专利名称：抑制植物病害发生的微生物农药的制作方法
技术领域：
本发明涉及抑制植物病害发生的微生物农药，具体涉及含有昆虫寄生丝状菌蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的微生物农药，和通过将该微生物农药散布于果实、蔬菜等植物或施于植物栽培土壤达到抑制植物致病菌生长和土壤改良的效果的微生物农药。
背景技术：
由于对蔬菜、果实、稻麦、果树等植物的有害生物防治或者对于附在植物根茎的土壤有害生物使用化学物质防治研究的进展，目前，依靠化学杀虫剂、杀菌剂防治占主流。但是，使用化学物质的农药具有优异效果的另一面，可能存在一些，对人畜有毒性、残留于自然环境而给其他生态系统带来影响、更甚的是由于长期使用出现具有抵抗性的病虫害、甚至杀灭大自然存在的天敌反而形成有害生物发生的环境等问题。在这样的情况下，微生物农药被期待作为解决该问题的一个手段。
据报道，微生物农药中可利用的微生物是将植物原有抵抗性活化防治病害的非致病的镰刀菌(例如，参照非特许文献1、特许文献1)、对病原菌具有抗生作用的木霉属(例如，参照非特许文献2)。另外，使用假单胞细菌属细菌防治植物病害的方法是众所周知的，例如，对于茄科植物青枯病(例如，参照特许文献2、特许文献3、特许文献4)、稻属苗立枯病(例如，参照特许文献5)、葡萄孢菌属和青霉属植物病原菌引起的植物病害(例如，参照特许文献6)、革兰氏阳性细菌引起的植物病害(例如，参照特许文献7)、镰刀菌属菌引起的植物病害(例如，参照特许文献8)的防治方法。而且，众所周知，以作为能通过假单胞细菌属细菌防治的菌株对植物病原丝状菌具有抗菌性的假单胞细菌属·SPCGF7菌株(例如，参照特许文献9)、假单胞细菌属·SPCGF878菌株为有效成分的微生物农药(例如，参照特许文献10)，用假单胞细菌属荧光(Pseudomonas fluorescens荧光假单胞菌)细菌处理植物(例如，莴苣)病原菌为假单胞细菌·菊苣(Pseudomonas cichorii菊苣假单胞菌)的腐病防治方法(例如，参照特许文献11)，包含在茄科植物上接种假单胞细菌属产碱杆菌(Pseudomonasalcaligenes产碱假单胞菌)细菌的茄科植物栽培方法(例如，参照特许文献12)。
另外，众所周知，选自属于对禾本科植物尤其育苗中发生的细菌性病原体有拮抗作用的细菌假单胞菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属的细菌作为拮抗菌的微生物农药(例如，参照特许文献13)。而且，据报道，盾壳霉(Coniothyrium)属菌和葚孢霉(Sporidesmium)属菌对菌核病有效，青霉属菌对黄萎病病具有防治效果(例如，参照非特许文献3)。用木霉属菌株的烟草菌核病防治，使用木霉属菌株和粘帚霉(グリオクラデイウム)属菌株对立枯病和斑点病的防治被报道(例如，参照非特许文献4)。已经登记的土壤放线菌剂(细菌剂)是由根瘤病菌的拮抗微生物土壤放线菌84株培养活菌组成的杀菌剂，施于菊花、蔷薇的苗根部有药效，另外，突变处理野生软腐病菌的非致病的欧文氏茵剂(Botokiller)是有效防治白菜软腐病的微生物农药。同样登记的嗜酸枯草芽孢杆菌剂(Botokiller)对植物灰霉病菌有预防效果是公知的(例如，参照非特许文献5)。
众所周知，对于与土壤病害相关的蔬菜土壤病原菌，以前是先用氯化苦(溴化甲烷)等进行土壤消毒，然后将属于木霉属(トリコデルマ)属的微生物收集于用具土壤崩解性的材料制造的容器作为土壤病害防治剂(例如，参照特许文献14)，以及在栽培植物过程中，将属于粘帚霉(グリオクラデイウム)属的真菌和VA菌根菌施用于权利要求植物和/或栽培上壤中，通过属于粘帚霉(グリオクラデイウム)属的真菌固着于植物根际以及VA菌根菌与植物共生防治植物土壤病害的方法(例如，参照特许文献15)。
其他方法，使用昆虫致病的丝状菌进行植物害虫驱避的植物害虫驱避剂(微生物农药)已经登记并上市。其中之一利用蜡蚧轮枝菌的微生物农药，商品名为Vertalec(‘バ-タレツク’)和Mycotal(‘マイコタ-ル’)是可以购买的。丝状菌蜡蚧轮枝菌最初是作为介壳虫(カイガラムシ)寄生菌发现的，之后，可以从蚜虫类、粉虱类、缨翅类等各种各样的昆虫、螨类分离。另外，寄生于异皮线虫、根结线虫、植物病原菌锈菌，白粉菌等具有拮抗作用是公知的(例如，参照非特许文献6)。可以期待的是，利用蜡蚧轮枝菌的微生物农药对于蚜虫类(半翅目)、粉虱类(半翅目)、缨翅类(缨翅目)和叶螨类等有效，尤其是在对于各种各样害虫的抗药性取得较大进展的设施园艺上的利用。
利用蜡蚧轮枝菌的微生物农药可以水合剂的形式制剂化，使用时溶于水散布。在制剂中含有蜡蚧轮枝菌的孢子，其散布后接触害虫，孢子发芽寄生于害虫，之后菌丝在害虫体内生长，直至使充满的害虫死亡。由于以前的蜡蚧轮枝菌菌株在叶面等植物体表面的固着能力小，微生物药剂未直接接触害虫体表而失去寄生能力，因此，当散布该微生物药剂时有必要谨慎地将散布液直接散布于害虫体表。同样，由于直接散布于发生的害虫的必要性，符合害虫发生时机，更要符合害虫发生场所，微生物药剂散布几次是需要的。因此，本发明者专心研究在叶面等植物体表面具有固着能力的丝状菌蜡蚧轮枝菌菌株，结果成功分离了在植物叶面等上具有固着能力比自然界高且在对害虫的致病能力上不亚于以前的蜡蚧轮枝菌的菌株。业就是说，提出了含有新分离的蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)、蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)、蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)那样具有植物体表面固着能力的蜡蚧轮枝菌作为害虫寄生菌的微生物农药(例如，参照特许文献16)。
特许文献1特公平7-096485号公报特许文献2特开平6-9325号公报特许文献3特开平6-86668号公报特许文献4特公平6-17291号公报特许文献5特开平4-104783号公报特许文献6特开平4-77405号公报特许文献7特开平5-310521号公报特许文献8特公平6-6523号公报特许文献9特开平09-255513号公报特许文献10特开平11-187866号公报特许文献11特开2001-247423号公报特许文献12特开2002-233246号公报特许文献1399/016859第二表特许文献14特开平06-024925号公报特许文献15特开平08-225419号公报特许文献16特开2003-335612号公报非特许文献1Baker(贝克)，Hanchey，Dottara植物病理学(Baker，Hanchey，Dottara；Phytopathology)1978年非特许文献2农林水产省登记第7023号非特许文献3生物农药·生长调节剂开发利用手册，LIC非特许文献4Plant Pathology，38，227，1989非特许文献5‘农药手册2001年版’，p352-353，社团法人日本植物防疫协会平成13年11月1日第11版发行非特许文献6‘今月农业’2001，9月号，P72-77发明内容发明所解决的问题本发明的问题是提供，通过将含有对植物病原菌生长抑制有效的丝状菌蜡蚧轮枝菌的微生物农药散布于果实、蔬菜等植物进行植物病害防治的微生物农药，以及用含有丝状菌蜡蚧轮枝菌的土壤病害抑制用微生物农药代替以前的土壤消毒剂即化学药剂氯化苦(溴化甲烷)等，从而提供适用于土壤达到土壤改良效果的土壤改良剂。
解决问题的手段如前所述，本发明者报道了通过事先将具有植物体表面固着能力的蜡蚧轮枝菌作为微生物农药散布于植物，达到对病虫害的高抑制效果，根据进一步地利用该丝状菌的有用性的方法进行专心研究，发现对于附于植物的害虫所有植物病原菌的生长具有显著抑制作用。而且，发现通过将丝状菌蜡蚧轮枝菌施于土壤，起到对附于植物根茎的病原菌的生长抑制效果，在移栽后的土壤中也没有病原菌发生，并且改良土壤，至此本发明完成。
即本发明是(1)一种微生物农药，其特征在于，含有对植物病原菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作为有效成分；(2)一种如前述(1)记载的微生物农药，其特征在于，蜡蚧轮枝菌菌株是具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株；(3)一种如前述(2)记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)；(4)一种如前述(2)记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)；(5)一种如前述(2)记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)；(6)一种如前述(1)-(5)记载的微生物农药，其特征在于，植物病原菌是蔬菜、果实的白粉菌、灰霉菌、枯萎病菌或黄萎病菌；(7)一种如前述(4)或(6)记载的微生物农药，其特征在于，含有对草莓灰霉菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)作为有效成分；(8)关于植物病害抑制方法，其特征在于将前述(1)-(7)记载的微生物农药散布于植物叶面。
本发明也是(9)一种土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有对土壤病害菌有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作为有效成分；(10)一种如前述(9)记载的微生物农药，其特征在于，蜡蚧轮枝菌菌株是具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株；(11)一种如前述(10)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)；(12)一种如前述(10)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)；(13)一种如前述(10)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)；(14)一种如前述(9)-(13)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，土壤病原菌是枯萎病菌或黄萎病菌；(15)一种如前述(11)或(14)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有抑制黄瓜枯萎病菌引起的土壤病害的蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)作为有效成分；(16)一种如前述(13)或(14)记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有抑制番茄黄萎病菌引起的土壤病害的蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)作为有效成分；(17)关于土壤病害的抑制方法，其特征在于，将前述(9)-(16)记载的土壤病害抑制用微生物农药施于植物根附近。
而且本发明是(18)一种土壤改良剂，其特征在于，含有前述(9)-(16)记载的土壤病害抑制用微生物农药作为主要成分；(19)关于土壤改良方法，其特征在于，将前述(18)记载的土壤改良剂施于土壤。
图示通过蜡蚧轮枝菌4菌株和草莓灰霉病菌经两相培养的抑制试验结果。
图示在实验室蜡蚧轮枝菌散布后草莓灰霉侵入部分的程度。
图示在农场蜡蚧轮枝菌接种后草莓灰霉病发病率的结果。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在草莓灰霉病菌感染土壤中的固着性。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在黄瓜根表面的固着性。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在黄瓜根际内的固着性。
以症状重症度指数(DSI)表示本发明蜡蚧轮枝菌对黄瓜枯萎病发病抑制作用。
以鲜植物体重量表示本发明蜡蚧轮枝菌对黄瓜枯萎病的发病抑制作用。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在番茄黄萎病菌感染土壤中的固着性。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在番茄根表面的固着性。
以cfu数表示本发明蜡蚧轮枝菌在番茄根际内的固着性。
以外观病症指数表示本发明蜡蚧轮枝菌对番茄黄萎病的发病抑制作用。
以内部病症度表示本发明蜡蚧轮枝菌对番茄黄萎病的发病抑制作用。
以植物鲜重表示本发明蜡蚧轮枝菌对番茄黄萎病的发病抑制作用。
以植物干重表示本发明蜡蚧轮枝菌对番茄黄萎病的发病抑制作用。
以白粉病菌接种2-4周后的病症变化为病症指数表示本发明蜡蚧轮枝菌对胡瓜白粉病的发病抑制作用。
关于本发明蜡蚧轮枝菌对胡瓜白粉病的发病抑制作用，以对照区和蜡蚧轮枝菌B-2株(50ml处理区)3周后第3叶的患病状况照片显示。
具体实施例方式
本发明微生物农药非特别限制于含有对植物病原菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌菌株作为有效成分的微生物农药，本发明植物病害抑制方法非特别限制于将所述本发明微生物农药散布于植物叶面的方法，同样，本发明土壤病害抑制用微生物农药非特别限制于含有对土壤病害菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌菌株作为有效成分的微生物农药，本发明土壤病害抑制方法非特别限制于将所述本发明土壤病害抑制用微生物农药施于植物根附近，上述植物病原菌例如胡瓜白粉菌、黄瓜属白粉菌等蔬菜、水果的白粉菌，草莓灰霉菌等蔬菜、水果的灰霉菌，其他有黑星病菌，立枯病菌，三叶草菌核病菌，甜菜菌核病菌等，同样，上述土壤病害菌例如黄瓜枯萎病菌等蔬菜、水果的枯萎病菌，番茄黄萎病菌等蔬菜、水果的黄萎病菌，其他有软腐病、甜叶尾腐病、青枯病，根瘤病，辣椒花叶病，苗立枯病，紫纹羽病，白纹羽病，凋萎病，根头癌肿病等这些病。
上述蜡蚧轮枝菌菌株举例有A-1株、A-2株(MAFF238426)、B-1株、B-2株(MAFF238429)、C-1株(MAFF238430)，C-2株、ATCC22611株、ATCC22612株、ATCC58907株、ATCC58908株、ATCC58909株、MAFF235690株、MAFF235693株、MAFF235694株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株等。在这些蜡蚧轮枝菌菌株中，A-1株、A-2株(MAFF238426)、B-1株、B-2株(MAFF238429)、C-1株(MAFF238430)，C-2株等是优选的具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株。其中，‘植物体表面固着能力’是指将菌株散布于植物体表面时菌株在给定时间内固着于植物体表面的能力，‘植物体根表面和/或根际内固着能力’是指将菌株施于植物体根附近时菌株在给定时间内固着于植物体根表面和根际内的能力。这些蜡蚧轮枝菌菌株由独立行政法人农业生物资源研究所的农业生物资源基因库和美国种质保藏中心(タイプカルチヤ-コレクシヨン)得到。
在上述蜡蚧轮枝菌菌株中，B-2株(MAFF238429)对草莓灰霉病菌有效。草莓灰霉病是病原菌葡萄孢属灰霉菌(botrytis cinerea)引起的草莓重要病害。该病害由于用化学农药防治的影响陆续发生耐药性菌，并且成为目前难防治的病害。
另外，A-2株(MAFF238426)对黄瓜枯萎病菌引起的土壤病害有效。黄瓜枯萎病是一种温室栽培中的多发病。引起该病的是FOM(Fusarium oxysporum f.sp.melonis)。该病原菌生活在土壤中，例如不利生存的环境和形成厚膜孢子的环境作为好条件只有4-5年时间，其仍有发病危险性。该病的预防方法是利用化学农药和抗性品种，其中问题在于发现容易具有抗性的新病原菌。
而且，C-1株(MAFF238430)对番茄黄萎病菌引起的土壤病害有效。番茄黄萎病是丝状菌(Verticillium dahliae vdt-2)的土壤污染，开始时下部分叶子部分枯萎，上部分的叶缘弯曲。之后，枯萎的部分黄化，症状主要分布在叶脉。病状进一步由下部分叶子的方向慢慢枯萎。出现导管变色，但不是特别显著。与发生于温室栽培的枯萎病的发生条件相比，大地栽培的多发生于低温、多湿的季节。目前，对于该病的对策是利用化学农药和抗性品种，其中问题在于发现容易具有抗性的新病原菌。
使用一般微生物农药制剂化所用的方法，将本发明蜡蚧轮枝菌菌株制剂化用作微生物农药和土壤病害抑制用微生物农药。例如，含有孢子等的菌体，钙铁石、高岭土等矿物质载体，淀粉、蔗糖、葡萄糖等糖类以及表面活性剂等适当组合并粉剂化，以使用时溶于水散布的水合剂形式制剂化。表面活性剂使用聚氧化乙烯烷基醚和酯、聚氧化乙烯烷基苯基醚和酯、聚氧乙烯烷基酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯，目的是改善散布时菌体的分散性和展着性。
本发明微生物农药是将在叶等植物体表面具有固着性的蜡蚧轮枝菌菌株用于植物病原菌防治，在植物体散布后的固着性上优异的前述菌株使用时，如果散布时间不符合病原菌的发生散布于植物就消除了其抑制作用。因此，本发明微生物农药可以在植物病原菌引起的病害发生之前预先散布，回避其特定的严密散布时间，而且植物病害发生多次也就没有必要散布了。而且，本发明微生物农药施于植物栽培的盆，固着于植物根表面和根际内之后移栽于病原菌(镰刀菌、黄萎病菌)污染土，也抑制土壤病害(枯萎病、黄萎病)发生。因此，与以前的相比，除了散布次数减少之外，共计的植物病害防治费用削减并省力化，而且同时防治植物和土壤病害。同样，以前的是在植物病原菌引起的病害发生之后必需每隔两周散布，本发明微生物农药只散布一次，没必要在植物栽培过程中进一步散布。另外，根际是指植物根周围3mm-5mm处的领域。该领域是土壤与植物接触的领域，从植物也从土壤受到极强的影响。
本发明土壤改良剂非特别限制于含有本发明土壤病害抑制用微生物农药作为主要成分，类似的也适用，本发明土壤改良方法非特别限制于将所述本发明土壤改良剂施用于土壤。本发明土壤改良剂可在土壤病害菌污染前或污染后施用而防治土壤病害菌引起的土壤病害。
以下通过实施例具体说明本发明，但本发明的寄生范围不限定于例子所示的。以下按顺序分别说明实施例1通过蜡蚧轮枝菌对草莓灰霉病的生物控制、实施例2通过蜡蚧轮枝菌对黄瓜枯萎病的生物控制、实施例3通过蜡蚧轮枝菌对番茄黄萎病的生物控制。
实施例1[草莓灰霉病的生物控制](供试微生物)本发明者在以下实验中供试的是分离的蜡蚧轮枝菌A-2株、蜡蚧轮枝菌B-2株、市售的蜡蚧轮枝菌微生物农药Vertalec(バ-タレツク)和Mycotal(マイコタ-ル)的蜡蚧轮枝菌4个菌株。
(在体外培养的蜡蚧轮枝菌的拮抗作用)研究蜡蚧轮枝菌的体外培养在培养基上对草莓灰霉病菌的拮抗性。通过蜡蚧轮枝菌4个菌株和草莓灰霉病菌的两相培养(dual culture)进行试验。草莓灰霉病菌アガ-デイスク置于马铃薯葡萄糖培养基(PDAシグマ公司制)平板的单侧，在马铃薯蔗糖培养基(PSA)上培养过的蜡蚧轮枝菌的アガ-デイスク置于同一平板的另一侧。在25℃下培养5天后测定抑制圈范围(mm)。相同实验进行3次。在奥林巴斯光学显微镜下观察蜡蚧轮枝菌和草莓灰霉病菌之间菌丝的相互作用。
在PDA上使用蜡蚧轮枝菌的草莓灰霉病菌抑制试验结果是蜡蚧轮枝菌所有菌株形成了强的中间抑制圈范围(图1)。图1中分别表示a是A-2株，b是B-2株，c是バ-タレツク，d是マイコタ-ル。抑菌圈范围在5日后可以清晰识别，连续数周时间圈的范围缩小。蜡蚧轮枝菌和草莓灰霉病菌的菌丝相互作用可在两相培养中看到。
(在实验室中草莓灰霉病菌拮抗药剂的控制)健康正常的草莓果实在5％消毒药水(antiformin)中表面杀菌5分钟，用蒸馏水洗净。将拮抗药剂蜡蚧轮枝菌A-2株和B-2株的孢子悬浮液(1×107孢子/ml)和草莓灰霉病菌的悬浮液(1×106孢子/ml)散布于这些草莓果实。用10个果实作为1个处理。散布蒸馏水的果实作为对照。在上述悬浮液和蒸馏水中加入吐温80作为表面活性剂。处理过的果实保持在25℃的温度下置于恒温箱。接种4天后，由图象推测各草莓果实病变部位，根据灰霉侵入范围计算(％)以0-5点进行接种处理过的果实的点数评价。0＝在各果实中灰霉侵蚀部分为0％，1＝＞0＝＜20％，2＝＞20＝＜40％，3＝＞40＝＜60％，4＝＞60＝＜80％，5＝＞80％。
用蜡蚧轮枝菌处理果实时灰霉指数仅为0.9-1.0(图2)。可以看出所有菌株的结果和用蒸馏水得到的结果有显著差别。在用蜡蚧轮枝菌处理过的果实中，灰霉指数较低，这些果实覆盖其他的霉。
在农场中天然型灰霉病的控制)在5月23日(2003年)，以列间隔为1m，苗间隔为40cm种植草莓的“エラン(Eran)”品种的苗。各实验地由每2列各2棵苗共计4棵构成。接种蜡蚧轮枝菌悬浮液1×107孢子/ml。在对照苗中，散布自来水，散布抗病虫害剂百菌清(杀菌剂)和高灭磷(杀虫剂)(住化武田农药(股份)制)的混合物。加入悬浮液1L，表面活性剂20ml(优选之一为20ml吐温80)。悬浮液于7月11日、7月25日、8月8日和8月22日的傍晚涂敷。成熟的果实主要以每周2次，有时每周3次，收获后计算果实总数和感染果实数。
结果显示蜡蚧轮枝菌B-2株具有最佳拮抗性(图3)。B-2株将灰霉病发病率抑制至5.0％，バ-タレツク和マイコタ-ル也显示了抑制作用。此外，研究在实施实验过程中普遍具有的平均温度和相对湿度与灰霉发病率的平均值相关，还有草莓灰霉病菌的发病率与相对湿度相关。
实施例2[黄瓜镰刀菌枯萎病的生物控制](供试微生物)用表1列举的包括市售的バ-タレツク和マイコタ-ル，蜡蚧轮枝菌的分离株20株供试。该真菌于暗处25±1℃下在马铃薯蔗糖几丁质琼脂(PSCA1升中，马铃薯200g、蔗糖20g、几丁质10g，琼脂20g)平板上培养2周，之后在湿润条件下于园艺用土壤和麦麸(4∶1，w/w)中将这些菌株繁殖2周。其他方法是由十胜农业试验场的黄瓜果木上分离黄瓜镰刀菌枯萎病菌(FOM)。在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上维持在5±1℃繁殖该病原菌。
(供试植物)在全部实验中使用容易感染黄瓜镰刀菌枯萎病菌(FOM)的黄瓜品种“キングメルテイ-”。在移栽于盆之前，种子在暗室的petrel培养皿生长2日的时间。这些盆处于调节好温度和湿度的温室下生长。
(在体外培养的蜡蚧轮枝菌的拮抗作用)研究蜡蚧轮枝菌的体外培养在培养基上对黄瓜镰刀菌枯萎病菌的拮抗性。通过蜡蚧轮枝菌20个菌株和黄瓜镰刀菌枯萎病菌的两相培养(dual culture)进行试验。黄瓜镰刀菌枯萎病菌的琼脂糖培养基置于马铃薯葡萄糖培养基(PDAシグマ公司制)平板的一侧，在马铃薯蔗糖培养基(PSA)上培养过的蜡蚧轮枝菌的琼脂糖培养基(アガ-デイスク)置于同一平板的另一侧。在25℃下培养10天后测定抑制圈范围(mm)。相同实验进行3次。在奥林巴斯光学显微镜下观察蜡蚧轮枝菌和黄瓜镰刀菌枯萎病菌之间菌丝的相互作用。
蜡蚧轮枝菌的体外培养对黄瓜镰刀菌枯萎病菌的拮抗性试验结果如表1所示。由表1可知，蜡蚧轮枝菌的A-2株、B-1株、C-1株和MAFF235693株显示了强抑制圈范围。
(菌落在土壤、根表面和根际的形成)该实验使用蜡蚧轮枝菌分离株20个菌株。用这20个菌株处理过的20种处理土壤分别加入非杀菌土壤(3％)。非杀菌土壤作为对照区。黄瓜种子以每3颗1盆种植(3个重复)。30日后用稀释平板法检测这些菌落。拔出各盆苗3棵中的2棵的根。在试管中，这些根在5ml蒸馏水中震荡1分钟。在加有45ml蒸馏水的锥瓶中加入5g根际土壤。根和土壤分别稀释4倍和3倍。在含有硫酸链霉素的二碘曙红琼脂培养基中滴入1ml悬浮液，在25℃下培养3天。培养后，计算蜡蚧轮枝菌菌落。所有实验各进行3次。
在土壤、根表面和根际内检测蜡蚧轮枝菌菌落。菌落(cfu)数的结果分别如图4-6所示。在土壤中，检测全部菌株，充分显示高的菌落形成能力(图4)。其中，ATCC22612株、A-2株和A-3株超过5×108cfu/g。在根表面，A-2株和B-1株具有高的菌落形成能力和优异的固着性(图5)。同样，在根际，MAFF235701株，ATCC58908株，ATCC22612株也可以形成其大规模菌落和优异的固着性(图6)。
(温室内的接种实验)在该实验中，使用6株蜡蚧轮枝菌(MAFF235690、MAFF235693、ATCC58908、A-2、B-2和C-1)。种子在陪替式培养皿中生长，在装满约16g苗培养土(タキイ种苗公司制)的盆中，移栽于含有混入3％蜡蚧轮枝菌培养液的处理土壤的各雅致的盆(日本阪田种苗公司制6cm)。苗生出子叶时，这些盆加入1％病原菌FOM感染土壤移于塑料浅盘。这些植物置于温室30日后，以症状重症指数(DSI)和植物鲜重量评价。DSI(％)是由立枯叶数/全部叶数×100得出。在各植物中，基于植物叶外观评价，0等级植物为健康正常，100等级的植物为死亡，进行0-100等级区分。
根据以前的实验，由于拮抗作用显著，选择蜡蚧轮枝菌的3株(MAFF235690株、MAFF235693株和ATCC58908株)。另外，通过本发明者的研究进行的评价，该实验使用在叶表面具有菌落形成能力的3株(A-2株、B-2株和C-1株)。这6个菌株显示了优异的生物控制作用(图7)。移栽于盆16日后，除了控制区以外，病原体控制区以及所有株感染FOM。从第24日开始病原体控制显示急剧的损害，DSI值最终为80％。在蜡蚧轮枝菌株中，A-2株控制的最好。不是只有A-2株，而且B-2株、ATCC235693株、MAFF58908株在初级阶段可以充分控制。由病原体控制而得的植物鲜重量(图8)是每棵植物0.7g。与其相比较，由控制而得的植物鲜重量(图8)是每棵植物4.5g。以A-2株处理的植物鲜重量为每棵植物2.0g。
实施例3[番茄黄萎病的生物控制](供试微生物)与实施例2相同，以表2列举的含有市售的バ-タレツク和マイコタ-ル，蜡蚧轮枝菌的分离株20株供试。
(在体外培养的蜡蚧轮枝菌的拮抗作用)研究蜡蚧轮枝菌的体外培养在培养基上对番茄黄萎病菌的拮抗性。通过蜡蚧轮枝菌20个菌株和番茄黄萎病菌的两相培养(dual culture)进行试验。番茄黄萎病菌琼脂糖培养基置于马铃薯葡萄糖培养基(PDAシグマ公司制)平板的单侧，在马铃薯蔗糖培养基(PSA)上培养过的蜡蚧轮枝菌的琼脂糖培养基置于同一平板的另一侧。在25±0.1℃下培养3周后测定抑制圈范围(mm)。相同实验进行3次。在奥林巴斯光学显微镜下观察蜡蚧轮枝菌和番茄黄萎病菌之间菌丝的相互作用。
蜡蚧轮枝菌的体外培养对番茄黄萎病菌的拮抗性试验结果如表2所示。通过蜡蚧轮枝菌菌落以围拢抑制圈可限制病原体的生长，可以清楚看到其抑制作用。由表2可知，除了ATCC22611株、ATCC58908株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株之外，蜡蚧轮枝菌菌株显示了对番茄黄萎病菌(V.Dahliae)的抗真菌活性。尤其是，バ-タツク株、B-1株、B-2株、MAFF 235690株、ATCC58907株显著抑制番茄黄萎病菌的生长。
(菌落在土壤、根表面和根际的形成)该实验使用蜡蚧轮枝菌分离株20个菌株。用这20个菌株处理过的20种处理土壤分别加入非杀菌土壤(3％)。非杀菌土壤作为对照区。番茄种子以每3颗1盆种植(3个重复)。在25℃下生长4周后用稀释平板法检测这些菌落。拔出各盆苗3棵中的2棵的根。在试管中，使用附有这些土壤的根5g和蒸馏水，为了根表面真菌菌落游离于水中，使用(超微波清洗机)super micro wave washing machine将这些根搅拌1分钟。另外，用搅拌机将附着的土壤搅匀。搅拌后的根和土壤用灭菌蒸馏水连续稀释，在含有硫酸链霉素的二碘曙红琼脂培养基中滴入1ml悬浮液，在25℃下培养3天。培养后，计算蜡蚧轮枝菌菌落。各实验各进行3次。
在土壤、根表面和根际内检测蜡蚧轮枝菌菌落。菌落(cfu)数的结果分别如图9-11所示。在土壤中，检测所有菌株，充分显示高的菌落形成能力(图9)。其中，ATCC22612株、A-1株、A-3株、C-1株、ATCC589095株显示了高的菌落形成能力，Vertalec(バ-タレツク)株、ATCC58908株、MAFF235701株显示了高的菌落形成能力。在根表面，B-2株、A-3株、ATCC22612株、ATCC58909株、MAFF235696株、MAFF235699株、MAFF235701株在1.83×104-2.29×104孢子/ml时具有高的菌落形成能力和优异的固着性(图10)。同样，在根际，B-2株、C-1株、Vertalec(バ-タレツク)株、ATCC58908株、MAFF235690株和MAFF235696株在0.67×105-0.73×105孢子/ml时具有高的菌落形成能力和优异的固着性(图11)。
(温室内的接种实验)在该实验中，使用6株蜡蚧轮枝菌株(MAFF235690、ATCC58908、A-2、B-2、B-1和C-1)。种子在陪替式培养皿中生长，在装满约16g苗培养土(日本阪田种苗公司制)的盆中，移栽于含有混入3％蜡蚧轮枝菌培养液的处理土壤的各雅致的盆(日本泷井公司制；6cm)。苗生出子叶时，这些盆加入5％病原菌(V.dahliae)感染土壤200g移于塑料浅盘。这些植物置于20-25℃的温室10周。准备用番茄黄萎病菌处理(pathogen)或未处理的苗(control)作为对照。实验结束时回收茎和叶，测量鲜重量和干重量。在各处理中进行3次重复，每次重复由4棵植物构成。利用许多枯茎以外观病症指数和内部病症度评价茎的病症。为了该实验的对照与其他处理比较成长，播种2周后注入V.Dahliae悬浮液1ml，另外播种8周后注入ハイポネツクス(HYPONeX)(1ml/盆)。上述外观病症指数为枯萎茎数/全部茎数×100得到，内部病症是基于植物变色程度以0-3等级进行评价。
根据以前的实验，由于拮抗作用显著，选择蜡蚧轮枝菌的2株(MAFF235690株和ATCC58908株)。另外，在本发明者的研究中进行评价，该实验使用在叶表面具有菌落形成能力的4株(A-2株、B-2株、B-1株和C-1株)。其结果如图12(外部病症指数(％))和图13(内部病症度)所示。这些菌株显示了优异的生物控制作用(图12，13)。移栽于盆后，除了控制区以外，病原体控制区以及所有株感染番茄黄萎病菌。蜡蚧轮枝菌C-1株对番茄黄萎病的枯萎抑制作用最有效。B-1株、MAFF235690株对初期阶段番茄黄萎病的枯萎有效。与病原菌对照相比较，B-1株显示了番茄实际生长的鲜重量(g/植物)和干重量(g/植物)的增加(图14，15)。由于蜡蚧轮枝菌菌株减少了内部病症的重症度，结果大致等于外观病症发生率。与病原体对照相比较，全部菌株显著地显示了内部病症数的减少。然而，B-2株和C-1株与对照同样显示了内部病症重症度的减少。
实施例4[在体外培养的蜡蚧轮枝菌的拮抗作用]与实施例1-3相同，研究体外培养的蜡蚧轮枝菌的拮抗作用。其结果显示了蜡蚧轮枝菌B-2株对胡瓜白粉病和黄瓜白粉病的强拮抗作用，显示了蜡蚧轮枝菌A-2株对胡瓜白粉病的拮抗作用。
实施例5[胡瓜白粉病的生物控制](供试微生物)供试微生物使用蜡蚧轮枝菌B-2株(Verticillium lecanii B-2)。
(温室内的接种实验)在该实验中，使用在盆内生长的胡瓜叶3片作为供试植物。在供试植物根周围土壤中，使用蜡蚧轮枝菌B-2株孢子(孢子浓度为1×107/ml)，以1株用10ml或50ml的量处理。对照区(控制)使用未处理。对于用蜡蚧轮枝菌B-2株孢子处理的植物，处理后，24小时后在叶面上散布胡瓜白粉病菌孢子(104的分生孢子/ml)，接种(接种叶)，接种后，2-4周后观察病症变化。另外，同样地，对于对照区植物，在叶面上散布胡瓜白粉病菌孢子(104的分生孢子/ml)，接种，接种后，2-4周后观察病症变化。进一步地，对于用蜡蚧轮枝菌B-2株孢子处理的植物和对照区植物，进行胡瓜白粉病菌孢子接种(未接种叶)，2-4周后观察病症变化(通过白粉病菌空气污染的患病观察)。
(病症的变化)上述接种实验的结果如图16和图17所示。在图16中，胡瓜白粉病菌接种后，在图表中病症指数表示2-4周后病症变化。由图16可知其与对照区有显著差别。在图17中，对于对照区与蜡蚧轮枝菌B-2株(50ml处理区)，照片显示其3周后第3叶的患病状况。
产业上利用的可能性本发明含蜡蚧轮枝菌的微生物农药通过施于植物抑制地上部植物病原菌生长，同样，本发明含蜡蚧轮枝菌的土壤病害抑制用微生物农药通过施于植物根附近也抑制土壤病害镰刀菌病(Fusarium病)、黄萎病(Verticillium病)等发病、防治植物生长的周围环境中的病害。
权利要求
1.一种微生物农药，其特征在于，含有对植物病原菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作为有效成分。
2.一种如权利要求1记载的微生物农药，其特征在于，蜡蚧轮枝菌菌株是具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株。
3.一种如权利要求2记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)。
4.一种如权利要求2记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)。
5.一种如权利要求2记载的微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)。
6.一种如权利要求1-5任一记载的微生物农药，其特征在于，植物病原菌是蔬菜、果实的白粉菌、灰霉菌、枯萎病菌或黄萎病菌。
7.一种如权利要求4或6记载的微生物农药，其特征在于，含有对草莓灰霉菌具有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)作为有效成分。
8.一种植物病害抑制方法，其特征在于将权利要求1-7任一记载的微生物农药散布于植物叶面。
9.一种土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有对土壤病害菌有生长抑制作用的蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的菌株作为有效成分。
10.一种如权利要求9记载的微生物农药，其特征在于，蜡蚧轮枝菌菌株是具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株。
11.一种如权利要求10记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)。
12.一种如权利要求10记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌B-2株(MAFF238429)。
13.一种如权利要求10记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株是蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)。
14.一种如权利要求9-13记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，土壤病原菌是枯萎病菌或黄萎病菌。
15.一种如权利要求11或14记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有抑制黄瓜枯萎病菌引起的土壤病害的蜡蚧轮枝菌A-2株(MAFF238426)作为有效成分。
16.一种如权利要求13或14记载的土壤病害抑制用微生物农药，其特征在于，含有抑制番茄黄萎病菌引起的土壤病害的蜡蚧轮枝菌C-1株(MAFF238430)作为有效成分。
17.一种土壤病害的抑制方法，其特征在于，将权利要求9-16任一记载的土壤病害抑制用微生物农药施于植物根附近。
18.一种土壤改良剂，其特征在于，含有权利要求9-16记载的土壤病害抑制用微生物农药作为主要成分。
19.一种土壤改良方法，其特征在于，将权利要求18记载的土壤改良剂施于土壤。
全文摘要
本发明提供了通过将含有对植物病原菌具有生长抑制作用的丝状菌蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的微生物农药散布于水果、蔬菜等植物上进行植物病害防治的微生物农药，以及在土壤中使用含有丝状菌蜡蚧轮枝菌的土壤病害抑制用微生物农药达到土壤改良效果的土壤改良剂。由于丝状菌蜡蚧轮枝菌优选具有植物体表面固着能力的菌株和/或具有植物体根表面和/或根际内固着能力的菌株作为微生物农药应用于植物，其对于附于植物的害虫所有植物病原菌的生长具有显著抑制作用，而且，通过施于土壤，起到对植物根茎及其根际的病原菌的生长抑制作用，在移栽后的土壤中也没有病原菌发生，从而改良土壤。
文档编号A01N63/00GK1946298SQ200580013349
公开日2007年4月11日 申请日期2005年4月27日 优先权日2004年4月28日
发明者小池正德, 吉田早苗, 阿部伦子, 浅野健治 申请人:独立行政法人科学技术振兴机构