专利名称：无乳链球菌疫苗的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及用于保护鱼类抵御无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)感染的新疫苗和制备该疫苗的新方法。
无乳链球菌是在许多种类的养殖鱼类和野生鱼类中导致严重经济损失的B组链球菌细菌。该感染性细菌普遍存在于水产养殖设施中，在所述养殖设施中，鱼被密集地养殖在淡水、微咸水或海水中。高密度的鱼和所述水环境有利于链球菌疾病的快速传播。此外，受感染的养殖鱼类可将所述疾病传播给野生鱼群体，或受感染的野生鱼类可将疾病传播给养殖鱼类。
现有技术的描述以前曾利用基于腹膜内或肌内注射的策略开发出抗各种链球菌和肠球菌(Enterococcus)种类的疫苗。已开发出用于预防链球菌症的数种可注射的疫苗，尽管这些疫苗中的许多种在其配制上不同。Eldar等人(Development and efficacy of a vaccine againstStreptococcus iniae infection in farmed rainbow trout，VetImmunol Immunopathol 1997；56175-183)报导了在用福尔马林灭活的海豚链球菌(Streptococcus iniae)疫苗进行腹膜内(IP)接种后，虹鳟鱼获得了保护。Klesius等人[Efficacy of a killedStreptococcus iniae vaccine in tilapia(Oreochromis niloticus)，Bull Eur Ass Fish Pathol 1999；19(1)38-41；和Efficacy of asingle and combined Streptococcus iniae isolate vaccineadministered by intraperitoneal and intramuscular routes intilapia(Oreochromis niloticus)，Aquaculture 2000；188(3-4)237-246]已开发了由整个细胞和浓缩的细胞外产物组成的经修饰的灭活海豚链球菌疫苗。经免疫的25g罗非鱼(尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus))具有95.3的相对百分比存活率(RPS)，而100g罗非鱼具有在84.2至94的变化范围内的RPS值。在用富含类毒素的菌苗bacterin接种后，保护了大菱鲆(大菱鲆(Scophthalmus maximus)抵御肠球菌的侵害[Romalde等人，Prevention of streptococcosisin turbot by intraperitoneal vaccinationA review，J ApplIchthyol 1999；15153-158；Long-lasting protection againstturbot streptococcosis obtained with a toxoid-enrichedbacterin，Bull Eur Ass Fish Pathol，1996；16(5)169-171；和Toranzo等人，Efficacy of intraperitoneal and immersionvaccination against Enterococcus sp.infection in turbot，Aquaculture 1995；13417-27]。富含类毒素的菌苗疫苗是两种经福尔马林灭活的肠球菌分离株和其培养液的组合。用弗氏不完全佐剂中的福尔马林灭活链球菌免疫的虹鳟鱼获得了抗链球菌的保护，而通过浴浸(bath immersion)免疫的大菱鲆则不受保护[Akhlaghi等人，Comparison of passive and active immunization of fish againststreptococcosis(enterococcosis)，J Fish Dis 1996；19251-258]。近来，Nakanishi等人(Development of a new vaccine deliverymethod for fishPercutaneous administration by immersion withapplication of a multiple puncture instrument，Vaccine 2002；203764-3769)证实，浸在福尔马林灭活的海豚链球菌疫苗悬浮液中的皮肤穿孔幼虹鳟鱼获得的保护和通过IP(腹膜内)注射获得的保护相当。
Eldar等人公开了由福尔马林灭活的难辨链球菌(Streptococcus difficile)制备的可注射疫苗制剂。据报导，该疫苗可保护罗非鱼(红色吴郭鱼Oreochromis sp.)抵御难辨链球菌的攻击[Eldar等人，Vaccination with whole-cell vaccine andbacterial protein extracts protects tilapia againstStreptococcus difficile meningoencephalitis，Vaccine 1995；13(9)867-870；和Bercovier等人，Immunization with BacterialAntigensinfections with Streptococci and Related Organisms；Fish Vaccinology，Dev.Biol.Stand.，第90卷(Liiehaug，G.，Midlyng，PJ & Brown，F.eds.)Karger，Basel，Switzerland，pp.153-160，1997]。
然而在之后的报导中，Vandamme等人(Streptococcus difficileis a nonhemolytic group B，type Ib Streptococcus，Int J SystBacteriol，1997；47(1)81-85)提出，Eldar等人报导的难辨链球菌实际上是非溶血性的B组链球菌，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)。许多报导的最初未确定种类的或错误鉴定的链球菌鱼分离株更近以来确实已被表征为非溶血性的B组链球菌，无乳链球菌。
发明概述现在我们已经发明这样的新的疫苗，该疫苗对在鱼类，特别是对无乳链球菌感染易感的罗非鱼(尼罗罗非鱼)和其他种类的鱼中控制无乳链球菌是安全和有效的。所述疫苗包含无乳链球菌的一种或多种β溶血性分离株的完整(整个)灭活细胞和来自β溶血性无乳链球菌培养物的浓缩提取物。该疫苗组合物对于保护鱼类抵御相同的或其他强毒株无乳链球菌(即和用于制备疫苗的无乳链球菌分离物不同)的感染是有效的。
根据本发明，提供抵御针对鱼类的无乳链球菌的新型高保护性疫苗是本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供对于在鱼类群体中预防由无乳链球菌引发的家畜流行病(epizootics)有效的疫苗。
本发明的另一个目的是提供可通过注射或浸浴给药的抵御无乳链球菌的有效疫苗。
本发明的另一个目的是提供功效增加的抵御无乳链球菌分离物的单价或多价疫苗。
本发明的另一个目的是提供新的来自鱼类的β溶血性无乳链球菌分离株，该分离株可用于制备在鱼类中抵御无乳链球菌感染的疫苗。
本发明的另一个目的是提高罗非鱼、条纹石瓰(Striped Bass)和其他鱼类的存活力和生产力，以及减少由无乳链球菌导致的经济损失。
根据随后的描述，本发明的其他目的和优势将变得更加清楚。
附图简述
图1显示罗非鱼的平均累积死亡率百分比，所述罗非鱼是通过腹膜内(IP)注射施用海豚链球菌疫苗和用2.6×104CFU无乳链球菌/鱼(_接种者；_非接种者)进行IP攻击的罗非鱼。
图2显示通过腹膜内(IP)注射施用无乳链球菌疫苗(试验3和4)和用无乳链球菌T进行IP攻击的罗非鱼的平均累积死亡率百分比；试验3的攻击剂量为2.6×103CFU/鱼(Δ接种者；非接种者)；试验4攻击剂量为1.5×104CFU/鱼(_接种者；_非接种者)。
图3显示通过浸浴施用无乳链球菌疫苗(试验5和6)和用无乳链球菌进行IP攻击的罗非鱼的日死亡率。试验5的攻击剂量为3.6×105CFU/鱼(T＝非接种者；B＝接种者)；试验6的攻击剂量为1.7×106CFU/鱼(C＝接种者；D＝非接种者)。寿命试验法(Lifetest procedure)(SASInstitute，Cary，NC)。
图4显示在攻击后不同时间点，受攻击的罗非鱼中平均葡萄糖值(mg/dL)(线)和累积死亡率百分比(柱状图)之间的关系。10条经接种的(条纹柱)罗非鱼和对照(涂黑柱)罗非鱼的累积死亡率百分比和经接种的(条纹柱)罗非鱼和对照(涂黑柱)罗非鱼中的平均血糖水平，所述罗非鱼用1.5×104CFU无乳链球菌通过IP注射攻击。
生物材料的保藏按照布达佩斯条约的条款，将β溶血性、有荚膜的无乳链球菌脑分离株(ARS-KU-3 B和ARS-KU-11 B)于2002年7月17日保藏于位于1815 North University Street，Peoria，IL 61604的美国农业研究菌种保藏中心，保藏号分别为NRRL B-30608和NRRL B-30607。
如此处所用的，无乳链球菌是指经过验证的种类，其特征已由Evans等人(Characterization of β-haemolytic Group BStreptococcus agalactie in cultured seabream，Sparus auratusL.，and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，Journalof Fish Diseases 2002；25505-513，the contents of which areincorporated by reference herein)描述，其他参考菌株已被保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia，USA。
发明详述如此处所用的，“疫苗”在广义上定义为以能够在用所述疫苗接种的动物中激起保护性免疫应答的可施用形式存在的任何类型的生物学试剂。
本发明提供了这样的新的疫苗，即该疫苗包含了一种或多种以完整(整个)的细胞形式存在的无乳链球菌灭活β溶血性分离株，和来自相同的或不同的β溶血性无乳链球菌分离株的培养物的浓缩提取物。所述疫苗对控制由任何无乳链球菌菌株引起的鱼类感染是有效的，所述菌株包括与用于制备所述疫苗的菌株不同的菌株。此外，所述疫苗对控制由β溶血性和非溶血性菌株以及有荚膜的或无荚膜的菌株引起的感染是有效的。然而，所述疫苗对于在鱼中诱发针对由β溶血性无乳链球菌菌株引起的感染的保护性反应特别有效。
本发明的疫苗在施用于多种鱼中时可有效控制无乳链球菌的感染。接种疫苗也在接受治疗的鱼中显著地降低了异常的行为和形态学。不局限于此，所述疫苗对治疗家养的或外来鱼类特别有益，所述鱼类包括黄金银色小鱼(golden shiners)、bullminnows、蓝鱼(bluefish)、海湾油鲱(gulf menhaden)、海鲶(sea catfish)、鲱鲤(mullet)、菱体兔齿鲷(pinfish)、细须石首鱼(Atlantic croaker)、spot、weakfish、斑点叉尾鮰(channel catfish)、虹鳟鱼、鳗鱼(eels)、雌性亲纹鲈(striped bass)和其杂交品种、海鲈(sea bass)、真鲷(sea bream)、大菱鲆和罗非鱼。
用于制备疫苗的β溶血性无乳链球菌的具体菌株不是最重要的，任何β溶血性、有荚膜或无荚膜的无乳链球菌分离株都适合在此处使用。可通过使用常规技术和类似于Evans等人(Characterization ofβ-haemolytic Group B Streptococcus agalactie in culturedseabream，Sparus auratus L.，and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，Journal of Fish Diseases 2002；25505-513，the contents of which are incorporated by reference herein)描述的富集技术从环境或天然的来源例如受感染的鱼中或从以前分离的基本上纯的菌株中分离合适的无乳链球菌。优选的菌株包括有荚膜的菌株，特别是上述菌株NRRL B-30608和NRRL B-30607。尽管单价和多价疫苗都显现功效，但由于在种类中可能存在的抗原异质性，使用超过一种β溶血性无乳链球菌菌株制备的多价系统是优选的。
本发明的疫苗是灭活的细胞制剂或细菌疫苗，其也包括无乳链球菌培养物的细胞外滤出液(不含细胞的培养液)的浓缩级分。这样，所述浓缩的级分基本上不含有无乳链球菌的细胞、细胞壁片段和细胞内组分。尽管从浓缩级分中除去了细胞，但熟练的操作者认识到，由于在培养过程中发生的正常细胞裂解的原因，可存在相对少量的细胞内产物和细胞壁片段。在特别优选的实施方案中，由浓缩级分中除去低分子量细胞外组分(以及任何低分子量的细胞内组分)，优选地除去分子量低于大约1kDa、更优选地分子量低于大约2kDa、和最优选地分子量低于大约3kDa的组分。不限于理论，据认为灭活无乳链球菌的各种细胞外产物的低分子量组分对菌苗悬浮液的抗原性具有抑制作用。细胞外保留物的浓缩和过滤基本上除去了这些抑制性组分，从而增加了疫苗的功效。此外，据认为细胞外产物包括来自荚膜的抗原或分泌/外排的抗原以及提供较高的免疫应答的其他有益分子。
可通过在任何常规的条件下和在促进其生长的培养基中进行培养来繁殖用于制备疫苗的细菌。尽管各种常规的固体和液体培养基可以适合在此使用，但在液体培养基培养对于大规模生产是特别优选的。不受限于此，常规的胰酶大豆肉汤是优选的，尽管可加入额外的营养物以增加荚膜(多糖)的产量。例如，糖例如葡萄糖的加入可增加多糖的产量。可通过选择的分离株的稳定培养来进行所述疫苗的生产，而无需在25℃下在5至7天的发酵期间调节培养物的pH。据认为，通过5至7天的长发酵时间，饥饿无乳链球菌细胞也增强所得疫苗的功效，因此该方法也是优选的。在该培养基中制备的疫苗的终pH值可在pH6.5至7.4的范围内变动。所述疫苗制剂的盐度优选地在千分之(ppt)3.6至4.0的盐(YSI Incorporated，Yellow Springs，OH)的范围内，并且据认为该性质也可增加疫苗的功效，特别是当通过浸浴免疫方法施用时。不受限于其，通过临床用折射计(Atago A300CL，Vee Gee Scientific，Inc.，Kirkland，WA)测量的疫苗(如实施例2中所描述的那样产生的)在血清蛋白(g/100ml)标度上是1.3384至1.3387；在尿液比重(UG)标度上是1.015至1.016；在589纳米(nm)下的折射率(nD)是1.0至1.2。所述疫苗在540nm(UV-VisibleSpectrophotometers，Spectronic Unicam，Cambridge，UK)的光密度(OD)在0.887至0.939的范围内变化。通风一般不是优选的。所有基于植物的发酵培养基也优选用于本文中，因为它们的使用消除了在最终的疫苗产品中存在动物产物和感染性因子的风险。
在其繁殖和回收后，使无乳链球菌的细胞接受对灭活(即，使失活)该细胞有效的化学和/或物理处理。用于灭活该细胞的有效的处理在此处定义为这样的处理，即该处理灭活了99.9％或更多的存活细胞而不裂解所述细胞，但同时保持所述细胞在动物中引发抗体反应的能力。因此，相对于未处理的细胞，所述处理不应当显著地改变灭活细胞上的细胞表面抗原的特异性。尽管灭活100％的所有存活细胞的处理一般可以是优选的，但本领域技术人员认识到100％的细胞死亡不可能总是容易获得的。在优选的实施方案中，通过用福尔马林处理存活细胞来制备灭活的、完整的无乳链球菌。可选择地，可通过UV照射来灭活细胞，例如Purdy等人(美国专利号6,303,130)描述的用于制备溶血巴斯德菌(Pasteurella haemolytica)菌苗的方法。也可以预见，针对灭活细胞疫苗(即，菌苗)的制备描述的多种其他技术也适合在此使用，其包括但不限于用醇，特别是脂肪醇例如乙醇或异丙醇、苯酚、三甲酚(tricresol)、福尔马林、甲醛、丙酮、硫柳汞(Merthiolate)、β内酯处理和在不会诱导蛋白变性的温度下的适度加热(例如，56℃下1小时)。当然，处理时间和条件可随选择的特定方法而发生变化，并且可通过常规的检测容易地确定。
在优选的实施方案中，将在其发酵容器中的无乳链球菌细胞暴露至福尔马林中进行充足的时间以灭活100％的细胞。一般地，福尔马林浓度可在大约1％至大约5％(v/v)、优选地在大约1％至大约3％(v/v)的范围内变化。
可根据灭活率百分比对处理的时间的致死性灭活曲线容易地确定获得100％灭活所需的特定福尔马林浓度的合适暴露时间。
发酵后，通过例如过滤或离心浓缩细胞以获得高密度的细胞悬浮液，将细胞沉淀和发酵培养液分开。可保留被分开的细胞以用作疫苗的第一组分。然后，以无细胞培养液的形式存在的滤出液自身接受另一个浓缩步骤以产生浓缩的提取物，并且优选地除去上述的小分子量细胞外组分。许多具有不同分子量截留值的过滤系统适合用于该优选的实施方案。优选的过滤器包括具有大约1kDa的分子量截留值(从而产生包含来自培养物的分子量大于大约1kDa的细胞外产物的浓缩提取物)的过滤器。使用具有大约2kDa分子量截留值的过滤器是更优选的，对于具有大约3kDa的截留值的过滤器是特别优选的，其产生包含来自培养物的分子量分别大于大约2kDa和3kDa的细胞外产物的浓缩提取物。在一个优选的实施方案中，通过使用利用Millipore ProfluxM12(Billerica，MA)的3kDa Amicon柱(S3Y3)浓缩无细胞培养液。在任何过滤系统中，可通过加入水重悬浮保留物来将分离进行到底。在特别优选的实施方案中，可进行分离直至保留物体积缩小5倍。这使得在保留物中保留足够的水以使在和保留物(即，浓缩的提取物)重组后容易地悬浮前面保留的细胞沉淀。为方便起见，一般可从相同的培养物中制备灭活的细胞和浓缩的提取物。然而，要认识到它们可由相同的或不同的无乳链球菌菌株的不同培养物来制备。
合适的比例可通过本领域技术人员来确定，但可见所述比例一般在大约5∶1(体积/体积)至大约20∶1(体积/体积)的范围内变化，优选地大约10∶1(体积/体积)的原始发酵无细胞培养液[即，无细胞培养液的原始体积对浓缩培养液(保留物)的体积的比例]。使用0.22Fm 11微生物学过滤器(Corning，Corning，NY)对所述浓缩无细胞培养液进行除菌。向1000ml的无菌浓缩无细胞发酵液中加入16ml福尔马林灭活细胞。
在重新悬浮保留物中的细胞沉淀后，通过以对鱼免疫有效的量或剂量进行配制来制备用于施用的灭活无乳链球菌细胞。可仅以包含重悬浮的灭活细胞的保留物提供药剂，或所述药剂还包含本领域已知的药物可接受载体和佐剂。免疫有效的量或剂量在此处定义为这样的量，即该量可在经处理的鱼中诱导完全的或部分的免疫力(引发保护性免疫应答)，所述免疫力可抵御随后用无乳链球菌的强毒株进行的攻击。当经处理的动物群体的保护性水平(通过受感染鱼的数目的减少或感染严重性的降低来显示的)显著地高于未接种的对照组的保护性水平(在至少80％的置信水平上测量的，优选地在95％的置信水平上测量的)时，就认为在经处理的动物群体中已诱导了免疫力。本领域技术人员可通过常规的实验容易地确定合适的有效剂量。一般地，疫苗可包含至少1×108个无乳链球菌细胞/ml浸浴培养基，优选地包含大约4×109个无乳链球菌细胞/ml浸浴培养基。依赖于鱼的大小，对于IP注射途径，鱼中优选的剂量是大约0.1-0.2ml的上述量。尽管可施用更大量的细胞，但使用这样的更高水平一般被认为是不切实际的。
通过在药物可接受的载体中进行配制来制备用于施用的灭活细胞，所述媒介物是水、生理盐水、矿质油、植物油、水性羧甲基纤维素钠或水性聚乙烯吡咯烷酮。所述疫苗制剂也可包含任选的佐剂、抗菌药或其他药物活性剂，如本领域常规的药物活性剂。不受限于其，合适的佐剂包括但不限于矿质油、植物油、明矾和弗氏不完全佐剂。其他优选的佐剂包括生物相容性基质材料微粒或小珠。所述微粒可由任何生物相容性基质材料如本领域内常规的生物相容性基质材料构成，包括但不限于琼脂和聚丙烯酸(酯)。本领域技术人员认识到也可使用其他载体或佐剂。例如，Webb和Winkelstein[in Basic &Clinical Immunology，Stites等人(ed.)，第5版，Lange MedicalPublications，Los Altos，CA，1984，pages 282-285]描述了可使用的其他佐剂，其内容在此引用作为参考。
根据优选的实施方案，可将灭活的细胞掺入微粒或微囊中以延长抗原物质向受试动物的暴露，从而增加保护性免疫力的持续时间。可通过使用本领域内的常规技术将各种熟知的惰性、生物相容性基质材料形成微粒和胶囊。不受限于此，合适的基质材料包括天然的或合成的聚合物，例如藻酸(盐)、聚(乳酸)、聚(乳酸/羟基乙酸)、聚(己内酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酸酐、聚原酸酯(polyortho esters)、聚缩醛(polyacetals)、聚腈基丙烯酸酯(polycyanoacrylates)、聚氨基甲酸酯(polyurethanes)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚氧乙烯、特别是琼脂和聚丙烯酸(酯)。Sparks[Microencapsulation，InKirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology，third edition，JohnWiley & Sons，New York，(1981)，第15卷，pages 470-493]，Kydonius[controlled Release TechnologiesMethods，Theories，and Applications，CRC Press，Cleveland，OH，1980]，Gombotz等人[美国专利号5,019,400]或Beck[美国专利号4,919,929]描述了可用于在此处使用的用于将材料掺入微粒或胶囊化的技术的示例，各参考资料的内容在此引用作为参考。
可通过任何便利的、可使细胞产生免疫应答的途径(例如通过腹膜内或肌内注射、浸浴、经口施用或经鼻施用)将本发明的疫苗施用给受试动物。然而，腹膜内注射或浸浴优选地用于初次免疫(primaryimmunization)，而必要时，经口免疫优选地用于二次或加强免疫。也可预见的是，可在浸浴前或浸浴期间刺破鱼的表面，例如如Nakanishi等人(2002，同上)所描述的，或刮擦，或稍微去鳞片，以帮助疫苗暴露至动物的免疫系统。可以单剂或多剂施用疫苗。依赖于饲养条件，可以多剂施用疫苗，本领域技术人员可容易地确定施用的时间安排。
通过浸浴免疫进行的抗无乳链球菌感染的接种提供了优于其他免疫途径的几个有利方面。这些有利方面包括每条被免疫鱼的成本更低、大量鱼的集体免疫(mass immunization)、减少的压力(reducedstress)、鱼存活率显著更高和没有对接种的不利反应。此外，浸浴接种对于不能注射或不能接受皮肤刺孔的更小鱼的集体接种是种有效的方法。可选择地，商购可获得的鱼类疫苗的腹膜内注射由于其可靠性和高效性而普通用于淡水或海水养殖农场，尽管每条被免疫的鱼的成本较高和对鱼的压力较大。
下列实施例仅仅旨在进一步说明本发明，并不想限制由权利要求界定的本发明的范围。
实施例1评估以前由Klesius等人发展的海豚链球菌疫苗抗无乳链球菌的功效。所述疫苗是非保护性的。
材料和方法罗非鱼来自保持在ARS、USDA、水生动物健康研究实验室(AquaticAnimal Health Research Laboratory)(Auburn，AL)的原种。在实验前使具有5g和30g平均重量的罗非鱼适应57升的流通玻璃缸(补充以0.5升/小时去氯水)的环境10天。保持12小时12小时的光照和暗周期并通过矿砂气泡石(air stone)提供通气。每天用AQUAMAXGROWER 400(Brentwood，MO)将鱼喂至饱足。每天使用YSI 85 oxygenconductivity、盐度和温度测量仪(Yellow Spring Instrument Co.，Yellow Springs，OH)测量溶氧度、温度和盐度，监控水的质量。每天的水温平均为26.3±0.03℃，每天的平均溶氧是5.95±0.06mg/l。为确证鱼不含无乳链球菌的状态，通过将接种环穿入脑和肾获取样品以进行培养。将样品直接在绵羊血琼脂上划线培养，于27℃下温育24至48小时。从5条随机选择的鱼中未分离出无乳链球菌。
疫苗制备以前描述了海豚链球菌疫苗的制备(Klesius等人，Efficacy ofa killed Streptococcus iniae vaccine in tilapia(Oreochromisniloticus)，Bull Eur Ass Fish Pathol，1999；19(1)38-41.1999)。简而言之，通过在胰酶大豆肉汤(TSB)中分别培养海豚链球菌分离株(NRRL B-30264和NRRL B-30238)并在27℃下在摇床(70RPM)水浴中温育72小时来制备疫苗。在27℃下用10％中性缓冲福尔马林处理培养物24小时，获得3％的终浓度。在7000xg下将经福尔马林处理的培养物离心30分钟，将细胞沉淀和培养液分离。使用2kDa中空纤维浓缩仪将无细胞培养液浓缩20倍，以除去所有更低分子量的组分。然后将该2kDa培养液浓缩物以10∶1的V/V用于重悬所述细胞沉淀。疫苗的终浓度为4×109CFU/ml。通过在被福尔马林灭活前获得疫苗的光密度来估计细菌浓度。使用螺旋全自动微生物接种仪和Qcount(SpiralBiotech，Norwood，MA)确定CFU/ml的实际数目。非接种者只接受浓缩的胰酶大豆肉汤(TSB)。根据在72小时绵羊血琼脂上缺少生长来确定疫苗细胞被灭活。
接种方案为确定海豚链球菌疫苗是否具有抗无乳链球菌的保护性(试验1)，将200条平均重量为30g的罗非鱼分入10个水箱，每个水箱20条鱼，包括非免疫的对照(表1)。罗非鱼的5个重复水箱用作对照。以0.1ml的体积将海豚链球菌NRRL B-30264疫苗或组合的NRRLB-30264/NRRL B-30238疫苗经腹膜内注射入罗非鱼。对照罗非鱼接受0.1ml的TSB。在攻击前将经免疫的罗非鱼和对照罗非鱼保持30天。攻击后就死亡率对罗非鱼进行监控14天。
进行实验性无乳链球菌攻击和细菌学样品收集和评估。使用无乳链球菌分离株NRRL B-30607(最先由患有天然链球菌疾病的野生单鳍鱼科鲻鱼(Klunzingeri mullet)，多耙鮻Liza Klunzingeri(Day)分离的)感染鱼。通过标准的方法，所述分离株被鉴定为无乳链球菌。将从鲻鱼(mullet)(多耙鮻Liza Klunzingeri)分离的无乳链球菌(被称为ARS-KU-11B(美国农业研究菌种保藏中心NRRL B-30607))在27℃下在胰酶大豆肉汤(TSB，Difco Laboratories，Sparks，MD)中培养24小时，然后以0.2ml等分在-70℃下冷冻。通过用所述冷冻分离株的解冻等分接种TSB来制备用于本研究的感染性分离株。然后通过IP注射，用100μl 2.6×105CFU/ml的无乳链球菌攻击鱼。每天两次取出死鱼并进行尸体剖检，在无菌条件下从脑、前肾和肠中获取样品。在27℃下将样品直接在绵羊血琼脂上培养24至48小时。将β溶血性、过氧化氢酶呈阴性和格兰氏染色呈阳性的球菌菌落在绵羊血琼脂上进行传代培养，然后根据Evans等人(Characterization ofbeta-haemolytic Group B Streptococcus agalactie in culturedseabream，Sparus auratus(L.)and wild mullet，Liza klunzingeri(Day)，in Kuwait，J Fish Dis，2002；25505-513)(在此引用作为参考)描述的检测法进行细菌学和生物化学鉴定，其被鉴定为无乳链球菌。使用购自Remel(Lenexa，KS)的培养基在27℃下进行所有的检测。
在14天的时期内确定各试验中接种的和未接种的罗非鱼的平均死亡率百分比和平均累积死亡率百分比。根据Amend(1981)，将疫苗的功效计算为相对存活率百分比(relative percent survival，RPS)。
统计分析通过使用Gomez和Gomez描述的区组设计(block design)，对处理水箱进行随机化。检查所有数据以确保不违反常态性统计学假设。使用Statistical Analytical Systems(SAS)(SAS Institute，Cary，NC，1997)进行所有统计分析。使用广义线性模型(General LinearModel，GLM)方法检测处理组之间(接种的和对照)和这些处理组的重复(水箱)(其中使用同样的水箱)之间的累积死亡率上的显著差异(p＜0.05)。在P＜0.05-标准误差下确定显著差异。
结果海豚链球菌疫苗制剂不能保护罗非鱼抵御无乳链球菌的感染。在无乳链球菌攻击后，接种海豚链球菌的罗非鱼和未接种的罗非鱼的平均死亡率百分比示于表1。用海豚链球菌经IP免疫的并用无乳链球菌NRRL B-30607分离株攻击的罗非鱼的RPS为0，而100％的接种海豚链球菌的罗非鱼被无乳链球菌感染。接种者和未接种者之间的死亡率没有表现出显著差异。接种者的死亡率比未接种者的死亡率更早发生和更高(
图1)。在经海豚链球菌接种的罗非鱼和未接种者中死亡分别在第1天和第2天开始。在第4天，海豚链球菌接种者中的累积死亡率百分比达到100％，相比之下，非接种者在第11天达到100％的死亡率。
表1用无乳链球菌1经IP攻击的经腹膜内(IP)接种海豚链球菌的罗非鱼和非接种的罗非鱼(尼罗罗非鱼)的平均死亡率百分比和相对存活率百分比(RPS)。
1未接种者仅接受胰酶大豆肉汤(TSB)。
实施例2评估本发明的无乳链球菌疫苗抗无乳链球菌的功效。和实施例1的海豚链球菌疫苗相反，无乳链球菌疫苗具有保护性。
材料和方法罗非鱼罗非鱼来自保持在ARS、USDA、水生动物健康研究实验室(AquaticAnimal Health Research Laboratory)(Auburn，AL)的原种。在实验前使具有5g和30g平均重量的罗非鱼适应57升流通玻璃缸(补充以0.5升/小时去氯水)的环境10天。保持12小时12小时的光照和暗周期并通过矿砂气泡石提供通气。每天用AQUAMAX GROWER 400(Brentwood，MO)将鱼喂至饱足。每天使用YSI 85 oxygenconductivity、盐度和温度测量仪(Yellow Spring Instrument Co.，Yellow Springs，OH)测量溶氧、温度和盐度，监控水的质量。在所有试验中，每天水的温度平均为31.68±0.08℃或26.3±0.03℃，每天的平均溶氧是5.95±0.06mg/l。为证实鱼不含有无乳链球菌的状态，通过将接种环穿入脑和肾获取样品以进行细菌培养。将样品直接在绵羊血琼脂上划线培养，于27℃下温育24至48小时。从5条随机选择的鱼中未分离出无乳链球菌。
疫苗制备通过在胰酶大豆肉汤(TSB)中分开培养无乳链球菌分离株(NRRLB-30608和NRRL B-30607)并在27℃下在摇床(70RPM)水浴中温育72至125小时来制备疫苗。用3％终浓度的中性缓冲福尔马林处理培养物24小时。在7000xg下将福尔马林处理的培养物离心30分钟，将细胞沉淀和培养液分离。在3kDa Amicon柱(S3Y3)上使用MilliporeProflux M12(Billerica，MA)将无细胞培养液浓缩5倍。然后使用0.22Fm 1升的微生物过滤器(Corning，Corning，NY)对浓缩的无细胞培养液进行除菌。将16ml经福尔马林灭活的细胞加入至1升无菌的浓缩无细胞培养液中。该疫苗在540nm具有1.9的光密度。在最终的疫苗制剂中，每毫升无乳链球菌的菌落形成单位(CFU)数估计为4×109。通过在由福尔马林灭活前获得疫苗的光密度来估计细菌浓度。使用螺旋全自动微生物接种仪和Qcount(Spiral Biotech，Norwood，MA)确定CFU/ml的实际数目。非接种者只接受浓缩的胰酶大豆肉汤(TSB)。通过在72小时时绵羊血琼脂上缺少生长来确定疫苗细胞被灭活。
接种方案腹膜内施用进行三个IP无乳链球菌疫苗试验(试验2-4)。关于试验2，将40条5g的罗非鱼分成2组，每组20条鱼。关于试验3，将200条30g的罗非鱼分入10个水箱中，每个水箱20条鱼。5个重复的罗非鱼水箱用作对照。关于试验4，将160条30g的罗非鱼分成6组(非免疫对照和接种者的3个重复水箱)，每组26-27条鱼。在32℃下进行试验2和4，在26℃下进行试验3。对于所有试验，以0.1ml的体积将疫苗经IP注射入罗非鱼。以相同的体积用无菌TSB经IP注射对照罗非鱼。
浸浴施用在32℃下进行两个无乳链球菌疫苗浸没试验(试验5-6)，将130条5g的罗非鱼分成两组，一组65条鱼(对照)和一组65条鱼(经免疫的)。将对照罗非鱼浸没在1升的500ml无菌水500ml TSB中20分钟，浸没后，将20-25条鱼置于3个重复玻璃缸中。将经免疫的鱼浸入含有16ml菌苗和1000ml类毒素的未稀释疫苗中20分钟，通入空气，浸浴后，将2-25条鱼置于三个重复的鱼缸中。5g的罗非鱼不能很好耐受直接的疫苗，在接种后30条鱼死亡，这使得有必要对疫苗稀释。将另外30条鱼浸入稀释的疫苗(500ml疫苗∶500ml无菌水)中并分配到重复水箱中以替换在直接疫苗浸浴期间损失的鱼。接种后30天，没有明显的进一步死亡。关于试验6，将45条30g的罗非鱼分成4组，每组11-12条鱼。将2组(每组6条鱼)在500ml未稀释的疫苗中免疫(第一浸浴)，而将另外两组(每组6条鱼)在通有空气的相同疫苗溶液中免疫(第二浸浴)。将第一浸浴和第二浸浴免疫的鱼放入分开的玻璃缸中。使用相同的方法将对照鱼浸入TSB中。
实验性攻击和细菌学样品评估在接种后30-64天，将接种者组和非接种者组称重，并用0.1ml同源(ARS-KU-MU-11B)或异源(ARS-KU-MU-3B)无乳链球菌分离物以2.6×103至1.7×106CFU/鱼(表2)的细胞浓度范围进行IP攻击，14天中每天监控临床体症和死亡率。观察受感染的罗非鱼中无规律游动的行为和病理体征。每天两次取出死鱼并在无菌条件下从20％的病态鱼和死鱼的脑、前肾和肠中获得细菌样品，以确认无乳链球菌的存在。将样品培养在绵羊血琼脂(Remel，Lenexa，KS)上。通过使用RAPID ID32 STREP TEST(bioMerieux Vitek，Hazelwood，MO)，β溶血性、氧化酶呈阴性和革兰氏染色呈阳性的球菌菌落被鉴定为无乳链球菌。在14天内确定各试验的接种和非接种罗非鱼的平均死亡率百分比和平均累积死亡率百分比。疫苗的功效计算为相对存活率百分比(RPS)(Amend，1981)。
统计根据SAS Institute，Cary，NC(1997)的方法，通过T检验和寿命试验法对攻击后各试验的被免疫者和非免疫对照之间死亡率方面的显著差异进行统计分析。在P＜0.05时确定了显著差异。(参见前面)。
结果疫苗功效在无乳链球菌攻击后，接种无乳链球菌的罗非鱼和非接种的罗非鱼的平均死亡率百分比和RPS示于表2中。与海豚链球菌IP接种并用无乳链球菌攻击相反，在试验3和4中，用无乳链球菌疫苗进行IP接种并分别在接种后64天和30天用2.6×103和1.5×104CFU/鱼进行IP攻击的30g罗非鱼分别具有70和80的优良RPS值。试验3和4之间的水温(26和32℃)似乎对RPS结果没有影响。图2显示在用无乳链球菌攻击后，接种无乳链球菌的鱼和非接种的鱼的日平均累积死亡率百分比。无乳链球菌接种者中的平均累积死亡率百分比从第3天至第14天保持在15-16％。在试验3和4中观察到被免疫者和非免疫对照之间的死亡率上的高显著差异。试验3(P＝0.9117)和4(P＝0.9510)中各处理的重复实验之间没有表现出显著差异。用无乳链球菌攻击的、较少IP无乳链球菌接种的和非接种的5g罗非鱼的RPS为25(试验2，表2)。
浸浴接种5g(试验5)和30g(试验6)的罗非鱼后，分别以3.6×105和1.7×106CFU/鱼进行无乳链球菌攻击，产生相似的RPS，为34(表2)。在试验5中观察到被免疫者和非免疫对照之间的死亡率有显著差异。试验5中各处理的重复实验之间没有表现出显著差异(P＝0.9798)，其与疫苗(未稀释的和稀释的)处理无关。相反地，在试验6中没有观察到被免疫者和非免疫对照之间在死亡率上的显著差异。试验6中在各处理的重复实验(第一和第二浸浴)之间的死亡率上没有显著差异(P＝0.7327)。5g和30g的接种者具有比5g和30g非接种者更低的日累积死亡率百分比。尽管30g的鱼受到比5g的鱼高出10倍的剂量的攻击，但5g和30g的非接种者具有非常相似的日累积死亡率。非接种者的平均死亡率百分比平均为85，接种者的平均死亡率百分比平均为55(表2)。在攻击后一天，两个试验的非接种对照的死亡率都超过50％(图3)。直至第5天接种者才达到50％的死亡率。
表2在用无乳链球菌IP攻击后，IP接种无乳链球菌(试验2-4)的罗非鱼(罗尼罗非鱼)和浸浴(BI)接种(试验5-6)的罗非鱼以及非接种的罗非鱼(罗尼罗非鱼)的平均死亡率百分比和相对存活率百分比(RPS)。
*异源攻击*同源攻击实施例3再次就预防由无乳链球菌强毒株产生的感染的功效对本发明的无乳链球菌疫苗进行检查，也确定对血糖水平的影响。
材料和方法，疫苗制备和接种方案全都和前面实施例2中描述的一样。
血液的取样和分析在接种之前(0小时)，对10条鱼进行取样以测定血糖。在接种后2、6和24小时对鱼进行重复取样以测定血糖。接种后28小时，在攻击之前(攻击前0小时)确定10条接种者和10条对照的血糖。在攻击后2、6、24、48、72小时和312小时对这些鱼进行重复取样以测定血糖。使用结核菌素注射器(tuberculin syringe)和27号针头从尾静脉获取血液样品。将5至10μl血滴置于干净的载玻片上。通过将ONE TOUCH ULTRA METER(Lifescan，Miptas，CA)测试条的上部边缘以15至30°的角度和玻璃表面上的血滴轻轻接触并使血液完全充满确认窗来确定血糖浓度(Diouf等人，2000)。在大约5秒内以mg/dL显示葡萄糖浓度。在前面的研究中，Evans等人(2003b)在可接受的DO水平上从10个来自健康罗非鱼的血液样品的重复中确定了20mg/dL的灵敏度和3.25％的内部测定误差(intra-assay variance)(平均值为20.4±0.66mg/dL)。此外，通过葡萄糖监控仪测量的葡萄糖氧化酶反应和比色商业化实验方法相关。在P＜0.001时，相关系数(r)为0.928。
实验性攻击在接种后第28天，对接种者和非接种者称重并用0.1mL无乳链球菌分离株以1.5×105CFU/mL的细胞浓度进行IP攻击，每天监控临床体征和死亡率，进行13天。观察受感染的罗非鱼中无规律游动的行为和病理体征。每天两次取出死鱼并在无菌条件下从脑、前肾和肠中获得细菌样品，将其培养在SBA上以确认无乳链球菌的存在。通过使用RAPID ID 32 STREP TEST(bioMerieux Vitek，Hazelwood，MO)(Evans等人，2002)，β溶血性、氧化酶呈阴性和革兰氏染色呈阳性的球菌菌落被鉴定为无乳链球菌。在13天的时期内确定累积处理死亡率。将疫苗的功效计算为相对存活百分比(RPS)(Amend，1981)。
统计根据SAS Institute，Cary，NC(1997)的方法，通过ANOVA方法，然后再经邓肯多重范围检验(Duncan′s Multiple Range test)对数据进行统计分析。在p＜0.001(对于ANOVA)和在p＜0.05(对于Duncans)的水平上，在一个时间段上各处理之间和单个处理在所有时间段之间有血糖水平的显著差异。通过SAS的相关性方法进行血糖水平和死亡率之间的关联。如上所述进行重量分析。记录所有处理的平均血糖值的标准误差。
结果在疫苗注射后2小时，接种者具有比对照鱼(52.1±5.37mg/dL)显著更高的血糖水平(97.9±9.90mg/dL)(数据未显示)。在注射后6小时，接种者的血糖水平保持在提高的水平，但在24小时时返回至注射前水平之前没有统计学上的提高。在接种前(0小时)或在接种后6小时和24小时，在接种者和对照之间的血糖水平上没有观察到显著差异。用TSB进行IP注射的对照的血糖水平在任何时间间隔都没有显著差异。在接种后第28天，在对照或接种者中没有出现死亡。在用1.5×104CFU的无乳链球菌通过IP注射进行攻击和感染之后，接种者和对照都在2、24、48和72小时具有比攻击前(0小时)显著更高的血糖水平(图4)。在24、48和312小时表现出对照和接种者之间显著提高的血糖水平。
然而，在这些时间段，接种者的血糖水平比对照的要低。对照的葡萄糖值(117.0±14.09mg/dL)在第48小时达到峰值。接种者在312小时的血糖值(41.9±2.39mg/dL)和接种者在接种和攻击前的0小时获得的血糖值相同。
在攻击后24小时，对照表现出受感染鱼的典型行为异常。鱼聚集在水箱的底部，对食物没有反应或反应迟钝，呈昏睡状态。在对照中死亡发生得要比在接种者中早得多。在攻击后72小时内，在对照中表现出60％的死亡率(图4)。在攻击后96小时，只有一个接种者死亡，没有一条鱼显现感染的体征异常行为。在312小时，相对存活率百分比是83.4。图4显示一段时间内受攻击的接种者和对照的平均葡萄糖值和累积死亡率百分比之间的关系。受感染的对照的血糖水平和死亡率是显著相关(r2＝0.9236，P＝0.0134)。垂死的对照(N＝4)在脑、前肾和肠中显示无乳链球菌培养阳性。
要理解前面详细的描述仅仅是用来举例说明的，可在此处产生修饰和变化而不背离本发明的精神和范围。
权利要求
1.一种组合物，其中包含免疫有效量的分离β溶血性无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的完整灭活细胞和β溶血性无乳链球菌培养物的浓缩提取物。
2.权利要求1的组合物，其中所述β溶血性无乳链球菌是有荚膜的。
3.权利要求2的组合物，其中所述β溶血性无乳链球菌包含具有保藏目录号NRRL B-30607的所有鉴别特征的菌株，包含具有保藏目录号NRRL B-30608的所有鉴别特征的菌株，或者它们的混合物。
4.权利要求1的组合物，其中所述浓缩提取物基本上由β溶血性无乳链球菌的所述培养物的细胞外产物组成。
5.权利要求4的组合物，其中所述浓缩提取物基本上不含有所述β溶血性无乳链球菌的细胞、细胞壁片段和细胞内组分。
6.权利要求1的组合物，其中所述浓缩提取物包含具有大于大约1kDa的分子量的所述β溶血性无乳链球菌培养物细胞外产物。
7.权利要求6的组合物，其中所述细胞外产物具有大于大约2kDa的分子量。
8.权利要求7的组合物，其中所述细胞外产物具有大于大约3kDa的分子量。
9.权利要求6的组合物，其中所述浓缩提取物基本上由所述β溶血性无乳链球菌培养物的细胞外产物组成。
10.无乳链球菌的生物纯培养物，该无乳链球菌具有选自保藏目录号NRRL B-30607和保藏目录号NRRL B-30608中的菌株的所有鉴别特征。
11.保护鱼抵御无乳链球菌的感染的方法，包括给其施用权利要求1的组合物。
12.权利要求11的方法，其中所述鱼选自金体美洲鳊鱼(goldenshiners)、bullminnows、蓝鱼(bluefish)、海湾鲱鱼(gulf menhaden)、海鲶(sea catfish)、胭脂鱼(mullet)、菱体兔齿鲷(pinfish)、细须石首鱼(Atlantic croaker)、spot、weakfish、斑点叉尾鮰(channel catfish)、虹鳟鱼、鳗鱼(eels)、条纹石瓰(striped bass)和其杂交品种、海鲈(sea bass)、真鲷(sea bream)、大菱鲆和罗非鱼。
13.权利要求12的方法，其中所述鱼是罗非鱼。
14.权利要求11的方法，其中通过腹膜内注射或浸浴施用所述组合物。
15.保护鱼抵御无乳链球菌感染的方法，包括给其施用权利要求3的组合物。
16.保护鱼抵御无乳链球菌感染的方法，包括给其施用权利要求4的组合物。
17.保护鱼抵御无乳链球菌感染的方法，包括给其施用权利要求6的组合物。
18.保护鱼抵御无乳链球菌感染的方法，包括给其施用权利要求9的组合物。
19.生产用于保护鱼抵御无乳链球菌感染的疫苗的方法，包括a)提供来自分离β溶血性无乳链球菌的培养物的灭活完整细胞制剂，b)提供来自β溶血性无乳链球菌培养物的细胞外产物的浓缩提取物，和c)将所述灭活完整细胞和所述浓缩提取物以免疫有效的量混合。
20.权利要求19的方法，其中通过将分离的β溶血性无乳链球菌培养物接受化学或物质处理来产生所述灭活的完整细胞制剂，该处理可有效灭活其中将近100％的细胞，而无明显程度的细胞裂解。
全文摘要
由分离的β溶血性无乳链球菌的完整的灭活细胞和β溶血性无乳链球菌的培养物的浓缩提取物制备的组合物对保护鱼抵御相同的菌株和其他无乳链球菌强毒株的感染是有效的。
文档编号A01N63/00GK101068566SQ200580013779
公开日2007年11月7日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月18日
发明者菲利普·H·克雷休斯, 克雷格·A·舒梅克, 乔伊斯·J·埃文斯 申请人:(由农业部部长代表的)美利坚合众国