型GBS亚型之间有变化的核苷酸。
优选地，所述多核苷酸选自表6所列的核酸序列。
本发明进一步提供了一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，这些核苷酸对应于B组链球菌IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和/或GBSi1中的区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型GBS可移动遗传元件亚型之间有变化的核苷酸。
优选地，所述多核苷酸选自表10所列的核酸序列。
本发明的多核苷酸可用于B组链球菌的分型方法，例如血清分型和/或亚分型。
第三个方面，本发明提供了含有本发明第二个方面所述一系列多核苷酸的组合物。该组合物可用于B组链球菌的分型方法，例如血清分型和/或亚分型。
第四个方面，本发明提供了本发明提供了包含本发明第二个方面所述一系列多核苷酸的微阵列。该微阵列可用于B组链球菌的分型方法，例如血清分型和/或亚分型。
发明详述除非另有说明，本发明所有技术和科学术语都与本领域普通技术人员通常理解的含义相同(如细胞培养，分子遗传学，核酸化学，杂交技术及生物化学)。常规技术用于分子、遗传学和生物化学方法(通常参见，Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd ed.(2001)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)4thEd，John Wiley&Sons，Inc.-以及名称为Current Protocols in Molecular Biology的全部版本，在此引入作为参考)以及化学方法。
本发明的分子分型方法的基础是检测样本中是否含有特异性多核苷酸序列，这些序列存在于已经我们鉴定的型与型之间各不相同的B组链球菌(GBS)基因组区域中。
更具体地说，所检测的特异性多核苷酸序列存在于GBS的cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI，cpsM，rib，alp2和/或alp3基因以及可移动遗传元件IS861，IS1548和IS1381，ISSa4和GBSi1，优选为cpsD，cpsE，cpsF，cpsG和/或cpsI/M基因。
上述那些基因中的目的区域是那些其序列在两个或多个型之间各不相同的区域，即异质性的。异质性是由于不同型的相应区域之间的插入、缺失和/或取代。就rib，alp2和alp3而言，异质性通常是全基因存在或缺乏的形式。类似地，元件IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的异质性通常也是全序列存在或缺乏的形式。
异质性的特异性区域包括下列位置cpsD基因-62和78-86；cpsD-cpsE基因间隔区-138，139和144；cpsE基因-198，204，211，281，240，249，300，321，419，429，437，457，466，486，602，606，627，636，645，803，971，1026，1044，1173，1194，1251，1278，1413，1495，1500，1501，1512，1518和1527；cpsF基因-1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892和1971；以及cpsG基因-2026，2088，2134，2187和2196(编号对应于图1中的编号)。
具体优选的目的位点位于cpsE-cps-F-cpsG的790bp片段(该片段由大约cpsE的3’端第136位碱基至cpsG的5′端第218位碱基组成)，即图1中所示的位点1413，1495，1500，1501，1512，1518，1527，1595，1611，1620，1627，1629，1655，1832，1856，1866，1871，1892，1971，2026，2088，2134，2187和2196。
另一个异质性区域是cpsD的第62位以及GBS的某些而非全部血清型中从第78至第86位的一段重复序列(TTACGGCGA)。
异质性的特异性区域还包括图3描绘的序列比对中所示的cpsI/M基因中的众多位置。
这些异质性区域可以用多种不同方法分析，包括测序、PCR和标记探针的结合就为鉴定血清型而进行的测序而言，选择的测序引物是那些能与位于存在异质性区域内或附近的区域特异性杂交的引物。由于用于测定分子血清型的测序过程中获得的实际序列信息，所述引物无需特异性针对具体的血清型。因此该引物能特异性杂交所有GBS血清型(至少是血清型Ia至VII)，或者特定的血清型。
优选引物在图1所示的cpsE-cpsF-cpsG的790bp区域中长度为100、50或20个连续核苷酸的异质性位置处退火。合适的测序引物的实例见表2(cpsES3，cpsFA，cpsFS，cpsGA和cpsGA1)。
PCR和其他以特异性杂交为基础的分型方法通常包括使用核苷酸引物/探针，该引物/探针能特异性结合GBS血清型基因组的区域，该区域中包含在两个或多个血清型间不同的核苷酸。因此，所述引物/探针可以包含与所述区域之一互补的序列。当异质性位置靠在一起时(例如，cpsE中的第198、204、211和218位)，可以使用能与含两个或多个异质性位置的GBS基因组区域特异性杂交的引物/探针。因此，例如可以设计出与cpsE中第195至220位核苷酸互补的引物/探针。所述引物/探针具有更高的特异性并减小了错配的可能。
基于PCR的检测方法离不开引物对的使用，其中至少一个引物对能特异性结合一个或多个血清型，而非所有血清型。除非两引物均能结合，否则无法得到PCR产物。因此，特异性PCR产物的存在与否可以用于测定特定GBS血清型标记性序列的存在。但是，如上所述，只需要一个引物对应于目的基因(例如，cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI和/或cpsM基因)中的异质性区域。另一引物可以结合到所述基因的保守区域或异质性区域或者甚至GBS基因组另一部分异质性区域，例如cpsH基因，所述区域在血清型之间既可以是保守的也可以是异质性的。因此，例如，可以下述两引物的组合来区别血清型(Ia和III)一引物(cpsGS)结合cpsG基因中包含2172～2210位的区域，一引物结合cpsH基因中的异质性区域(lacpsHA1，IIIcpsHA)。
另外，可以将结合cpsI异质性区域的引物与结合cpsG保守区域的引物联用。这样的引物的实例有引物对VIcpsIA和cpsGS1，它们扩增出一长度为1517bp的PCR产物且为GBS血清型VI特异性。
或者，也可使用能与GBS基因组中位于长度在各血清型之间有变化的区域两侧的保守区域结合的引物。这种情况下，GBS细菌存在就能得到PCR产物，而该PCR产物大小在各血清型之间有变化。
另外，可以将单个或两个都特异性结合的引物与PCR引物长度变化结合用作鉴定具体分子血清型的手段。
以cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，cpsI或cpsM基因为靶标的特异性引物/探针的实例包括下列引物cpsDS GCA AAA GAA CAG ATG GAA CAA AGT GGcpsES CTT TTG GAG TCG TGG CTA TCT TGcpsEA1 GA/T/GA AAA AAG GAA AGT CGT GTC G/ATT GcpsES1 CTT GGA C/TTC CTC TGA AAA GGA TTGcpsEA2 AAA A/CGC TTG ATC AAC AGT TAA GCA GGcpsES2 GAT GGT/C GGA CCG GCT ATC TTT TCT CcpsEA3 CTT AAT TTG TTC TGC ATC TAC TCG CcpsES3 GTT AGA TGT TCA ATA TAT CAA TGA ATG GTC TAT TTG GTCAGcpsEFA CCT TTC AAA CCT TAC CTT TAC TTA GCcpsFS CAT CTG GTG CCG CTG TAG CAG TAC CAT TcpsFA GTC GAAcpsGS1 GAA CTC TTA CATGAA AGA AGC TGA GAT TGT TAT CAC ACIbcpsIA CTA TCA ATGAAT GAG TCT GTT GTA GGA CGG ATT GCA CGIbcpsIS GATAAT AGT GGAGAA ATT TGT GATAAT TTA TCTCAA AAAGAC GIbcpsIA1 CCT GAT TCA TTG CAGAAG TCT TTA CGA TGC GAT AGGTGIVcpsMA GGG TCA ATT GTA TCG TCG CTG TCA ACA AAA CCA ATCAAATCVcpsMA CCC CCC ATA AGT ATAAAT AAT ATCCAA TCT TGC ATA GTCAGVlcpsIA GAA GCAAAG ATT CTA CAC AGT TCTCAA TCA CTA ACT
CCGcpsIA GTATAA CTT CTA TCA ATG GAT GAG TCT GTT GTA GTA CGG这些引物的命名与表2中所列引物相对应。
涉及alp2，alp3和rib表面蛋白抗原基因，异质性和蛋白抗原基因亚型更多在B组链球菌是否含有所述基因的水平上进行测试。我们的结果表明GBS基因组中出现表面蛋白基因的特异性结合是血清型/血清亚型的标记(见表9)。因此，适于本发明方法的引物/探针是特异性针对具体基因的。因此，优选特异性针对alp2或alp3或rib的探针/引物。图4给出的是用于设计alp2特异性或alp3特异性引物的alp2与alp3的对齐。
以alp2，alp3和rib基因为靶标的特异性引物/探针的实例包括下列引物bcaS1 GGTAAT CTTAAT ATT TTTGAA GAG TCA ATA GTT GCT GCATCTACbcaS2 CCAGGGA GTG CAG CGA CCTTAA ATACAA GCA TCbalS GAT CCTCAA AAC CTC ATT GTA TTAAAT CCA TCA AGC TATTCbbalA CCA GTTAAG ACT TCA TCA CGA CTC CCA TCA Cbal23S1 CAG ACT GTT AAA GTG GATGAA GAT ATT ACC TTT ACG Gbal23S2 CTT AAA GCTAAG TATGAA AAT GAT ATC ATT GGA GCT CGTGbal2S CTT CCG CCA GAT AAA ATTAAGbal2A CTG TTG ACT TAT CTG GAT AGG TCbal2A1 CGT GTT GTTCAA CAG TCC TAT GCT TAG CCT CTG GTGbal2A2 GGT ATC TGG TTT ATG ACC ATT TTT CCA GTT ATA CGbal3S GTT CTT CCG CTTAAG GAT AGbal3A GAC CGT TTG GTC CTT ACC TTT TGG TTC GTT GCT ATC C
ribS2 GAAGTAATTTCAG GAA GTG CTG TTA CGTTAA ACACAA ATATGribA1 GAA GGT TGT GTG AAATAA TTG CCG CCT TGC CTA ATGribA2 AAT ACT AGC TGC ACCAAC AGT AGTCAA TTC AGA AGG这些引物的命名与表6中所列引物相对应。
涉及IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1时，异质性和亚型更多在B组链球菌是否含有所述元件的水平上进行测试。也可对元件的数目进行测定。我们的结果表明GBS基因组中出现的可移动元件结合是血清型/血清亚型的标记(见表12)。因此，适于本发明方法的引物/探针是特异性针对具体可移动遗传元件的。因此，优选特异性针对IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1的探针/引物。
以IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1基因为靶标的特异性引物/探针的实例包括下列引物IS861S GAG AAA ACA AGA GGG AGA CCG AGT AAA ATG GGACGIS861A1 CAC GAT TTC GCA GTT CTAAAT AAA TCC GAC GAT AGC CIS861A2 CAA ACT CCG TCA CAT CGG TAT AGC ACT TCT CAT AGGIS1548S CTA TTG ATG ATT GCG CAG TTGAAT TGG ATA GTC GTCIS1548S1 GTT TGG GAC AGG TAG CGG TTG AGG AGA AAA GTA ATGIS1548A1 CAT TAC TTT TCT CCTCAA CCG CTA CCT GTC CCAAACIS1548A2 CCCAAT ACC ACGTAA CTT ATG CCA TTT GIS1548A3 CGT GTT ACG AGT CAT CCC AAT ACC ACG TAA CTT ATGCCIS1381S1 CTT ATG AAC AAA TTG CGG CTG ATT TTG GCA TTC ACGIS1381S2 GGC TCA GGC GAT TGT CAC AAG CCA AGG GAGIS1381A CTA AAA TCC TAG TTC ACG GTT GAT CAT TCC AGCISSa4S CGT ATC TGT CAC TTA TTT CCC TGC GGG TGT CTC CISSa4A1 GCC GAT GTC ACA ACA TAG TTC AGG ATA TAG CCA G
ISSa4A2 CGT AAA GGA GTC CAA AGA TGA TAG CCT TTT TGA ACCGBSi1S1 CAT CTC GGA ACA ATA TGC TCG AAG CTT ACA AGC AAGTGGBSi1S2 GGG GTC ACT ATC GAG CAG ATG GAT GAC TAT CTT CACGBSi1A1 AAT GGC TGT TTC GCA GGA GCG ATT GGG TCT GAA CCGBSi1A2 CCA GGG ACA TCA ATC TGT CTT GCG GAA CAG TAT CG优选地，所述引物/探针包括至少10、15或20个核苷酸。通常，引物/探针由少于100，50或30个的核苷酸组成。引物/探针通常是包括脱氧核苷酸的多核苷酸。它们也可以是其中含有合成或修饰核苷酸的多核苷酸。不同类型的寡核苷酸修饰方法已为本领域已知。这些包括甲基磷酸酯和硫代磷酸酯骨架，在分子3′和/或5′末端附加吖啶链或聚赖氨酸链。就本发明的目的而言，应当理解的是本申请所述的多核苷酸可以用本领域任一已知方法修饰。引物/探针可用任一合适的可检测标记物标记，例如放射性原子、荧光素分子或生物素。
一个实施方案中，引物/探针的解链温度＞70℃所以可用于快速PCR循环。
含有用于分析cpsD，cpsE，cpsF，cpsG，或cpsI/M中一个或多个区域的众多核苷酸的组合物还可进一步包括用于分析cpsH基因中一个或多个区域的核苷酸。实施例中描述了合适的核苷酸，尽管本领域技术人员可以根据图3所示的序列对齐设计出其他合适序列。
另外，含有用于分析alp2，alp3或rib中一个或多个区域的众多核苷酸的组合物还可进一步包括用于分析Cα(bca)和Cβ(bac)基因(Cβ基因又称bag)中一个或多个区域的核苷酸。
大量的技术手段都可用于分析目的细菌基因组中的一个或多个区域。通常，对疑似含有GBS细菌的目的样本进行处理，用常规技术从样本中存在的任一微生物获得基因组DNA。期望使用核酸制备技术使基因组DNA基本片段化用于众多后续检测步骤。样本可以出自细菌培养物或患者的临床样本，典型的为人类患者。可以将临床样本培养制备细菌培养物。但是，也可以用培养步骤直接测试临床样本。
然后，将基因组DNA应用到一个或多个分析步骤，包括测序、酶促、扩增和/或杂交。这些DNA分析的常规技术为本领域已知，详细描述见Sambrook等2001和Ausubel等1999同上。
血清分型包括一个或多个步骤。例如，执行初始步骤测定样本中是否存在有这样的核苷酸序列，即保守存在于GBS血清型但未发现于任一其他生物体的核苷酸序列。这可通过使用检测任一(但只检测)GBS细菌的PCR引物来实现(例如，使用引物对Sag59/Sag190和/或DSF2/DSR1-参见表2和3)。
然后通过下述操作对特定GBS血清型进行分子血清分型用以上述引物/探针为基础的任一合适技术例如测序、酶促、扩增和/或杂交，检测目的区域中一个或多个异质性区域的存在。
具体优选的检测技术为PCR，例如快速循环PCR(Kong等，2000)。
图2给出了多步骤血清分型策略的一个实例(算法)。但是，可以设想出多种其他策略，并且本领域技术人员使用本申请中提供的序列异质性信息能够设计出来。具体而言，优选血清学分型方法包括至少一个以分析cpsD，cpsE，cpsF，cpsG和/或cpsI/M基因一个或多个区域为基础的分析步骤。该分析可以任选与对cpsH基因一个或多个区域的分析结合。类似的技术可用于分析cpsH基因区域，方法在实施例中也有描述。
alp2，alp3和/或rib基因存在与否的分析可任选与Cα(bca基因)，Cβ(bac)基因序列存在与否的分析结合，描述见实施例。类似技术可用于分析这些区域，合适引物序列及PCR方法在实施例中也有描述。
此外，alp2，alp3和/或rib基因(以及任选bca和bac基因)存在与否的分析可与可移动遗传元件存在与否的分析结合进行。
因此，一种分型策略涉及以不同组合分析cps基因、表面蛋白基因和/或可移动遗传元件提供更多分型及亚分型信息。
使用上述技术对GBS基因组序列的分析可以在用凝胶电泳等方法常规判定后于溶液中进行。但是，在本发明一优选方面，所述引物/探针被固定于固相支持物上形成阵列。
通常，所述多核苷酸固定于固相支持物上或者固相支持物的离散区域(discrete regions)内。所述支持物可以是多孔性从而固定于支持物内部，或者也可是非多孔性的，这种情况下探针通常固定于支持物表面。合适固相支持物的实例包括玻璃平面(例如硼硅酸盐玻璃(borosilicateglass))，硅晶片，云母，陶磁及塑料等有机聚合物，包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯。还可使用半透膜如来源广泛的硝酸纤维素或尼龙膜。可以将所述半透膜糊表在一更坚固的固相表面如玻璃上。所述表面可任选包被一层金属，例如金、铂或其他过渡金属。
优选地，所述固相支持物通常为一具有刚性或半刚性表面的材料。优选实施方案中，所述支持物的至少一个表面基本上是平的，尽管在一些实施方案中，希望不同聚合物上具有物理学上分隔的合成区域，例如突起区域或蚀刻的凹槽。另外优选固相支持物适于将DNA序列高密度应用于通常为50～100μm的离散区域，密度为10000～40000cm-2。
所述固相支持物要便于分隔成区。这可用光刻等技术，或者用疏水墨水如特氟纶墨水(Cel-line，USA)。每一不同探针位于其中的离散位置可为任一便利性状，例如，圆形、矩形、椭圆形、楔形等。
可将文库序列以共价或非共价方式附加于支持物。所述文库序列借助与其结合的一层分子附加于支持物。例如，所述探针可用生物素标记，底物用亲和素和/或链霉亲和素标记。使用生物素标记探针的便利特点是偶联于支持物的效率可以很容易地测定出来。由于所述多核苷酸探针与一些支持物只是微弱结合，所以往往需要在固相支持物(例如玻璃)和探针之间提供一中间面。因此，支持物表面可通过下述操作，例如，用增强或减弱疏水度的化合物包被，或者用可共价连接多核苷酸探针的化合物包被。一些化学包被层可同时既改变疏水度又实现共价连接。固相支持物疏水度可通过硅烷处理或本领域已知的其他处理方法很容易地实现。合适的化学包被物的实例包括聚赖氨酸及聚(乙烯亚胺)。附加方法的其他细节见美国专利No.6,248,521。通过向分子引入不同官能团来固定核酸的方法描述还可见Bischoff等，1987(Anal.Biochem.，164336-3440和Kremsky等，1987(Nucl.Acids Res.152891-2910)。
用于制备固定的核酸分子阵列的技术在本领域已有描述。Schenaetal.，1998，Tib Tech 16301-306，提供了有用的综述，该文中还提供了其中所述技术的参考文献。
微阵列制备技术分为两大类——合成和分配。合成方法中，微阵列是通过核酸原位合成从生化组成部件逐步制备而成。随着每一轮的合成，核苷酸被添加到延长着的链上直至达到期望的长度。大量现有技术方法描述了如何原位合成单链核酸分子文库，例如用掩蔽技术(影印石版术)在固相支持物各个离散位置建立不同的序列排列。美国专利No.5,837,832描述了一种制备DNA阵列的改进方法，该方法根据极大规模积集化技术将DNA阵列固定在硅支持物上。具体而言，美国专利No.5,837,832描述了一种称之为″盖板″的技术在支持物空间特定位置处合成成套特异性探针，可用该技术制备本发明所述的固定的DNA文库。美国专利No.5,837,832还提供了还可使用的早期技术的参考文献。
相反，分配技术利用制备好的生化物质的外源沉积作用制备芯片结构。例如，可将DNA直接喷涂到支持物上，例如使用装有大头针的机器人装置(机械微量点样)或者使用压电装置(喷墨)。在机械微量点样中，生化样本通过毛细管作用装入点样大头针，通过大头针和固相支持物间的物理接触微小体积被转移到固相表面上。在第一个点样循环后，清洗大头针，装入第二样本，点积于邻近地址。机器人控制系统和多元墨头使得自动微阵列结构得以实现。喷墨涉及将生化样本上样，如将多核苷酸加入一装有压电装置的微型喷嘴，然后用电流将精确量的液体从喷嘴喷射到支持物上。第一个喷涂步骤后，清洗喷嘴，然后加入第二样本并点积到邻近地址。多个喷嘴的重复系列循环使得微阵列能够快速制成。
在一个实施方案中，所述微阵列是一种高密度阵列，其中包括多于约50，优选多于约100-200个不同核酸探针。所述高密度探针包括的探针密度大于约50，优选大于约500，更优选大于约1,000，最优选大于约2,000个不同核苷酸探针/cm2。所述阵列可进一步包括错配对照探针和/或标准探针(如阳性对照)。
本发明的微阵列通常包括众多上述引物/探针。所述引物/探针以任一秩序组合于阵列。但是，希望根据型(荚膜多糖基因血清型、血清亚型；蛋白抗原基因亚型；可移动遗传元件亚型)，或者型的组(荚膜多糖基因血清型、血清亚型；蛋白抗原基因亚型；可移动遗传元件亚型)，将特异性针对其的引物/探针分组。所述分组的排列要使得到的模式是易于被电脑软件是别的模式。
阵列中的元件可以包括一种类型的探针/引物或多种不同类型的引物/探针。
GBS基因组DNA与固定的引物/探针结合的检测可用多种技术来完成。例如，可以用特异性针对多种型(荚膜多糖基因血清型、血清亚型；蛋白抗原基因亚型；可移动遗传元件亚型)的固定探针作为俘获探针。在基因组DNA与阵列结合后，洗涤阵列并用一种或多种标记可检测探针孵育，该探针能与GBS基因组中的保守区域特异性杂交。然后可以通过检测标记物的存在来测定这些检测探针的结合情况。例如，所述标记物可以是荧光标记物，所述阵列可置于电荷耦合器件(CCD)摄像机的X-Y阅读器下。
其它技术包括在与阵列接触前标记基因组DNA(例如用切口翻译(nick-translation)及标记的dNTPs)。然后可以直接检测基因组DNA的结合情况。
还可以使用标记的dNTPs进行一步PCR扩增。该实施方案中，基因组DNA与阵列中的第一引物结合。聚合酶、dNTPs包括一些标记的dNTPs以及第二引物的加入导致合成出PCR产物中掺入了标记核苷酸。然后检测俘获到平板上的标记PCR片段。
大量现有的检测技术无需标记物而是依赖于配体结合时的质量变化(例如，表面等离子体激光共振(surface plasmon resonance，SPR))。SPR的原理和SPR所需使用的固相支持物的类型(例如BIACore芯片)描述见Ausubel等，1999，同上。
C.用途如上所述，B组链球菌(GBS)——无乳链球菌——是新生儿及产妇脓毒血症最常见病因，而且是中老年及免疫缺陷患者败血症越来越重要的病因。因此，本发明所述的检测方法、探针/引物及微阵列可用于诊断孕妇、老年人和/或免疫缺陷患者的GBS感染。本发明的PCR和微阵列技术可具体用于孕妇的妊娠前常规检查以及孕妇感染的诊断，并且与传统鉴定和分型方法相比精确度和灵敏度都有提高。由于不需要培养临床样本获得足量材料所有这些方法还可得到更为快速的结果。另外，所述分子技术可用于大多数实验室无需专家的专门意见和试剂。
本发明的分子分型方法有助于用于流行病学调查及需要在引入GBS偶联疫苗前后监测GBS分离株其它研究的全面菌株鉴定。
现在结合下列实施例对本发明做更为详细的描述，这些实施例只是为了说明而无任何限制。这些实施例中涉及附图。


图1.根据cpsD-cpsE-cpsF 3′-末端和cpsG 5′-末端的异质性序列而进行的分子血清型鉴定(相关引物如图所示)。
图2.通过PCR和测序进行GBS分子血清型(MS)鉴定的算法。
图3.血清型Ia，Ib，II，III，IV，V和VI的cpsG-cpscpsI/M基因序列的多序列对齐(起始和终止密码子用粗体突出显示)。
图4.alp2(AF208158，上面一行)和alp3(AF291065，下面一行)之间用于区别二者的两个序列异质性位点(*)(相关引物如图所示)。
图5.194株(或56个基因型)侵袭性澳大利亚GBS株的遗传亲缘关系。
题头为“GBS基因型的遗传标记”一栏的注解蛋白抗原基因谱的代号为″A″bca的5′末端阳性；″a″或″as″bca重复单元或bca重复单元样区域阳性，分别带有多个或单个扩增子条带；″B″bac阳性；″R″rib阳性；″alp2″alp2阳性；″alp3″alp3阳性；″None″不含有上述蛋白基因的分离株。
粗体字显示的分子标记表明每一簇的共同特征。
题头为“菌株序号”一栏的注解″+″后是CSF分离株的数目，其余为血液分离株题头为“基因分型”一栏的注解每一基因型的特征在于cps基因、蛋白基因谱及可移动遗传元件的独一无二组合。每一血清型中的主导基因型命名为该血清型的“1”基因型。
树状图的注解在距离约16处，56个基因型分成为8个簇(1-8)；在距离约22.5处，这56个基因型分为3个簇组(A，B，C)。
实施例材料和方法GBS参照株和临床分离株一组9个GBS血清型(从Ia到VIII)由Channing Laboratory，BostonUSA的Lawrence Paoletti博士友情惠赠(标准组1)。StreptococcusReference Laboratory，at ESR，Wellington，New Zealand的Diana Martin博士提供了另一组9个国际标准GBS型株包括从血清型Ia到VI(标准组2)(表1)。此外，我们测试了205个临床病例的分离株，其中146个已由新西兰不同实验室血清分型，另59株来自悉尼一诊断实验室正常情况下10年多无菌位点。然后混合为一个培养物，对206个不同分离株进行测试。传统血清分型(CS)在Streptococcus Reference Laboratory，at ESR，Wellington，New Zealand中进行，MS在Centre for Infectious Diseases andMicrobiology Laboratory Services，ICPMR，Sydney，Australia中进行。
对这两组GBS参照株和选取的63个临床分离株进行更详细的研究，对每一株测序＞2200碱基对(bp)鉴定出用于MS的合适序列。然后，用这些及剩余临床分离株评价MS方法，并与CS进行结果比较。起初在互不知道结果的情况下用两种方法分型。
通过血琼脂平板(ColumbiaII基础琼脂添加5％马血)亚培养从保存物中回收细菌分离株，然后37℃下孵育过夜。
侵袭性GBS临床分离株可移动遗传元件试验中使用的所有194个分离株都回收自191个患者的血液(177)或CSF(17)(107个女性，80个男性，4个未记录性别；三个培养物每一含有两个GBS血清型的混合生长)。108分离株出自1996-2001期间提交到Centre for Infectious Diseases and MicrobiologyLaboratory Services，ICPMR，Sydney，Australia的培养物标本，83来自Institute of Environmental Science and Research(ESR)，Porirua，Wellington，New Zealand for serotyping，来源于1994-2000期间新西兰不同诊断实验室。
患者按下列年龄段分组进行基因型分布分析新生儿早期(0-6天)；新生儿晚期(7天～3月)；婴儿和儿童(4月-14岁)；青少年(15-45岁)；中年(46-60岁)；老年(＞60岁)。
这些分离株大部分是上述分离组的一部分，但是参照株和非侵袭性分离株除外。
传统血清分型(CS).
CS用常规方法进行(Wilkinson和Moody，1969)。简而言之，从每一分离株制备酸-热(56℃)提取物，在琼脂糖中用型特异性抗血清免疫沉淀测定血清型。当沉淀发生时形成与对照株特征性的沉淀线时则可认为该分离株是特定血清型特异性的。用兔ESR制备所使用的抗血清型Ia，Ib，Ic，II，III，IV，V和R蛋白抗原的抗血清。选择14株分离株，其中六株用抗血清型I-V的抗血清无法分型，六株在最初在CS和MS间出现矛盾结果，另外两个是来自混合培养物的独立分离株，这些分离株都由Central Public Health Laboratory，Colindale，London，UK的AbbieWeisner和Androulla Efstratiou博士友情用抗全部血清型的抗血清进行了测试。
分子血清型鉴定(MS)；方法的建立。
寡核苷酸引物本实验使用的寡核苷酸引物、及其靶标位点和解链温度显示于表2、6和10。其特异性和扩增子的预期长度显示于表3、7和11。所述引物按照我们的说明由Sigma-Aldrich(Castle Hill NSW，Australia)合成。用4个此前已公开的寡核苷酸引物和我们新设计的一系列引物对名称为16S/23S rRNA基因间区和部分cps基因簇的目的基因测序，或者扩增GBS血清型的独一无二序列。用6个此前已公开的寡核苷酸引物和我们新设计的一系列引物对GBS表面蛋白的编码基因进行测序和/或特异性扩增。我们还设计了一系列引物对已知的GBS可移动遗传元件进行测序和/或特异性扩增。将一些引物设计为高解链温度(＞70℃)用于快速循环PCR。
DNA制备及聚合酶链反应(PCR)用接种环从5个单个GBS克隆或一系列培养物取样，并重悬于装有1ml消化缓冲液(10mM Tris-HCI，pH8.0，0.45％ Triton X-100和0.45％Tween 20)的2ml Eppendorf管。然后将装有GBS悬液的管100℃加热10分钟(dry block heater或水浴)后冰上骤冷，然后14,000rpm离心2分钟得到细胞碎片沉淀。含提取DNA的每一上清各取5μl用作PCR模板(Mawn等，1993)。
使用此前描述的PCR系统(25μl只检测用，50μl用于检测和测序)(Kong etal.，1999)。使用的变性、退火和延伸温度及时间分别为96℃1秒，55-72℃(根据引物的Tm值或按此前描述)1秒以及74℃1-30(根据扩增子的长度而定)，共35个循环。
取10μl PCR产物，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳分析，凝胶用0.5μg溴化乙锭/mL染色。对于检测和/或血清型鉴定而言，当紫外线透视显示出预期长度PCR扩增子则可判定为阳性。就测序而言，取PCR产物40μl用聚乙二醇沉淀法进一步纯化(Ahmet等，1999)。
测序PCR产物的测序使用Applied Biosystems(ABI)Taq DyeDeoxy终止子循环，测序试剂盒按常规操作进行。用相应的扩增引物或内引物作为测序引物。
多序列对齐及序列比对多序列对齐用Pileup和Pretty程序在Multiple Sequence Analysisprogram group中完成。序列比对使用Comparison program group中的Bestfit程序。所有程序由WebANGIS，ANGIS(Australian NationalGenomic Information Service)提供，第3版。
表面蛋白基因谱代号根据使用不同引物对得到的阳性PCR结果给每一分离株一个蛋白基因谱代号，如表7所示。
核苷酸序列的等记号公开的新序列数据已经提交给GenBank核苷酸序列数据库，并分配给了下列等记号AF291411-AF291419(来自标准组1中从Ia到VIII的血清型的16S/23SrRNA基因间区)；AF332893-AF332917，AF363032-AF363060，AF367973，AF381030和AF381031(两组参照株的部分cps基因簇(表)以及选择的有代表性的临床分离株)；AF367974(部分bac基因序列，带有来自分离株的插入序列IS1381)，AF362685-AF362704(所有bac阳性分离株的部分bac基因序列)以及AF373214(参照株Prague25/60的部分rib样基因，一种R蛋白参照株)。
本申请中提到的此前报道的序列数据出现于GenBank核苷酸序列数据库，具有下列等记号AB023574(16S rRNA基因)；U39765，L31412(16S/23S rRNA基因间区)；X68427(口腔链球菌23S rRNA基因)；X72754(cfb基因)；AB028896(血清型Ia的cps基因)；AB050723(血清型Ib的部分cps基因)；AF163833(血清型III的cps基因簇)；AF355776(血清型IV的cps基因)；AF349539(血清型V的cps基因簇)；AF337958(血清型VI的cps基因簇)；M97256(bca基因)；X58470，X59771(bac基因)；U58333(rib基因)；AF208158(alp2基因)″AF291065-AF291072(alp3基因)；AF064785(IS1381)；M22449(IS861)；Y14270(IS1548)；AF064785(IS1381)；AF165983(ISSa4)；和AJ292930(GBSi1)。
统计学分析及系统树图.
使用SSPS版本11软件进行统计学分析。用SSPS版本11软件中的Average Linkage(组与组之间)及Hierarchical簇分析制成系统树图。每一标记物的存在与否-MS Ia，Ib，II，IV-VI；sst III-1-4；pgp″A″，″R″，″a″，″as″，″alp2″，alp3″；bac亚组1，1a，2，3，3a，3b，3c，4，4b，5a，7，7a，8，9，9a，10，n1，n2；以及mge IS1381，IS861，IS1548，ISSa4，GBSi1——都被包括在分析之中。每一基因型的特征在于分子血清型(MS)或sst、pgp及mge的独一无二结合。
实施例1.GBS基因组中特定区域血清型/血清亚型间或内序列异质性研究以及分子血清分型/血清亚分型稳定性的评估聚合酶链反应除两个外，所有GBS特异性引物对从所有参照株及所测试临床分离株都产生了预期大小的扩增子(表3)。例外的两个引物对是Sag59/Sag190和CFBS/CFBA。这两个引物对都是以cfb基因为目标，尽管进行了多次重复尝试，但是都没有从一临床分离株中扩增出扩增子。我们认为要么是该分离株不含有cfb基因，要么是该基因以变体的形式存在。此前已有教导以cfb基因为靶标的PCR不能鉴定全部GBS分离株(Hassan等，2000)，而且另一以16SrRNA基因为基础的引物对，DSF2/DSR1(Ahmet等，1999)并不是完全特异性的。因此，在该研究中，我们使用这两个引物对(DSF2/DSR1和Sag59/Sag190)证实所有分离株都是GBS。16S/23S rRNA基因间区的序列异质性对标准组1中血清型Ia到VIII的16S/23S rRNA基因间区测序。多个序列对齐表明血清型间只有两个位点不同207(血清型V是T或C[T/C]，血清型VII和VIII是C，其他为T)和272(血清型III是T，其他为G)。因此这些区域适于MS。
cpsD-cpsE-cpsF 3′末端和cpsG 5′末端的序列异质性使用以cpsD-cpsE-cpsF 3′末端和cpsG 5′末端为目标的一系列引物，我们对从两标准菌组株(血清型Ia到VII)以及选取的63个临床分离株扩增出2226或2217bp——这取决于一段9碱基重复序列出现与否，并测序。将有代表性序列提交GenBank。标准组菌株的GenBank登记号见表1。
重复序列我们在大多数MS Ia和II，一些MS III，所有MS IV、V和VII的cpsD3′末端区域发现了一段9碱基重复序列(TTA CGG CGA)，但是检测的MSIb或VI无一株出现该序列(表4)。该重复序列出现与否可以被用来进一步亚分型MSIa，II和III(参见下文)。
血清型内的异质性通常，血清型内的异质性很低——在除MSIII外所有血清型一些分离株中有着极少量随机变异，MSIII的血清型内异质性较为复杂。根据22个位置处——第62，139，144，204，300，321，429，437，457，486，602，636，971，1026，1194，1413，1501，1512，1518，1527，1629，和2134位——的异质性以及上述重复序列出现与否(在第78-86位)，MSIII可分为4个序列亚型(表4)。
在60个MSIII分离株(58个临床分离株和2个参照株)中，主要为血清亚型III-1(30个分离株)和III-2(22个分离株)。所述重复序列出现于血清亚型III-1但不出现于III-2；在其他7个位点(139，144，204，300，321，636，和1629)有差异。
有5个分离株属于血清亚型III-3，其中含有所述重复序列，在3个可变位点处(139，144，和300)与血清亚型III-1相同，在4个位点处(204，321，626和1629)与血清亚型III-2相同。血清亚型III-3在7个位点处(486，1026，1413，1512，1518，1527，和2134)不同于血清亚型III-1和III-2.血清亚型III-3中的这7个位点与MS Ia中相应位点相同。
有3株血清亚型III-4分离株，其序列与MSII相应序列几乎相同。唯一的区别是第437位，在该处血清亚型III-4的核苷酸是T(MSVII也是如此)，而MS II中是C。该区别可用于(结合PCR，见下文)区分血清亚型III-4和MSII。血清亚型III-4分离株中有两株含有所述重复序列，另一株没有。由于血清亚型III-4分离株的数目很少，我们没有使用重复序列对其进一步亚分型。
血清型间的异质性在8个MS之间有56个异质性位点(表4)。PCR/测序进行MS最适用的位点是最靠近3′末端区域的一组23个位点(表4，图1)。首先，它们在两组参照株及大多数临床分离株中是一致的(只有少数血清亚型III-3和III-4分离株例外，见下文)。其次，它们相对集中于790bp区域，其长度便于单次反应测序。第三，除极少数外它们含有足够的异质性位点从而可区分MS Ia-VII。仅根据这个790bp区域，没法区分血清亚型III-3与MS Ia，也不能区分血清亚型III-4和MS II。但是，它们可以通过MS III特异性PCR鉴定(参见下文)。
血清型VIII用以790bp区域为目标的引物对没有得到扩增子，但是可以通过GBS PCR鉴定后排除来鉴定。该试验中，鉴定出1株MSVIII分离株，扩增2226bp区域的引物对中没有一对从中扩增出(另加扩增790bp区域的那些引物对)扩增子。这一结果已用VIII特异性抗血清确证。
单一分离株中的混合血清型特异性根据MS特异性PCR和全序列(2226/2217bp节段内)有11个分离株被鉴定为一个MS，但是其序列在一些位点上不同与同一MS的分离株，并且彼此间具有位点特异性特征。它们包括5个血清亚型III-3分离株和3个血清亚型III-4(见上文)。一株无法血清分型的参照株(Prague25/60)被鉴定为MS II，其在5′末端区域中的5个位点上不同于其他MS II分离株，而这些位点中3个却与MS III相同。Prague 25/60 MS III特异性PCR为阴性。一个鉴定为CSII的临床分离株根据其全序列鉴定为MSII，其在5′-末端区域的9个位点具有血清型Ib特性的碱基；MSIb特异性PCR为阴性。最后，1个CSV参照株(Prague10/84)测序结果与GenBank相应序列(AF349539)相同，但是二者在5′末端区域3个位点与我们研究的其他MSV菌株都不同。
除与血清亚型III-3和III-4相关的外，所有这些混合血清型特异性都发生在2226/2217片段的5′末端区域。这一点支持了我们选择790bp 3′末端作为MS测序目标的观点。用这一目标，所有MS都能被正确鉴定，除了MS III属于血清亚型III-3和III-4外，它们可通过MS III特异性PCR(参见实施例2)。
实施例2.根据以cpsG-cpsH-cpsI/cpsM的3′末端为靶标的MS特异性PCR进行分子血清型鉴定(MS)。
我们的序列对齐结果显示在cpsG-cpsH-cpsI/cpsM的3′末端存在明显的序列异质性(图3)，这就使得其适合用于设计PCR直接区分Ia，Ib，III，IV，V，和VI所用的特异性引物对。为了满足将来其他可能的要求，例如，设计多重PCR和/或进一步评估序列分型方法，我们针对每一血清型都设计了几个引物对(表2和3)。使用两组参照株和特定条件，所有引物对只从相应的血清型中扩增出DNA。当我们对临床分离株测试时，得到了与两套MS特异性引物对近似的结果。通常，用可以用更严谨条件(较低的引物浓度，较高的退火温度)得到较小的扩增子。MS选用的引物对见表3和图2。
206个临床分离株中的179个(86.9％)用PCR确定的MS如下MS Ia40个；MSIb 35个；MSIII 58个(其中包括此前鉴定为血清亚型III-3和III-4的分离株)；MS IV 7个；MS V 36个；MSVI 3个。
实施例3.对MS与CS血清型鉴定结果进行比较在完成CS和MS后，对结果进行了比较。最初结果中有15个分离株的结果不一致，但是，除了其中的5个以外，其余都(见下文)通过重新测试和/或校正笔误而得到解决。
CS和MS/序列亚分型结果见表5。通过PCR和/或测序所有分离株都确定了MS，与之相比206个分离株中只有188个(91.3％)确定了CS。目前还没有针对MSII和VIII的特异性PCR，所以所有MSII分离株只能通过测序测定，一个假定的MS VIII分离株是通过排除法确定的(见实施例1)。对于所有其他分离株而言，除上述的血清亚型III-3和III-4及其他极少序列差异外，PCR与测序的结果都是一致的(实施例1)。CS结果与PCR结果完全相关。
用CS和MS两个方法都能得到结果的所有188分离株其最终的CS和MS结果是相同的(100％)。18个CS不能分型的临床分离株用MS分型结果如下Ia，2个；Ib，5个；II，1个；血清亚型III-1，3个；血清亚型III-2，1个；V，5个；以及VI，1个。
我们鉴定为MS VI的那3个临床分离株的序列(2217bp)与血清型VI参照株序列及GenBank中的相应序列(AF337958)相同。
混合培养.
4个临床分离株用MS III特异性PCR得到阳性结果，但是通过测序手段暂定为MS II。与血清型III抗血清交叉反应其中3个为CS III，1个为CS II。这些分离株每株亚培养12个单菌落进一步研究。所有亚培养物用MS III特异性PCR测试。那3个CS III分离株的12个菌落亚培养物MS III特异性PCR的结果全部为阳性，因此分离株分类为血清亚型III-4(见上文)。但是，第4个分离株的12个菌落亚培养物其中11个为MSIII特异性PCR阴性；另一个为MS III特异性PCR。因此，可以判定为一混合培养物，MS/CS II占主导地位。那个MS III特异性PCR阳性的菌落随后鉴定为血清亚型III-2，并且作为另加临床分离株被包括在内(总共206个)。
实施例4.通过PCR和测序确定血清型的算法作为如何将PCR及测序方法用于临床进行GBS血清型的鉴定的一个实例，我们设计了一个临床用的算法。使用的所有引物(除内测序引物外)都具有高的解链温度(＞70℃)，所以可使用快速循环PCR(图2)(引物序列见表2)。
实施例5.alp2，alp3和rib基因中适合蛋白抗原基因特异性分型区域的鉴定聚合酶链反应除极少数外，所有引物从阳性结果分离株中都扩增出预期大小的扩增子(表7)。例外的菌株包括这样一个菌株用引物对GBS1360S/GBS1937A和GBS1717S/GBS1937A(二者都以bac基因为靶标)PCR扩增结果为阳性，但是生成的扩增子明显长于其它bac基因阳性分离株。测序结果表明该扩增子中包含内含子IS1381，该内含子与公开的序列(Tamura等，2000)相比差别甚微。用引物对IgAagGBS/RlgAagGBS和IgAS1/1gM1(也以bac基因为靶标)得到的扩增子的长度不同(Berner等，1999)，测序进一步亚分型(见下文和表8)。
扩增子的测序结果为了证实我们设计或修饰的选用引物对的特异性，我们对用bcaS1/bcaA(以bca基因5′-末端为靶标)从两组参照株和31个随机选取的临床分离株扩增出的23个扩增子中的10个以及用ribS1/ribA3(以rib基因为靶标)和GBS1360S/GBS1937A(以bca基因为靶标)从中扩增出的全部扩增子进行了测序。引物对bcaS1/bcaA扩增到全部10个扩增子以及引物ribS1/ribA3扩增的13个中12个扩增子与GenBank中的相应基因序列(分别为M97256，bca基因和U58333，rib基因)。另一个标准组2中名为Prague 25/60的分离株(用其来制备R抗血清)，用引物对ribS1/ribA3只是在较低退火温度(55℃)下才能得到扩增子而用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2则不能得到。因此可以认为不含有rib基因，尽管该扩增子的序列与rib基因之间表现出一定的同源性(根据引物序列有无包括在内为71.4％或66.6％)(图3)。该分离株是224个测试株中唯一一个用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2 PCR扩增阴性而用ribS1/ribA3扩增阳性的菌株。后一引物对被认为是非完全特异于rib基因，因此只用于测序。
引物对GBS1360S/GBS1937A(以bac基因为目标)10个扩增子中的4个与GenBank中的相应序列(X58470，X59771)相同。包括含有插入序列IS1381那个扩增子(见上文和AF367974)在内的其余6个扩增子中发现了单位点突变(X59771中的第1441位的A变为G)。
对用引物对bcaS1/balA(以alp2/alp3基因为靶标)、bal23S1/bal2A2(以alp2为目标)和IgAagGBS/RlgAagGBS(以bac为目标)得到PCR阳性结果的所有224个分离株的扩增子进行了测序。
用引物对bcaS1/balA从50个分离株中得到扩增子。其中9个的序列与公开的alp2基因序列的相应部分(AF208158)等同，而另41个与alp3基因(AF291065)相同。bcaS1/balA扩增子中，alp2和alp3基因之间有两个稳定的异质性位点(图4)，除alp2和alp3基因特异性PCR外，可用其来区分这两个基因。引物对bal23S1/bal2A2的全部9个扩增子都与GenBank中alp2基因序列相应部分(AF208158)等同。
引物对IgAagGBS/RlgAagGBS从52分离株中鉴定到bac基因。其中存在一定的序列变异，这可将bac基因阳性分离株根据扩增子长度和序列异质性分别分为11个组和20个亚组(表8)。除B1(20个分离株，2个亚组)和B4(11个分离株，3个亚组)外，这些组都含有较少数目(1～5个)的分离株。扩增子长度的差异通常是因有无短重复序列存在造成的。
表面蛋白基因特异性引物对特异性的进一步确证为了证实引物特异性，我们将用为bac基因PCR设计和修饰的引物序列得到的PCR结果与用此前公开引物得到的PCR结果进行了比较，发现相关度为100％。
此前报道的公开的引物对bcaRUS/bcaRUA(以bca基因的重复单元为目标)的非特异性得到了证实。使用这些引物对，9个alp2基因阳性的(bcaS1/bcaA阴性)分离株以及53个使用引物bcaSI/bcaA，bcaS2/bcaA(以bca基因的5′末端为靶标)，bal23S1/bal2A2和bal23S2/bal2A1(以alp2基因的5′末端为靶标)PCR扩增阴性的分离株都得到了扩增子。我们测序显示在bcaRUS/bcaRUA的靶标区域bca基因和alp2基因之间有着显著的同源性因而使得从alp2基因阳性菌株中获得扩增子。这些错误的阳性结果可能是由于其他Cα样蛋白存在的原因，该蛋白含有与bca基因重复单元同源的区域(bca基因重复单元样序列)。
我们还查明使用我们为单个基因(rib，alp2，和alp3基因)设计的两个或多个引物对PCR扩增的结果完全相关，这证实了每套引物的特异性。唯一例外的是ribS1/ribA3，如上所述，从测试的224分离株中的一株中得到一非特异性扩增子。
实施例6.表面蛋白抗原基因谱与cps血清型/血清亚型间的相互关系表面蛋白基因谱对于每一基因(除bca基因重复单元或bca基因重复单元样区域)，我们都选取两个引物对通过PCR方法鉴定和定性GBS表面蛋白。每一分离株都根据PCR结果给定一蛋白基因谱″A″用bcaS1/bcaA和bcaS2/bcaA扩增的bca基因5′末端；″a″或″as″用bcaRUS/bcaRUA扩增的bca基因重复单元或bca基因重复单元样区域，分别有多个或单个扩增子条带；″B″用GBS1360S/GBS1937A和IgAagGBS/RlgAagGBS扩增的bac基因(＞20亚组根据序列异质性)。
″R″用ribS2/ribA1和ribS2/ribA2扩增的rib基因；″alp2″用bal23S1/bal2A2和bal23S2/bal2A1扩增的alp2基因；以及″alp3″用bal23S1/bal3A和bal23S2/bal3A扩增的alp3基因(表7)。
4个常见基因谱占到了224个分离株中的203个(90.6％)″R″(62个分离株)，″AaB″(51个分离株)，″a″(49个分离株)以及″alp3″(41个分离株)(见表4)。只有2个分离株不含有任何表面蛋白基因标记。除1个含有bac基因的(″B″)分离株外的所有分离株都还含有bca基因，带有其重复单元(″Aa″)；1个分离株含有rib基因。所有″alp2″分离株都含有单个bca重复单元样序列(″as″).″A″、″R″、″alp2″及″alp3″都相互间排斥。63个含rib基因的分离株(″R″)中的62个以及41个含alp3基因能的分离株中的41个都不含有任何其他蛋白抗原标记。
表面蛋白抗原基因谱与cps血清型/血清亚型间的相互关系根据实施例1至4所述方法，所有分离株都被确定了cps分子血清型(MS)，其结果与传统血清分型(CS)结果相关，224个分离株中的19株用抗血清无法分型。表面蛋白基因谱与cps MS间相互关系概括于表9。
已证实或显示下列两两之间存在强相关MS Ia与bca基因重复单元或bca基因重复单元样序列(大多数含有谱″a″)；MS血清亚型III-1和III-2与rib基因；MS血清亚型III-3与alp2基因；MSIb与bca/bac基因以及MS V与alp3基因。MS II表现出最大变化的表面蛋白基因谱。但是，所述相互关系并非绝对的，就bac基因(″B″)亚组而言，cps血清型与基因谱之间的不同组合得到31个不同的血清变体。
实施例7.表面蛋白抗原与蛋白基因谱间的相互关系根据传统血清学分型，33个分离株(属于CS Ia/c，Ib/c，IIc，IIb，IIIc或IIIb)与C抗血清反应。所有这些分离株的表面蛋白基因谱都含有bca基因(″A″)或bca基因重复单元相关标记(″a″或″as″)Aa，3个；AaB，18个；a，11个；alp2as，1个。29个分离株与R抗血清反应，这些分离株中的22个含有rib基因，6个含有alp3基因。用来制备R蛋白抗血清的那一株(Prague 25/60)含有一假定的rib样基因(见上文和图3)。
实施例8.适于分子分型的可移动遗传元件的鉴定我们制备了一系列PCR引物筛查5个可移动元件在GBS血清型中的存在情况。
引物对的特异性所有引物对从一些参照株和/或一些临床分离株(表12)中都得到了预期长度的扩增子(表11)。为了评价我们引物对的特异性，我们对用引物IS1548S/1S1548A3和ISSa4S/ISSa4A2扩增出的所有扩增子以及选择，分离株，用IS861S/IS861A2(12个分离株)、IS1381 S1/1S1381A(24个分离株)和GBSi1 S1/GBSi1A2(11个分离株)扩增时选自参照株和临床分离株都得到的扩增子进行了测序。
所有41个IS1548和15个ISSa4扩增子序列都与GenBank中的相应序列(分别为Y14270和AF165983)相同。12个IS861扩增子中的5个与GenBank中相应的IS861序列(M22449)等同。另7个在第732位上不同于公开序列(由G变为了A)，参照株Prague 25/60另外还有两处不同——M22449中的第576位和830位分别由G变为A，T变为A。
此前，我们在一临床分离株Cβ抗原基因中发现一全长的插入序列IS1381(AF367974)，该序列与最初公开的序列(AF064785)相比有几处不同末端插入重复序列含有15个，而不是20个碱基对(bp)；缺失了3个bp，推定的转座酶假基因中第419-429位之间(最初的GenBank序列)有4个单个bp不同-GGG ATC CGA TT(AF064785)vs CAG A---GG TA(AF367974；我们的序列)。引物对IS1381S1/1S1381A从12个参照株和12个选择的临床分离株中得到的扩增子相互间等同，并且与GenBank中我们的IS 1381序列(AF367974)也相同，但是与最初报道的IS1381序列(AF064785)不同。
对用引物对GBSi1S1/GBSi1A2从所有4个GBSi1阳性参照株及7个选择的临床分离株中得到的扩增子进行了测序。6个扩增子(包括3个参照株的扩增子)与GenBank中相应的GBSi1序列(AJ292930)相同。4个临床分离株的扩增子显示有3个位点变异(AJ292930 s序列中的第767位C变为T，第846位A变为C，以及第923位T变为C)。参照株Prague 25/60显示只有这些位点变异中的前两个。
除测序外，我们还通过用每一靶标的两个或多个引物对比较PCR结果来评价我们引物对的特异性(表11)。所有情况下，当用靶向同一可移动遗传元件的PCR测试时，同一套分离株得到了阳性结果，因而证实了我们引物对的特异性。
用所有5种可移动遗传元件的特异性引物对的PCR结果分离株中鉴定出的IS861，IS1548，IS1381，ISSa4和GBSi1分别占55％，18％，85％，7％和19％。有10个(4％)分离株没有检测到任何可移动元件。此前实施例中测试了用PCR在224个GBS分离株中测试鉴定得到的5种可移动元件的分布情况，见表12。79个分离株中只检测到IS1381，1个分离株中只检测GBSi1。46个分离株含有两种不同的插入序列(IS861和IS1381，42个分离株；IS 1548和IS1381，3个分离株；ISSa4和IS1381，1个分离株)。44个分离株含3种(IS861、IS1548和IS1381 34个；IS861、ISSa4和IS1381，10个)，另一个含有全部4种插入序列。41个分离株含GBSi1与一种(IS861，22个；IS1381，1个分离株)、两种(IS861和IS1381，11个；ISSa4和IS1381，3个分离株)或三种(IS861，IS1548和IS1381，4个分离株)插入序列的组合。
用所有5种可移动遗传元件特异性引物对194个侵袭性分离株PCR扩增结果含有不同可移动遗传元件(mge)组合(每个分离株中从无到4种)分离株的数目见表13。鉴定出的IS1381、IS861、IS1548、ISSa4和GBSi1分别为87％、52％、17％、6％和18％。6个(3％)分离株中不含任何mge。
实施例9.cps血清型、血清亚型、表面蛋白基因谱与可移动遗传元件之间的相互关系5种可移动遗传元件中的每一种在不同cps血清型、血清型III的血清亚型和表面蛋白基因谱中的分布见表12和13。每一血清/血清亚型的最一致结果是1)血清型Ia——大多数(＞80％)表达与Cα蛋白紧密相关的蛋白，且含有IS1381；2)血清型Ib——大多数(＞90％)表达Cα及Cβ蛋白，且含有IS861和IS1381；3)血清型II——显示两种常见模式a)＞50％分离株表达Cα蛋白和表达量(往往还有Cβ)，且含有IS861、IS1381以及有时还有其他可移动元件，尤其是ISSa4，或者b)＞25％分离株表达Rib蛋白，且含有IS861、IS1381和GBSi1；
4)血清亚型III-1——全部表达Rib蛋白，且含有IS861、IS1548和IS1381但不含GBSi1。
5)血清亚型III-2——全部表达Rib蛋白且含有IS861和GBSi1，但不含IS1548和IS1381。
6)血清亚型III-3——全部表达Cα样蛋白2，且不含任何可移动遗传元件。
7)血清亚型III-4——表达不同蛋白；都含有GBSi1.
8)血清型IV——大多数表达与Cα蛋白紧密相关的蛋白，且含有IS13819)血清型V——大多数表达Cα样蛋白3含有IS138110)GBSi1和IS1548在血清型III中相互排斥(III-1，III-2和III-4)但在血清型II不相互排斥。
11)表达Cα样蛋白2的所有分离株都不含任何插入序列。
MS/sst、pgp和mge之间的主要相互关系图5显示了不同遗传标记间的相互关系。IS1381出现在近乎全部的MS Ia、Ib、IV，V和VI分离株，但不出现于任一sstIII-2或III-3分离株。在血清型II或III中无一例外的发现了IS1548，大多数发现了GBSi1；3个分离株(都为MS II)中含有GBSi1和IS1548。IS861发现于所有sstIII-1和III-2以及大部分MS II和Ib分离株，但是其他MS的分离株中仅14％出现。ISSa4只出现于6％的分离株，其中半数以上为MSII；其还出现于1996以前(1994)获得的一分离株。IS1381发现于除簇8、pgp″alp2″中分离株外的大多数分离株，簇8、pgp″alp2″中分离株中无任何插入序列。IS861出现于带有pgp″AaB″(簇3和4)的基因型大多数和带有pgp″R″(簇6和7)的基因型全部分离株中。
根据MS/sst、pgp、bac亚型及mge的基因型MS/sst，pgp，bac亚型(对于带有pgp″B″的分离株而言)以及mge不同组合的出现提供了一种以PCR/测序为基础的基因分型系统。该试验中的194个侵袭性分离株根据pgp和mge的分布分为7个血清型、10个MS/sst、41个亚型或56个基因型当bac亚型(主要出现于MS Ib)包括在内时(图5)。
理论上的GBS克隆群结构理论上，存在有13种可能的GBS MS/sst(8个MS-Ia，Ib，II，IV-VIII，4个sst III 1-4以及cps基因簇不存在)以及至少10种pgp(无、″Aa″，″AaB″，″a″，″as″，″R″，″RB″，″alp2as″，″alp3″或″alp4a″)。如果将迄今为止鉴定到的22种bac亚组包括在内，共有31种pgp。如果所述5种mge是独立的、随机分布的以及出现与否，那么将会有13×31×25＝12，896种不同组合的分子标记。但是只发现了56种不同组合(图5)，这一事实说明标记并非是随机分布的，或者换句话说，这些侵袭性澳大利亚GBS分离株具有一种克隆群结构。有可能是这些分离株仅代表了有限数目的GBS基因型，但是这种可能性不存在。
澳大利亚侵袭性GBS的系统发育相互关系56种基因型形成了8个簇，以约～16的遗传距离间隔(或者是以约～22.5的遗传距离间隔的3个簇)。pgp是簇分隔的主要决定因素(图5)。分离株中的94％属于5种MS(Ia，Ib，II，III和V)，62％属于5种(9％)基因型(Ia-1，Ib-1，III-1，III-2，V-1)以及92％属于5种最长的簇(1，2，4，6和7)。簇组A最大，包括139个(72％)分离株和48种(86％)基因型，其中45种的分离株少于5个，而簇组B含有49个(25％)分离株和5种(9％)基因型。
每一簇的主要特征如下簇1.″alp3″，IS1381(39个分离株，4种MS，11种基因型；主要为基因型V-1)。
簇2″a″或″as″、IS1381(55个分离株，4种MS，12种基因型；主要为基因型Ia-1)。
簇3″Aa″或″AaB″，MS II，IS1381，IS 861(10个分离株，6种基因型)。
簇4″AaB″，IS1381，IS861(35个分离株，两种MSVI或Ib；18种基因型；主要为Ib-1)。
簇5″AaB″，IS861，GBSi1，基因型III-4-1(1个分离株)。
簇6″R″，IS861和GBSi1(22个分离株，3种MS/基因型；主要为基因型III-2)。
簇7″R″，IS1381和IS861(27个分离株；两种MS/基因型；主要为III-1)。
簇8″alp2as″，无IS(6个分离株；3种MS/基因型；1含有GBSi1)。
系统发育研究表明用SSPS构建的树形图很粗壮。
基因型与GBS疾病模式间的相互关系患侵袭性GBS疾病患者不同年龄组中MS和基因型的分布见表14。所有常见MS反复出现于1个以上患者组。但是，(当比较所有其他年龄组时)sstIII-2与新生儿晚期感染之间(p＝0.0005)以及MS V和晚年感染之间(p＝0.001)存在极显著相关。
17个分离株分离自脑脊髓液样本，其中9个(53％)为MS III(来自3种不同的sst/基因型，每一种都存在于不同的簇)。其余8个分离株分布于5种MS、7种基因型和4种簇。脑膜炎发生在所有年龄组，但是包括与所有其他组的5％相比晚期新生儿组为23％。
讨论GBS中荚膜的生成受荚膜多糖合成(cps)基因簇控制，在我们开始我们的研究之前，血清型Ia和血清型III的该基因簇已经测序。最近当该项目接近完成时，血清型Ib(Miyake et aL，2001提交到GenBank，GenBank登记号为AB050723)，血清型V，V，和VI(McKinnon等，2001提交到GenBank，GenBank登记号分别为AF355776，AF349539，AF337958)的相应序列已被释放，但是其他3种血清型(II，VII和VIII)的相应序列，cps基因簇序列，此前还未公开。
血清型Ia和III的cps基因簇序列在cpsD-cpsE-cpsF的3′末端和cpsG.的5′末端表现出显著的同源性。我们设计了一系列引物扩增该区域中的2226/2217bp节段，发现除VIII外的所有血清型都得到了扩增子。这证实了此前的说法，即在该区域VIII明显不同于其他血清型。
使用8种血清型(Ia～VII)的参照株，我们发现在血清型之间存在50个以上的异质性位点(图1，表4)。使用选择的已用传统方法分型后的63个临床分离株，我们发现这些血清型内的差异通常是恒定且特异性的，尤其是成簇于该区域3’末端的23个位点。我们利用这些差异确定其余本研究收集临床分离株的血清型，在不知道常规方法得到的血清型情况下。
对血清型Ia、III、Ib，IV，V和VI的cpsG-cpsH-cpsI/cpsM 3′末端进行了测序，结果表明该区域为高度可变区(图3)，因此该区域是用PCR直接鉴定血清型的合适靶标。我们设计了几对针对MS Ia，Ib，III，IV，V和VI的MS特异性引物，用它们对两CS标准组进行了测试。选择的引物对用于对我们206个临床分离株中的86.9％单独用PCRMS。使用快速循环MS特异性PCR，1个工作日内即可得到结果。将来，该方法可能会推广至所有MS，当血清型II、VII和VIII该区域中cps基因簇序列可以获得时。同时，MSII和VII也可以对cpsE-cpsF3′末端-cpsG 5′末端790bp的PCR扩增子测序来鉴定(图1，表4)。阳性GBS-特异性PCR和利用用于扩增790bp的所有引物得到的阴性PCR结果，通过排除鉴定MSVIII。
将来，在目前的一些实验室中，对所有分离株的cpsE-cpsF3′末端-cpsG 5′末端790bp PCR扩增子的测序将更为方便，因为只需要一种方法和极少数引物。但是，如果测序不能在局部进行，那么完成实验的时间就更长，而且会有一小部分血清型被错误定型(血清亚型III-3和III-4分别定为MSIa和II)。这一点可以通过首先使用MS III特异性PCR筛查来避免。对790bp PCR扩增子测序可使得根据序列异质性将MS III亚分型。
此前研究表明在美国和其他几个国家血清型Ia，Ib，II，III和V是从通常无菌部位分离的最常见的分离株。血清型VI和VIII在日本是从患者分离到的主要血清型，但是在其他地方却不常见。尽管我们的分离株是选取的，但是它们是澳大利亚引发疾病的代表性菌株；Ia，Ib，II，III，和V是最常见的鉴定到的血清型，尽管还有少数的血清型IV，VI和VIII。
13％的GBS分离株无法血清分型，在我们研究中使用现有的抗血清这一比例为8.7％(18/206)。这可能是由于型特异性抗原合成的减少；无荚膜期变异；或者cps基因簇中基因的插入或突变。我们研究中一个无法血清分型的GBS菌株在cpsG基因中T碱基缺失，这导致cpsG基因阅读框的改变。
我们还建立了以PCR为基础的方法鉴定GBS表面蛋白基因，并进一步定性这些分离株。使用公开的bac基因序列，我们对bac基因特异性引物进行了修饰，并设计了新引物，这些引物具有高的解链温度(＞70℃)适于以所有主要表面蛋白基因为靶标的快速循环PCR。
如此前报道，一个以bca基因重复单元(在bca基因的3’末端)为靶标的公开PCR引物对，并非完全特异于bca基因。我们设计了两个以bca基因5′末端为靶标的引物对，以提高特异性。但是，使用这些引物血清型Ia极少菌株得到阳性结果，而使用以bca基因重复单元为靶标的引物对所有菌株都是PCR阳性。这些结果与此前报道一致，以bca基因5′末端为靶标的探针只与血清型Ia 9株中的1株杂交，但是包括串联重复区的较长bca基因探针却与所有9株都能杂交。
特异性针对rib，alp2和alp3基因的PCR此前还无描述。我们设计的引物对主要是以该基因的5′末端为靶标，并且是与相关基因序列比较基因异质性后选择的。我们为每一基因都设计了两种或多种引物对，通过对以同一基因为靶标的PCR的结果进行比较验证引物特异性。蛋白基因谱″alp2″和″alp3″是根据alp2及alp3基因特异性PCR和/或bcaS1/balA或bcaS2/balA的扩增子中两个序列异质性位点区分的。
为了证实我们引物的特异性，我们用其对两标准组及选取的GBS分离株进行了测试。对每一基因用PCR扩增到的最大扩增子进行测序，提供最大的序列信息，确保不位于菌株的异质性位点。我们的测序结果证实了引物的特异性。每一基因的两对引物，具有近似的结果。最后，使用6个基因/区域特异性引物对(其中包括那一个以bca基因重复单元为靶标的引物对)定义了所有224个分离株的蛋白抗原基因谱。
研究表明含有重复序列的表面蛋白基因家族——rib，bca，alp2，和alp3基因——中只有1个成员能出现于任一单个分离株。但是，含有不是表面蛋白基因家族的bac基因的分离株都还含有bca基因(51/52)或rib基因(1/52)。
Bac基因出现于23％的分离株，与此前报道的比例(19-22％)近似。与其他基因一样，我们在bac基因中发现了由于可变的小的内部重复序列导致的变异。这些bac基因重复序列是无规律的(不同于bca-rib基因家族的成员)。他们的作用不清楚，但是它们是可用于流行病学研究的潜在的分子标记。
我们的数据表明一些血清型III分离株(我们的MS血清亚型III-1和III-2)与rib基因紧密相关，其他(我们的MS血清亚型III-3)则与alp2基因紧密相关。血清型Ib与bca和bac基因相关，血清型V与alp3基因相关。但是，由于这种相关不是绝对的，不同组合的cps血清型-血清亚型/蛋白基因谱鉴定出许多血清变体，它们可用于流行病学研究和偶联疫苗制剂。仅通过PCR手段，我们可根据bac基因(B)组将我们的224分离株分为31种血清变体，或者根据亚组分为51种血清变体。理论上讲，有可能存在着其他血清变体。
我们发现抗″c″和″R″蛋白抗原的抗血清并不完全特异于任一具体蛋白基因。但是，与″c″抗血清的反应通常反映有编码Cα(bca基因)和相关蛋白基因(至少包括alp2基因)的存在，与″R″抗血清的反应反映有编码Rib(rib基因)及相关蛋白基因(至少包括alp3基因及罕见的推定的rib样基因)。
我们还研究了大量可移动元件在GBS的不同血清型中的存在情况。此前已从GBS中鉴定出4种不同插入序列。一些血清型III分离株中的多拷贝IS861与荚膜基因表达升高相关。我们在血清亚型III-1和III-2所有分离株以及血清型II和Ib的大部分分离株中发现了IS861但是其他血清型和亚型中极少。所有含IS861的分离株都包含至少1种其他可移动元件。
多拷贝IS1381已经发现于大部分GBS及其他链球菌种，包括肺炎链球菌，被用作GBS流行病学研究中限制性片段长度多态性(RFLP)分析的探针(Tamura等，2000)。我们在占总数85％的分离株中发现了IS1381。它们出现于血清亚型III-1的全部分离株，但血清亚型III-2或III-3无一株出现。我们从24个分离株得到的IS1381序列相互等同，但是在几个位点上不同于此前报道的序列(AF064785)。这些差异的重要性还未可知，但是这突出了要对来自尽可能多的不同分离株的序列确证的重要性。
ISSa4首次鉴定于非溶血性GBS分离株，其中它导致基因cylB插入失活，cylB是参与溶血素生成的ABC转运蛋白的一部分。只有一小部分(主要为溶血性的)GBS分离株(4％)含有ISSa4，它们都是自1996以来分离到的，可以推断ISSa4是GBS新近获得的。我们还在一小部分(7％)临床分离株中发现了ISSa4，但是它以近似比例存在于1996年前获得的分离株(4/44)和1996年或以后的分离株(11/162)。
IS1548首次发现于一些透明质酸酶阴性的GBS血清型III分离株，其中它导致基因hylB(负责生成透明质酸酶的基因簇的一个成员，透明质酸酶是一种重要的GBS毒力因子)失活(Granlund等，1998)。在含有它的分离株中，C5a肽酶基因(也与毒力相关)的下游还发现了一个拷贝的IS 1548。含IS 1548的分离株中大多数分离自心内膜炎患者，因此可推断透明质酸酶产生的失活与和/或对C5a肽酶的一些影响可使得GBS分离株能吸附并存活于心血管上。
我们发现在血清亚型III-1的所有分离株中都发现了IS1548，III-1分离株占到了我们从表面(8/12)和正常无菌(22/46)样本中收集的58个血清型III分离株中的52％。后者来自新生儿(7/20)、成人(3/6)和年龄段不明患者(12/20)(数据未显示)。尽管未得到专门的临床数据，但是GBS心内膜炎是不常见的，可能存在于这些患者中的极少数，如果有的话。需要进一步研究来阐明插入序列与特定毒力因子及临床症状之间的相关性。
我们在我们的全部224个分离株中的19％分离株中发现了GBSi1，GBSi1是一种II组内含子；通常它与IS861相关，分布在各血清型/血清亚型之间有变化。它极少见于除II和III外的血清型中。它出现于血清型II中50％以上分离株，其中4株还含有IS1548。它发现于所有血清亚型III-2和III-4分离株，其中未发现IS1548，但是没有发现于任何一株含IS1548的血清亚型III-1分离株或者任何一株不含IS1548的血清亚型III-3分离株。
我们根据cps基因簇内的差异将GBS血清型III进一步分为4种血清亚型，这一点得到了本研究所述的表面蛋白基因谱中相应差异及5种可移动元件分布情况的支持。尽管我们没有对分离株透明质酸酶活性进行测试，但是我们的表达Rib蛋白且含有IS1548，IS861和IS1381的血清亚型III-1可能与Bohnsack等，2001中的透明质酸酶阴性亚型III-2相对应。我们的血清亚型III-2还表达Rib蛋白且含有IS861和GBSi1，可能与Bohnsack等，2001中的血清型III-3的相对应。血清亚型III-3和III-4只有相对少的分离株。前者(与一些血清型Ia分离株一样)表达Cα-样蛋白2且不含任何可移动元件(一个另外的不寻常发现)。后者与血清型II密切相关，二者在部分cps基因簇及各种表面蛋白谱和可移动元件上同源。
总结我们目标是建立了一种针对B组链球菌(GBS)的全面的基因分型系统。理想中，与其他分型方法相比，所述系统应该是可重复的，客观的且可在实验室间转移的，且与其他分型方法互补，并能引入已知的毒力标记。根据这些标准，我们首先建立了一种根据cps基因簇的分子分型(MS)方法。该方法便与传统方法(CS)比较，但是更敏感，使得我们能够鉴定出血清型(sst)III的几种亚型，如其他人所述。我们还根据编码可变表面蛋白抗原的基因家族(bca/rib/alp2/alp3/alp4)建立了第二种分子亚分型方法，IgA结合蛋白Cβ(bac)，比传统蛋白分型更敏感更客观，传统蛋白分型不能将分离株全部分型，且有时会误导。我们的方法还能鉴定出可变抗原基因家族的更多成员，且能区分大量的bac亚组。第三种亚分型方法使用5种可移动遗传元件(mge)，包括4种不同插入序列(IS)及一种II型内含子，这些可移动遗传元件已在GBS中被鉴定到。这第三种方法的应用进一步提高了我们基因分型系统的区分能力。
然后，我们使用我们的分型系统对194个侵袭性GBS分离株的群遗传结构和年龄相关疾病分布进行了测定。
我们主要使用侵袭性GBS分离株显示我们基因分型系统的实际价值，证实理论上的群结构，测定不同患者群的基因型分布。分离株源自GBS脓毒症所有年龄段的患者。其中约半数是来自血液或CSF的连续性的GBS分离株，这些血液或CSF取自设有产科的全科成人医院的大型诊断实验室(即，没有一个分离株是来自除新生儿外的儿童)。其余为来自新西兰全境用于血清分型的连续分离株。因此，全部年龄段的分布说明GBS疾病能感染除儿童外的人群，早期新生儿以上的儿童可能不具有代表性。但是，每一年龄组内基因型的分布应该是有代表性的。
在我们的194个澳大利亚侵袭性GBS分离株中，我们鉴定出56种基因型，其中5种(Ia-1，Ib-1，III-1，III-2和V-1)占到了全部分离株的62％。
我们试验结果制备的系统发育树显示了cps血清型与蛋白基因谱(pgp)间的相关性。我们的结果还表明某些已知的毒力标记——Cβ，Cα变体以及透明质酸酶的生成(间接)——与独特的克隆代系相关。
我们的基因分型系统，根据3套遗传标记，是高分辨力的。因为它提供了有用的表型数据，包括抗原性组合物，可用于GBS的流行病学调查，尤其是与潜在的GBS疫苗用途相关。高毒力基因型与患者特征(年龄和/或潜在危险因素)间的推定关系，CSF分离株(或基因型)与其他侵袭性或定居性菌株之间是否存在着显著差异，这些研究都会因我们的基因分型系统而被推进。使用本系统，我们阐明了存在于侵袭性澳大利亚GBS分离株中克隆群体结构。本系统可用于克隆GBS分离株，鉴定毒力标记。
因此，我们已经建立一种GBS传统血清学分型方法的替代方法，该方法精确且可重复性强，任一能够开展PCR/CEXUDE实验室均可实施，而且更重要的是，该方法无需日益难以保持的成套的血清型特异性抗血清。所有分离株都可以血清分型，并且对相对有限的790bp区域的测序可以为MSIII亚分型提供额外的信息。我们描述的用于血清型鉴定的分子非法，与蛋白谱(或者蛋白抗原亚分型)及可移动遗传元件的鉴定(或可移动遗传元件亚分型)为进一步研究GBS系统发育及流行病学以及菌株的全面鉴定提供了提供了潜在的有用标记，菌株的全面鉴定可用于流行病学以及在GBS偶联疫苗引入前后均需对GBS分离株分离株进行检测的其他相关研究。
本发明单个章节中提到的各种特征及实施方案如果合适也可作必要变动后应用与其他章节。因此某一章节中详细阐明的特征可与其他章节中详细阐述的特征结合，如果合适。
本申请说明书中提到的所有公开出版物在此引入作为参考。对本发明所述方法及系统进行各种修饰及变动而不脱离本发明的范围和实质，对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管本发明是结合具体优选的实施方案描述的，但是应该理解的是所请求的本发明不应该不合理地限制到这些具体实施方案。实际上，对所述实施本发明模式进行各种对于分子生物学及相关领域技术人员来说显而易见的改动是在下列权利要求的范围之内的。
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表1 该研究中使用的GBS参照组Lab菌株编号 来源血清型 MS/血清亚型 GenBank登记号参照组11090ChanningIa IaAF332893H36B ChanningIb IbAF33290318RS21 ChanningII IIAF332905M781 ChanningIIIIII-23AF3328963139 ChanningIV IVAF332908CJB 111ChanningV V AF332910SS1214 ChanningVI VIAF3329017271 ChanningVIIVII AF332913JM9 130013 ChanningVIII VIII参照组22NZRM908ESR Ia IaAF332894(NCDC SS615)NZRM 909 ESR Ib IbAF332904(NCDC SS618)NZRM 910 ESR Ic IaAF332914(NCDC SS700)NZRM 911 ESR II IIAF332906(NCDC SS619)NZRM 912 ESR IIIIII-33AF332897(NCDC SS620)NZRM 2217 ESR 无法分型 IIAF332907(Prague 25/60)(R)NZRM 2832 ESR IV IVAF332909(Prague 1/82)NZRM 2833 ESR V V AF332911(Prague 10/84)NZRM 2834 ESR VI VIAF332902(Prague 118754)
注1.参照组1由Channing Iaboratory，Boston，USA的Lawrence Paoletti博士提供。
2.参照组2由ESR.Porirua，Wellington，New Zealand提供的New ZealandReference Mdeical Culture Collection的菌株。
3.根据序列异质性的MS III血清亚型；更详细内容参见文章。
表2 本研究使用的寡核苷酸引物引物 靶基因 Tm℃1GenBank登记号 序列2-4CFBS cfb 56.7 X72754 328GAT GTA TCT ATC TGG AAC TCT AGT G352Sag595cfb 77.4 X72754 350GTGGCTGGTGCATTGTTATTTT CAC CAG CTG TATTAG AAG TA391Sag1905cfb 76.8 X72754 545CATTAACCGGTTTTTCATAATCTGTT CCC TGA ACATTA TCT TTG AT500CFBA cfb 63.2 X72754 568TTT TTC CAC GCT AGT AAT AGC CTC54516SS 16S rRNA 69.3 AB023574 1441GCC GCC TAA GGT GGG ATA GAT G146223SA 23S rRNA 65.7 X68427 70CGT CGT TTG TCA CGT CCT TC51DSF2616S rRNA 75.9 AB023574 975CATCCTTCTGACCGGC CTA GAG ATA GGC TTTCT1007DSR1616S rRNA 81.5 AB023574 1250CGTCACCGGCTT GCG ACT CGT TGT ACCAA1222cpsDS cpsD 69.1 AB028896(Ia)， 4892/4593GCA AAA GAA CAG ATG GAA CAA AGTAF163833(III)GG5007/4618cpsES cpsE 65.7 AB028896(Ia)， 5300/4910CTT TTG GAG TCG TGG CTA TCTAF163833(III)TG5322/4932cpsEA1 cpsE 65.4 AB028896(Ia)， 5431/5041 GA/T/GA AAA AAG GAA AGT CGT GTC G/ATTAF163833(III)G5612/5017
cpsES1cpsE 65.9 AB028896(Ia)，5612/5222CTT GGA C/TTC CTC TGA AAA GGAAF163833(III)TTG5635/5245cpsEA2cpsE 66.8 AB028896(Ia)，5723/5333AAA A/CGC TTG ATC AAC AGT TAA GCAAF163833(III) GG5698/5308cpsES2cpsE 70.2 AB028896(Ia)，6012/5622GAT GGT/C GGA CCG GCT ATC TTT TCTAF163833(III) C6036/5646cpsEA3cpsE 63.7 AB028896(Ia)，6116/5726CTT AAT TTG TTC TGC ATC TAC TCGAF163833(III) C6092/5702cpsES3cpsE 71.5 AB028896(Ia)，6410/6020GTT AGA TGT TCA ATA TAT CAA TGA ATGAF163833(III) GTC TAT TTG GTC AG6450/6060cpsEFAcpsE/F62.1 AB028896(Ia)，6526/6136CCT TTC AAA CCT TAC CTT TAC TTAspacer AF163833(III) GC6501/6111cpsFS cpsF 75.0 AB028896(Ia)，6777/6387CAT CTG GTG CCG CTG TAG CAG TAC CATAF163833(III) T6804/6414cpsFA cpsF 73.2 AB028896(Ia)，6859/6469GTC GAA AAC CTC TAT A/GT A AAC/T GGTAF163833(III) CTT ACA A/GCC AAA TAA CTT ACC6819/6425cpsGA cpsG 54.7 AB028896(Ia)，7162/6772AAG/C AGT TCA TAT CAT CAT ATG AGA GAF163833(III) 7138/6748cpsGA1cpsG 74.5 AB028896(Ia)，7199/6809CCG CCA/G TGT GTG ATA ACA ATC TCA GCTAF163833(III) TC7171/6781cpsGS cpsG 72.24 AB028896(Ia)，7145/6755ATG ATG ATA TGA ACT CTT ACA TGA AAGAF163833(III) AAG CTG AGA TTG 7183/6793cpsGS1cpsG 71.62 AB028896(Ia)，7155/6765GAA CTC TTA CAT GAA AGA AGC TGA GATAF163833(III) TGT TAT CAC AC 7192/6802
IacpsHS cpsH73.6AB028896(Ia)7698CAT TCT TTG TTT AAA AA/CT CCT GAT TTT GATAGA ATT TTA GCA GC7741IacpsHA cpsH75.2AB028896(Ia)7993GAA TAT TCA AAA AAT CCC ATT GCT CTT TGAGTA TGC ATA CC7953IacpsHA1cpsH66.4AB028896(Ia)8271GTA AGT TAT CAA AAT ATA ACA TCA TTA CTATTA CTA GTA GAA ACG G8226IacpsHS1cpsH77.9AB028896(Ia)8463GGC CTG CTG GGA TTA ATG AAT ATA GTT CCAGGT TTG C8499IacpsHA2cpsH58.5AB028896(Ia)8499GCA AAC CTG GAA CTA TAT TCA T8478IbcpsHS0cpsH58.6AB050723(Ib)3013ATT GCT GCA TTC AAT TCA C3031IbcpsHS cpsH81.9AB050723(Ib)3016GCT GCA TTC AAT TCA CTG GCA GTA GGG GTTGTG TCC3051IbcpsHA cpsH67.7AB050723(Ib)3297GAT AGT TAA GGG TAT TAT AAG ATT TGA ATATTC AAA GAA AGC3256IbcpsHS1cpsH74.1AB050723(Ib)3546TTT GGT GAG CAT ATA TAA TAG AAT AAT CAATTT GCG GTC G3585IbcpsHS2cpsH73.7AB050723(Ib)3740CTG GCC TAT TTG GAC TAA TAA ATG TGA TTTTAG GTT TGT TTC3781IbcpsHA01 cpsH57.7AB050723(Ib)3781GAA ACA AAC CTA AAA TCA CAT TTA3758
IbcpsHA1cpsH78.5AB050723(Ib) 3894GGC GCC ATC AAT ATC TTC AAG TGC AAA AAATGA AAA TAG G3855IbcpsIA cpsI78.2AB050723(Ib) 4086CTA TCA ATG AAT GAG TCT GTT GTA GGA CGGATT GCA CG4049IbcpsIS cpsI71.1AB050723(Ib) 4116GAT AAT AGT GGA GAA ATT TGT GAT AAT TTATCT CAA AAA GAC G4158IbcpsIA1cpsI78.6AB050723(Ib) 4638CCT GAT TCA TTG CAG AAG TCT TTA CGA TGCGAT AGG TG4601IIIVIcpsHS cpsH75.3AF163833(III)，7275/7120CAA GAG GAT ATA ACG TTT CAG CGA TTTAF337958(VI) ATT GCT GAG C7311/7156IIIcpsHScpsH72.1AF163833(III) 7672GAA TAC TAT TGG TCT GTA TGT TGG TTT TATTAG CAT CGC7710IIIcpsHAcpsH71.0AF163833(III) 7817GTT ATA AGA AAA ACA AGC GGT GAT AAA TAAGAA AGT CAT ACC7776IVcpsHS cpsH74.1AF355776(IV) 7552CCG TAC ATA CAA CTG TTC TTG TTA GCA TTTACT TTT CTT TGC7593IVcpsHS1cpsH71.2AF355776(IV) 7887CCC AAG TAT AGT TAT GAA TAT TAG TTG GATGGT TTT TGG7925IVcpsHA cpsH77.3AF355776(IV) 7951 CAT CTA CAC CCC CAC AAA ATA TTT TCC CAAAAA CCA TC7914IVcpsHA1cpsH58.7AF355776(IV) 7958TGT AAA TCA TCT ACA CCC CC 7939
IVcpsMA cpsM80.7AF355776(IV)8265GGG TCA ATT GTA TCG TCG CTG TCA ACA AAACCA ATC AAA TC8225VcpsHS cpsH76.3AF349539(V) 6943GGG TTT AGG CGA GGG AAA CTC AGC TTA CAAAAT AGT G6979VcpsHS1 cpsH72.2AF349539(V) 7258CAA TTT TTA TAG GGA TGG ACA ATT TAT TCTGAG AAG TGA C7297VcpsHA cpsH71.1AF349539(V) 7291TCT CAG AAT AAA TTG TCC ATC CCT ATA AAAATT GAC ATA C7252VcpsHS02cpsH59.0AF349539(V) 7616GAT GTT CTT TTA ACA GGT AGA TTA CAC7642VcpsHA1 cpsH66.8AF349539(V) 7658GTT GTA AAT GAG CAT AGT GTA ATC TAC CTGTTA AAA GAA C7619VcpsHS2 cpsH74.0AF349539(V) 7871CCC AGT GTG GTA ATG AAT ATT AGT TGG CTAGTT TTT GG7908VcpsHA2 cpsH58.6AF349539(V) 7945CTT TTT TAT AGG TTC GAT ACC ATC7922VcpsMA cpsM73.1AF349539(V) 8244CCC CCC ATA AGT ATA AAT AAT ATC CAA TCTTGC ATA GTC AG8204VIcpsHS cpsH76.7AF337958(VI)7478CAC TAT TCC TAG TTT TTT GTG CAT ATT TGACAG GGG CAA G7517VIcpsHA cpsH76.7AF337958(VI)7517CTT GCC CCT GTC AAA TAT GCA CAA AAA ACTAGG AAT AGT G7478
VIcpsHS1cpsH 77.2AF337958(VI) 7767CCT TAT TGG GCA AGG TAT AAG AGT TCC CTCCAG TGT G7803VIcpsHA1cpsH 77.2AF337958(VI) 7804CCA CAC TGG AGG GAA CTC TTA TAC CTT GCCCAA TAA G7768VIcpsIA cpsI 74.5AF337958(VI) 8126GAA GCA AAG ATT CTA CAC AGT TCT CAA TCACTA ACT CCG8088cpsIA cpsI 70.3AB028896(Ia)，8816/8312GTA TAA CTT CTA TCA ATG GAT GAG TCTAF163833(III) GTT GTA GTA CGG8778/8274注1.引物的Tm值是由引物合成者(sigma-Aldrich)提供的。
2.数字代表着引物序列起始和终止的碱基位置的编号(编号起始点“1”代表相应基因GenBank登记号的起始点“1”。
3.下划线序列标出的是对此前公开引物修饰而添加的碱基。
4.“/”后面的字母表示在不同血清型替换的核苷酸。
5.Ke et al.，2000.
6.Ahmet et al.，1999.
表3 使用不同寡核苷酸引物对得到扩增子的特异性和预期长度引物对 特异性 扩增子的长度(碱基对)Sag59/Sag190aGBS(无乳链球菌) 196CFBS/CFBA GBS(无乳链球菌) 24116SS/23SA GBS(无乳链球菌) 433DSF2/DSR1aGBS(无乳链球菌) 276cpsDS/cpsEA1血清型Ia to VII 449/458cpsES/cpsEA2血清型Ia to VII 424cpsES1/cpsEA3 血清型Ia to VII 505cpsES2/cpsEFA 血清型Ia to VII 515cpsES3/cpsFAb血清型Ia to VII 450cpsFS/cpsGA1b血清型Ia to VII 423cpsES3/cpsGA1b血清型Ia to VII 790cpsGS/cpsIA 血清型Ia and III 1672/1558cpsGS1/cpsIA血清型Ia and III 1662/1548cpsGS/IacpsHA1 血清型Ia 1127cpsGS1/IacpsHA1 血清型Ia 1117IacpsHS/IacpsHA 血清型Ia 296IacpsHS/IacpsHA1血清型Ia 574IacpsHS1/cpsIAc血清型Ia 354cpsGS/IbcpsHA1 血清型Ib 1468cpsGS1/IbcpsHA1 血清型Ib 1458cpsGS/IbcpsIA 血清型Ib 1660cpsGS1/IbcpsIA 血清型Ib 1650IbcpsHS/IbcpsHA 血清型Ib 282IbcpsHS1/IbcpsHA1 血清型Ib 349IbcpsHS2/IbcpsIA血清型Ib 347IbcpsIS/IbcpsIA1c血清型Ib 523cpsGS/IIIcpsHA 血清型III 1063cpsGS1/IIIcpsHA 血清型III 1053IIIVIcpsHS/IIIcpsHA 血清型III 543IIIcpsHS/cpsIAc血清型III 641cpsGS/IVcpsHA 血清型IV 1372cpsGS1/IVcpsHA 血清型IV 1362cpsGS/IVcpsMA 血清型IV 1686
cpsGS1/IVcpsMA 血清型IV 1676IVcpsHS/IVcpsHA血清型IV 400IVcpsHS1/IVcpsMAc血清型IV 379cpsGS/VcpsHA1 血清型V 1096cpsGS1/VcpsHA1 血清型V 1086cpsGS/VcpsMA 血清型V 1682CpsGS1/VcpsMA 血清型V 1672VcpsHS/VcpsHA 血清型V 349VcpsHS1/VcpsHA1血清型V 401VcpsHS2/VcpsMAc血清型V 374IIIVIcpsHS1/VIcpsHA血清型VI 398cpsGS/VIcpsHA1 血清型VI 1205cpsGS1/VIcpsHA1血清型VI 1195cpsGS/VIcpsIA 血清型VI 1527cpsGS1/VIcpsIA 血清型VI 1517VIcpsHS/VIcpsHA1c血清型VI 327VIcpsHS1/VIcpsIA 血清型VI 360注*引物序列参见表2，引物位点参见图1分子血清型鉴定算法中使用的引物-图2a.鉴定GBS，b.测序，c.MS-特异性PCR
表4 8个GBS血清型在cpsD-cpsF-3’末端和cpsG5’末端区域中的异质性位点 Ia Ib II/III-4III IVV VIVII特异性cpsD基因62 G A G4A A A A G Ia，III VII78-86 -Ia-21； - -II-22，4； -III-23； + + - + 见文中重复序列 +Ia-11+II-12+III-13，-TTACGGCGA III-33cpsD/cpsE基因间隔区spacer138G G G G G A5G G V139G G G A III-2； G G G G III-2G III-1，III-3144T T T G III-2； T T T T III-2T III-1，III-3cpsE基因198A C A4A C C5A A Ib，IV，V204G G G A III-2，III-3； G G G G III-2，III-3G III-1211T T T T T T G T VI218C C C C C C T C VI240T T T T T T C T VI
249TCT4T CC5TTIb，IV，V300CCC T III-2； CCCCIII-2C III-1，III-3321CCC T III-1； CCCCIII-1C III-2，III-3419TCT4T TTTTIb429ATA4T TTTAIa，II，VII437CCC；C CCCTVII，III-4T III-4457TAC4A AAACIa，II，VII466GGG G AGGAIV486GAA G III-3； AAAAIa，III-3A III-2，III-1602GGA4G GGGAII，VII606TTT T TTCTVI627TCC C CCCCIa636CTT C III-1； TTTTIa，III-1T III-2，III-3645CTC4C TTCCIb，IV，V803AAA A AATAVI971CTT C CCTTIa，III，IV，V1026 AGG G III-2，III-1； AAGGIa，III-3，IV，VA III-31044 TTT T TTCTVI
1173AGAA AAAAIb1194CCCA ACACIII，IV，VI1251GGGG GGAGVI1278AAAA AGAAV1413CTTC III-3； TTTTIa，III-3T III-2，III-11495CCCC CCACVI1500AGAA AAAAIb1501CCTC CCCTII，VII1512CTCT III-2，III-1；CTTCIa，II，III-3，IV，VIIC III-31518TCTC III-2，III-1；TCCTIa，II，III-3，IV，VIIT III-31527TAAT III-3； TAAAIa，III-3，IVA III-2，III-1cpsF基因1595TCTT TTCTIb，VI1611CCCC CCCTVII1620CCCC CCCTVII1627GGGG TGGGIV1629GGGA III-1； GGGGIII-1G III-2，III-31655CTCC CCCCIb1832CCCC TCCCIV
1856TCTT TTTTIb1866GGGG GGGAVII1871TTTT TCTTV1892AAAA AGAAV1971GGGG GGAGVIcpsG基因2026GAGG GGGGIb2088GGGG AGGGIV2134TTTC III-2，III-1；TTTTIII-2，III-1T III-32187CCCC CCCGVII2196AAAA AAAGVII注解1.重复序列血清亚型Ia-1存在(+)；血清亚型Ia-2缺乏(-)(参见文中)。
2.重复序列血清亚型II-1存在(+)；血清亚型II-2缺乏(-)(参见文中)。
3.重复序列血清亚型III-1和III-3存在(+)；血清亚型III-2缺乏(-)；血清亚型III-4可变(-)(参见文中)。
4.一个CSII株在9个位点处有突变(参见文中)。
5.在第138、198和249位，一个CSV参照株(Prague 10/84)与GenBank中相应序列相同(GenBank登记号AF349539)，序列分别为G，A和T；另一个参照株与其他所有测序的CSV株相同，序列分别为A，C和C。
表5 比较206个临床GBS分离株的传统血清学分型(CS)和分子血清型鉴定(MS)亚分型结果比较MS/血清亚型CS Ia Ib II III-11III-21III-31III-41IVVVIVIIIIa 38Ib 30II 25III 27 20 4 3IV 7V31VI2VIII1NT12513 1 51总数(206)240 35 26230 2124 3 736 3 1注1.MSIII血清亚型详细内容参见文中。
2.一种包括两种独立分离株(一种为血清型II，一种为亚型III-2)的混合培养物。
表6 本研究中使用的寡核苷酸引物引物靶序列Tm℃1GenBank登记号序列2，3IgAagGBS5 bac 73.8X59771 2663GCGATTAAACAACAA ACT ATT TTT GAT A TTGACA ATG CAA2702IgAS14bac 72.8X59771 2765GCT AAA TTT CAA AAA GGT CTA GAG ACA AATACG CCA G2801IgAA14bac 78.9X59771 3157CCC ATC TGG TAA CTT CGG TGC ATC TGG AAGC3127RigAagGBS5bac 76.3X59771 3284CAGCCAACTCTTTCGTC GTT ACT TCC TTG AGATGTAAC3247GBS1360S6bac 72.3X59771 1325GTGAAATTGTATAAG GCT ATG AGT GAG AGC TTGGAG1360GBS1717S4bac 75.0X59771 1685ACA GTC ACA GCT AAA AGT GAT TCG AAG ACGACG1717GBS1937A6bac 75.9X59771 1976CCGTTTTAGAATCTTTCTG CTC TGG TGT TTT AGGAAC TTG1937BcaRUS7bca 73.5M97256 769GATAAATATGATCCAACAG GAG GGG AAA CAA CAGTAC805BcaRUA7bca重复单元 77.2M97256 1003CTGGTTTTGGTGTCACATGAA CCG TTA CTT CTACTG TAT CC963
bcaS14bca/alp2/alp371.7M97256和208/533GGT AAT CTT AAT ATT TTT GAA GAG TCA ATAAF291065GTT GCT GCA TCT AC251/576bcaS24bca/alp2/alp378.0M97256和256/581CCAGGGA GTG CAG CGA CCT TAA ATA CAAAF291065GCA TC288/613bcaS4bca 58.9M97256 370GTT TTA GAA CAA GGT TTT ACA GC392balS4alp2/alp373.8AF291065677GAT CCT CAA AAC CTC ATT GTA TTA AAT CCA TCAAGC TAT TC717bcaA4bca 74.2M97256 597CGTTCTAACTT CTT CAA TCT TAT CCC TCA AGGTTG TTG560balA4alp2/alp373.6AF291065978CCA GTT AAG ACT TCA TCA CGA CTC CCA TCAC948bal23S14alp2/alp370.9AF208158和 1093/1373CAG ACT GTT AAA GTG GAT GAA GAT ATTAF291065ACC TTT ACG G1129/1409bal23S24alp2/alp372.9AF208158和 1174/1454CTT AAA GCT AAG TAT GAA AAT GAT ATCAF291065ATT GGA GCT CGT G1213/1493bal2S4alp2 59.2AF2081581363GTT CTT CCG CCA GAT AAA ATT AAG1386bal2A4alp2 58.3AF2081581576CTG TTG ACT TAT CTG GAT AGG TC1554bal2A14alp2 78.3AF2081581426CGT GTT GTT CAA CAG TCC TAT GCT TAG CCTCTG GTG1391bal2A24alp2 70.8AF2081581518GGT ATC TGG TTT ATG ACC ATT TTT CCA GTT ATACG1484
bal3S4alp357.1AF2910651643GTT CTT CCG CTT AAG GAT AGC A1664bal3A4alp379.2AF2910651693GAC CGT TTG GTC CTT ACC TTT TGG TTC GTTGCT ATC C1657#ribS14rib 65.2U58333 216TAC AGA TAC TGT GTT TGC AGC TGA AG241ribS24rib 73.0U58333 238GAAGTAATTTCAG GAA GTG CTG TTA CGT TAA ACACAA ATA TG279ribA14rib 78.8U58333 431GAA GGT TGT GTG AAA TAA TTG CCG CCT TGCCTA ATG396ribA24rib 72.6U58333 462AAT ACT AGC TGC ACC AAC AGT AGT CAA TTC AGAAGG427#ribA34rib 61.3U58333 570CAT CTA TTT TAT CTC TCA AAG CTG AAG554注#只用于测序，不完全特异于rid基因。
1.引物Tm值由引物合成者(Sigma-Aldrich)提供。
2.数字代表引物序列起始和终止的碱基位置的编号(编号起始点“1”代表相应基因GenBank等记号的起始点“1”)。
3.下划线序列标出的是对此前公开引物修饰而添加的碱基。
4.我们设计用于研究的引物。
5.Mawn et al.，1993.
6.Maeland et al.，1997.
7.Maeland et al.，2000.
表7 使用不同引物对得到扩增子的特异性和预期长度引物对* 特异性 扩增子长度 蛋白谱代号(碱基对)IgAagGBS/ bac532-838BRIgAagGBSIgAS1/IgAA1 bac303-591BGBS1360S/ bac652BGBS1937AGBS1717S/ bac292BGBS1937AbcaS1/bcaA bca的5′末端 390AbcaS2/bcaA bca的5′末端 342ABcaRUS/bcaRUA bca重复单元/ 235a/asbca重复单元样区域bcaS1/balA alp2/alp3 446alp2或alp3bcaS2/balA alp2/alp3 398alp2或alp3balS/balA alp2/alp3 302alp2或alp3bal23S1/bal2A1 alp2 334alp2bal23S2/bal2A1 alp2 253alp2bal23S1/bal2A2 alp2 426alp2bal23S2/bal2A2 alp2 345alp2bal23S1/bal3A alp3 321alp3bal23S2/bal3A alp3 240alp3#ribS1/ribA3rib/rib-样 355R/rribS2/ribA1 rib194RribS2/ribA2 rib225RribS2/ribA3 rib333R注*引物序列参见表6#只用于测序，不完全特异于rib基因(更详细内容参见文中)
表8 根据扩增子长度(使用引物IgAagGBS/RIgAagGBS)和序列异质性而定的基因的组和基因亚组组或亚组N＝扩增子长度 GenBank 与(c.f.)主要组分子血清型登记号相比不同位点的编号 /血清亚型B1 19532 X5847017＝Ib；2＝IIB1a 1 532 AF362686 1(c.f.B1) IbB2 3 550 AF362687 Ib，II，III-4B3 2 586 AF362688 2＝IbB3a 1 586 AF362689 4(c.f.B3) VB3b 1 586 AF362690 21(c.f.B3) VIB3c 1 586 AF362691 24(c.f.B3) IbB4 8 604 AF362692 4＝Ib；4＝IIB4a 1 604 AF362693 1(c.f.B4) IIB4b 2 604 AF362694 2(c.f.B4) 2＝IbB5 2 622 AF362695 Ia，VIB5a 1 622 AF362696 2(c.f.B5) IaB6 1 640 AF362697 IbB7 1 658 AF362698 IbB7a 1 658 AF362699 34(c.f.B7) VIB8 1 712 AF362700 IbB9 2 748 AF362701 2＝IIB9a 1 748 AF362702 13(c.f.B9) IbB10 2 820 AF362703 2＝IbB11 1 838 AF362704 Ib注*血清型/血清亚型与蛋白抗原间相互关系的详细内容见表9。
表9 GBS蛋白基因谱与荚膜多糖(cps)分子血清型/血清亚型间的相互关系血清型/N＝无 Aa AaBRalpa as alp2as RBR血清亚型 3 a*Ia 43 - - 2 - - 353 3 - -Ib 37 - 1 35- 1 - - - - -II 29 - 3 108 2 5 - - - 1III-130 - - - 30- - - - - -III-222 - - - 22- - - - - -III-35 - - - - - - - 5 - -III-43 - - 1 - 1 - - 1 - -IV 9 - - - 1 - 8 - - - -V38 1 - - 1 35- - - 1 -VI 5 - 1 3 - - 1 - - - -VII 1 - - - - 1 - - - - -VIII 2 1 - - - 1 - - - - -总数 2242 5 516241493 9 1 1注解*cps血清亚型的说明见文中，蛋白抗原基因谱代号见表7。
表10 本研究使用的寡核苷酸引物引物靶 Tm℃1GenBank 序列2登记号IS861S IS861 77.4M22449 445GAG AAA ACA AGA GGGAGA CCG AGT AAA ATG GGACG479IS861A1 IS861 77.3M22449 831CAC GAT TTC GCA GTTCTA AAT AAA TCC GAC GATAGC C795IS861A2 IS861 76.1M22449 1020CAA ACT CCG TCA CATCGG TAT AGC ACT TCT CATAGG985IS1548S IS1548 76.5Y14270 143CTA TTG ATG ATT GCGCAG TTG AAT TGG ATA GTCGTC178IS1548S1IS1548 77.0Y14270 539GTT TGG GAC AGG TAGCGG TTG AGG AGA AAA GTAATG574IS1548A1IS1548 77.0Y14270 574CAT TAC TTT TCT CCTCAA CCG CTA CCT GTC CCAAAC539IS1548A2IS1548 70.3Y14270 915CCC AAT ACC ACG TAACTT ATG CCA TTT G888IS1548A3IS1548 78.0Y14270 930CGT GTT ACG AGT CATCCC AAT ACC ACG TAA CTTATG CC893IS1381S1IS1381 80.1AF064785/ 272/818CTT ATG AAC AAAAF367974 TTG CGG CTG ATT TTG GCATTC ACG307/853IS1381S2IS1381 81.7AF064785/ 497/1040GGC TCA GGC GATAF367974 TGT CAC AAG CCA AGGGAG526/1069
IS1381AIS1381 73.1AF064785/ 881/1424CTA AAA TCC TAGAF367974TTC ACG GTT GAT CAT TCCAGC849/1392ISSa4S ISSa4 78.5AF165983326CGT ATC TGT CAC TTATTT CCC TGC GGG TGT CTCC359ISSa4A1ISSa4 75.2AF165983639GCC GAT GTC ACA ACATAG TTC AGG ATA TAG CCAG606ISSa4A2ISSa4 74.5AF165983780CGT AAA GGA GTC CAAAGA TGA TAG CCT TTT TGAACC745GBSi1S1GBSi1 78.6AJ292930721CAT CTC GGA ACA ATATGC TCG AAG CTT ACA AGCAAG TG758GBSi1S2GBSi1 77.3AJ292930789GGG GTC ACT ATC GAGCAG ATG GAT GAC TAT CTTCAC824GBSi1A1GBSi1 83.9AJ2929301058AAT GGC TGT TTC GCAGGA GCG ATT GGG TCT GAACC1024GBSi1A2GBSi1 80.5AJ2929301161CCA GGG ACA TCA ATCTGT CTT GCG GAA CAG TATCG1127注1.引物Tm值由引物合成者(Sigma-Aldrich)提供。
2.数字代表引物起始和终止碱基位置的编号(编号“1”的起始位点代表相应基因GenBank登记号的起始位点“1”)。
表11 使用不同寡核苷酸引物对得到扩增子的特异性和预期长度引物对*特异性 扩增子长度(碱基对)IS861S/IS861A1 IS861 387IS861S/IS861A2 IS861 576IS1548S/IS1548A1 IS1548 432IS1548S/IS1548A2 IS1548 773IS1548S/IS1548A3 IS1548 788IS1548S1/IS1548A2IS1548 377IS154BS1/IS1548A3IS1548 392IS1381S1/IS1381A IS1381 610/607#IS1381S2/IS1381A IS1381 385ISSa4S/ISSa4A1 ISSa4 314ISSa4S/ISSa4A2 ISSa4 455GBSi1S1/GBSi1A1 GBSi1 338GBSi1S1/GBSi1A2 GBSi1 441GBSi1S2/GBSi1A1 GBSi1 270GBSi1S2/GBSi1A2 GBSi1 373注*引物序列见表10。
#我们的测序结果(GenBank登记号AF367974)比此前Tamura et al 2000中描述的序列(GenBank登记号AF064785)短3个bp。
表12 可移动遗传元件与荚膜多糖血清型，血清型III亚型及表面蛋白基因谱之间的相互关系血清型/蛋白基因谱 N＝ IS861 IS1548 IS1381 ISSa GBSi1 无任何可血清亚型 4移动元件Ia AaB 2 2 - 2 - - -Ia alp2as3 - - - - - 3Ia a 35 3 1 35 1 - -Ia as3 - - 3 - - -小计 43 5 1 40 1 - 3Ib Aa1 - - - - - 1Ib AaB 35 30 - 35 1 - -Ib alp3 1 - - 1 - - -小计 37 30 - 36 1 - 1II Aa3 3 1 3 2 1 -II AaB 10 10 5 10 5 1 -II alp3 2 1 1 2 - - -II R 8 8 - 8 - 8 -II Ra1 1 - - - 1 -II a 5 2 2 5 3 5 -小计 29 25 9 28 10 16 -III-1 R 30 30 30 30 1 - -III-2 R 22 22 - - - 22 -III-3 alp2as5 - - - - - 5III-4 AaB 1 1 - 1 - 1 -III-4 alp2as1 - - - - 1 -III-4 alp3 1 - - 1 1 -小计 60 53 30 32 1 25 5IV R 1 1 - 1 - 1 -IV a 8 2 - 8 - - -小计 9 3 - 9 - 1 -V alp3 35 3 1 35 1 1 -V R 1 1 - 1 1 - -V RB1 1 - 1 - - -V 无1 - - - - - 1小计 38 5 1 37 1 1 2
VI Aa 1 - - 1 - - -AaB 3 3 - 3 - - -a 1 - - 1 - - -小计 5 3 - 5 - - -VII alp31 - - 1 - - -VIII alp31 - - 1 - - -无 1 - - 1 - - -小计 2 - - 2 - - -总数 22412441(18) 19015(7) 43(19) 10(4)(55) (85)注Abca基因的5′末端(Cα蛋白)abca基因重复单元或bca基因重复单元样序列(多个条带扩增子)。
asbca基因重复单元或bca基因重复单元样序列(单一条带扩增子)。
BCβ/IgA结合蛋白(bca)基因；RRib蛋白(rib)基因；alp2Cα样蛋白2(αlp2)基因；alp3Cα样蛋白3(αlp2)基因；r假定的Rib样蛋白基因。
表13 可移动遗传元件在194个侵袭性GBS分离株中的分布情况可移动遗传元件出现情况总共 N＝ IS1381 IS861IS1548 ISSa4GBSi1 无6- - - --678 78 - - ---2- - - -2-37 37 37- ---11 - 1 ---33 - - 3--29 29 2929---66 6 - 6--88 8 - -8-18 - 18- -18 -11 - - -1-11 - - 1-122 2 2 -2-22 - - 22-总数 168(87％) 100(52％) 33(17％) 11(6％) 34(18％) 6(3％)(n＝194)注数据为含不同mge组合的分离株的数目。
表14 GBS基因型与侵袭性疾病年龄间的相互关系血清型年龄-组/疾病1基因型0-6d 7-3m 4m-14yr15-45yr46-60yr＞60yr 总计Ia-1 14 4+1 1 7 3 635+1(19％)Ia-(2-8) 4 2- 1 - 310Ia总数 18(34％)6+1(21％)1(10％)8(28％)3(18％)9(17％) 45+1(24％)Ib-1 2 1+1 - 3 2 5+1 13+2Ib-(2-16) 3 4+2 - 3 1 516+2Ib总数 5(9.4％)5+3(24％)- 6(21％)3 10+1 29+4(17％)II 8(15％) 1(3％) - 4+1(17％) 1 4(7％) 18+1(10％)III-1 6+1(13％) 4(12％) 1+1(20％) 1+1(7％) 6+1(41％) 422+4(13％)III-2 5(9％) 5+4(39％)3 1(10％)2 - -13+4(9％)III-(3-4) 1+1 1- 1 1 15+1III总数12+2(26％) 10+4(41％) 2+1(30％) 4+1(17％) 7+1(44％) 5(9％) 40+9(25％)IV总数 3 -- - - 47(4％)V-13 32 4 2 13+1 27+1(14％)V-(2-7)1 1- 1 - 47V总数 4(8％) 4(12％) 2(20％)5(17％)2(11％)17+1(33％)4 34+1(18％)VI总数 1 -- - +1 34+1(3％)总数 51+2＝5326+8＝34 5+2＝7 27+1＝29 16+2＝18 52+2＝54 177+17＝194注1.“+”后的数字是指CSF分离株；其他全部来自血液。
2. 5个病例为4m-1yr龄，1个病例为3yr龄。
3.晚发新生儿感染中的SstIII-2与所有其他组相比P＝0.0005，优势率(OR)6.8；95％置信区间(CI)2.4-19.4。
老个人感染中的MS-V与所有其他年龄组相比P＝0.001，OR 0.28；95％CI 0.13-0.59。
权利要求
1.一种B组链球菌分型方法，该方法包括对所述细菌的cpsD、cpsE、cpsF、cpsG和/或cpsI/M基因中的一个或多个区域的核苷酸序列进行分析，所述一个或多个区域包含一或多个其序列在各型之间有变化的核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中对所述核苷酸序列在与下列位置对应的一或多个位置上进行分析即图1所示的第62、78-86、138、139、144、198、204、211、281、240、249、300、321、419、429、437、457、466、486、602、606、627、636、645、803、971、1026、1044、1173、1194、1251、1278、1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
3.权利要求1中的方法，其中至少1个区域位于由所述链球菌的cpsE-cpsF-cpsG基因簇的从cpsE基因的3’端第136位碱基到cpsG基因的5′端第218位碱基所限定的序列内。
4.权利要求3中的方法，其中对所述核苷酸序列在与下列位置对应的一或多个位置上进行分析图1所示的第1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中至少1个区域位于所述细菌的cpsI/M基因中。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步骤包括对所述的一或多个区域进行测序。
7.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步骤包括确定获自所述细菌的多核苷酸是否与含有一或多个所述区域的多核苷酸探针选择性杂交。
8.权利要求7中的方法，该方法包括确定获自所述细菌的多核苷酸是否与对应于一或多个所述区域的一系列多核苷酸探针中的一或多个杂交。
9.权利要求8中的方法，其中所述的一系列多核苷酸探针是以微阵列形式存在。
10.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步骤包括使用一种或多种引物进行扩增的步骤，所述引物中的至少1种能与一段在各型之间有变化的序列特异性杂交。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述的核苷酸序列分析步骤包括使用引物对进行扩增的步骤，所述引物对中的至少1对能与一段在各型之间有变化的序列特异性杂交。
12.权利要求10或11中的方法，其中所述引物选自表2所列出的引物。
13.一种B组链球菌分型方法，该方法包括确定所述细菌基因组有无存在一种或多种选自rib、alp2或alp3基因的表面蛋白基因。
14.权利要求13中的方法，其中所述的确定有无存在所述表面蛋白基因包括确定获自所述细菌的多核苷酸能否与相应于所述表面蛋白基因的一个区域的多核苷酸探针选择性杂交。
15.权利要求13中的方法，其中所述的确定有无存在所述表面蛋白基因包括使用一种或多种引物进行扩增的步骤，该引物特异性扩增所述表面蛋白基因的一个区域。
16.权利要求15中的方法，其中所述的引物选自表6列出的引物。
17.权利要求1-12中任一项所述的方法，该方法进一步包括确定所述细菌基因组有无存在一种或多种选自rib、alp2或alp3基因的表面蛋白基因。
18.一种B组链球菌分型方法，该方法包括确定所述细菌基因组有无存在一种或多种选自IS861、IS1548、IS1381、ISSa4或GBSi1的可移动遗传元件。
19.权利要求18中的方法，其中所述的确定有无存在所述可移动遗传元件包括确定获自所述细菌的多核苷酸能否与相应于所述可移动遗传元件的一个区域的多核苷酸探针选择性杂交。
20.权利要求18中的方法，其中所述的确定有无存在所述可移动遗传元件包括使用一种或多种引物进行扩增的步骤，该引物特异性扩增所述可移动遗传元件的一个区域。
21.权利要求20中的方法，其中所述的引物选自表10列出的引物。
22.权利要求13-17中任一项所述的方法，该方法进一步包括确定所述细菌基因组有无存在一种或多种选自IS861、IS1548、IS1381、ISSa4或GBSi1的可移动遗传元件。
23.一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，所述至少10个连续核苷酸对应于B组链球菌cpsD-cpsE-cpsF-cpsG基因中的一个区域，所述多核苷酸包含一或多个在各型B组链球菌血清型之间有变化的核苷酸。
24.权利要求23中的多核苷酸，其中所述的在各型B组链球菌血清型之间有变化的核苷酸对应于下列位置中的一或多个位置即图1所示的第62、78-86、138、139、144、198、204、211、281、240、249、300、321、419、429、437、457、466、486、602、606、627、636、645、803、971、1026、1044、1173、1194、1251、1278、1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
25.一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，所述至少10个连续核苷酸对应于由B组链球菌的cpsE-cpsF-cpsG基因簇的从cpsE基因的3’端第136位碱基对到cpsG基因的5′端第218位碱基对所限定的序列中的一个区域，所述多核苷酸中包含一或多个在各型B组链球菌型之间有变化的核苷酸。
26.权利要求25中的多核苷酸，其中所述的在各型B组链球菌型之间有变化的核苷酸对应于下列位置中的一或多个位置即图1中所示的第1413、1495、1500、1501、1512、1518、1527、1595、1611、1620、1627、1629、1655、1832、1856、1866、1871、1892、1971、2026、2088、2134、2187和2196位。
27.一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，所述至少10个连续核苷酸对应于B组链球菌的cpsI/M基因中的一个区域，所述多核苷酸包含一或多个在各型链球菌血清型之间有变化的核苷酸。
28.权利要求27中的多核苷酸，其中所述的多核苷酸选自表2所示的核苷酸序列。
29.一种基本上由至少10个连续核苷酸组成的多核苷酸，所述至少10个连续核苷酸对应于B组链球菌的rib、alp2或alp3基因中的一个区域，所述多核苷酸包含一或多个在各型B组链球菌亚型之间有变化的核苷酸。
30.权利要求29中的多核苷酸，其中所述的多核苷酸选自表6所示的核苷酸序列。
31.权利要求23-30中任一项所述的多核苷酸在B组链球菌血清分型和/或亚分型方法中的用途。
32.一种组合物，其包含一系列如权利要求23-30中任一项所述的多核苷酸。
33.权利要求32所述的组合物在B组链球菌血清分型和/或亚分型方法中的用途。
34.一种微阵列，其包含一系列如权利要求23-30中任一项所述的多核苷酸。
35.权利要求34所述的微阵列在B组链球菌血清分型和/或亚分型方法中的用途。
全文摘要
本发明提供了用于B组链球菌分型的分子方法，以及用于该方法的多核苷酸。
文档编号C12Q1/68GK1610756SQ02822915
公开日2005年4月27日 申请日期2002年9月18日 优先权日2001年9月19日
发明者孔繁荣, 格温德琳·吉尔伯特 申请人:西悉尼地区健康服务中心