一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株ZY122及其应用的制作方法

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体地，涉及一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株zy122及其应用。

背景技术：

水稻作为世界三大主粮之一，是全球约50%人口的主粮。其主要集中分布在热带或亚热带的高温多雨地区，如我国长江流域、珠江三角洲和四川盆地，中南半岛等，其中近90%产于亚洲。目前世界水稻种植面积约15500万公顷，我国水稻种植面为3100万公顷，约占世界种植面积的20%；我国的水稻总产量居世界第一，单产居世界第五。水稻在我国主要分布于六大产区，分别为：华南双季稻作带；华东、华中单双季稻作带；西北干燥稻作带；华北单季稻作带；东北早熟稻作带和西南高原稻作带。随着人口不断的增加，我国对稻谷的需求量也越来越大，如何保障稻米生产和消费的平衡已经给我国稻米产业的发展提出严峻挑战。在我国淡水资源紧张、劳动力短缺和生产成本增加等因素的影响下，水稻种植增粮与增收矛盾日益突出，再加上全球气候及生态环境日益恶化，导致水稻的各种病虫害呈现增加的态势。

水稻纹枯病是当前水稻生产上的主要病害之一，该病是由瓜亡革菌thanatephoruscucumeris所引起，瓜亡革菌thanatephoruscucumeris属担子菌亚门真菌，发生范围广、危害严重、防治困难。该病使水稻不能抽穗，或抽穗的秕谷较多，粒重下降。对于水稻纹枯病的防治既有传统的化学药剂，也有新兴的生物防控技术。国内涉及到水稻纹枯病的专利技术约有400余项，其中化学药剂相关的专利约占60%；生物技术约占30%；化学与生物防治两者结合的专利技术约占10%。

芽孢杆菌广泛地存在于自然界，具有繁殖快速、代谢快的特点；该属细菌的重要特性是能够产生对不利条件具有特殊抵抗力的芽孢。它们也存在于土壤、植物组织内、水和空气中，与自然界物质转化、土壤肥力、环境卫生均密切相关。同时它们对有机质分解力强，增殖的同时，会释出高活性的分解酵素，合成多种有机酸、酶、生理活性等物质，及其它多种容易被利用的养分，促进作物生长。随着土壤的生物多样性退化及土壤碱化，芽孢杆菌能够在逆境中存活和生长，为土壤提供各种酶类和增加土壤微生物的多样性。植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌。其普遍存在于高等植物中，木本、草本植物，单子叶植物和双子叶植物内均有内生细菌。内生菌不仅可以给植物提供所需营养物质及一些激素，对植物的生长发育、抵抗病虫侵袭及不良环境等具有广泛的生物学作用，还可以增强植物抗逆境、抗病虫害的能力，目前已成为生物防治中有潜力的微生物农药、增产菌或作为潜在的生防载体菌而加以利用。

内生菌存在于植物体内，可在植物体内长期定殖并传导，不易受外界环境条件的影响，有研究显示，51％的从植物内生菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合物，这对抗菌活性物质来源的新领域的开发将具有十分重大的经济意义。筛选能够对病原菌有拮抗作用的芽孢杆菌在病害的生物防治、促进作物生长、改善土壤生态环境等方面具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株zy122，本发明提供的内生芽孢杆菌菌株zy122可用于抑制水稻纹枯病，其对水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌率可达81.9％，防治效果可达70.0％以上。

本发明的另一目的在于提供上述内生芽孢杆菌菌株zy122在水稻纹枯病的生物防治中的应用。

本发明的另一目的在于提供内生芽孢杆菌菌株zy122在制备抑制水稻纹枯病的生物制剂中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种具有抑制水稻纹枯病的的生物制剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株zy122(bacillusvanilleazy122)，所述菌株于2017年4月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为广州市先烈中路100号，保藏编号为gdmccno.60161。

本发明中所述菌株含有如seq1所示的16srdna基因序列。

本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122菌落形态特征：该菌株在lb培养基上生长速度较快（37℃，20h），呈灰白状，为黏液型菌株，细胞微透明，呈（长1.3～1.8um宽0.4～0.7um）杆状，菌落中间有凸起，能够产生芽孢，周生鞭毛。

本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122的生理生化特性：

革兰氏阳性菌，兼性厌氧，ph生长范围ph4.0～8.0（最佳为5.0～7.0），耐nacl可在0～8%(w/v)条件下可生长（最佳为1～4%），可适应生长温度区间为20～45℃（最佳为28～7℃），dna的g+c含量为46.4mol%。产氨试验、乙酰甲醛甲醇测定均为阳性；尿酶试验、甲基红测定、过氧化氢酶试验、柠檬酸利用试验为阴性。能高效利用龙胆二糖、α–d–乳糖、β–甲基–d–葡萄糖苷、肝糖、d-木糖作为碳源，而以阿拉伯糖、蜜二糖、海藻糖和松二糖作为碳源则生长缓慢。菌株对50μg/ml氨苄青霉素、100μg/ml链霉素、300μg/ml四环素均具有耐受性；而对卡拉霉素、庆大霉素、氯霉素，新霉素、红霉素耐受性差、低浓度（5μg/ml）的这几种抗生素就能抑制其生长。

本发明提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122经16srdna序列比对(ezbiocloud数据库)与bacillusvanilleaxy18(t)芽孢杆菌的同源性为99.42%；该菌株的16srdna序列如序列表所示。

本发明芽孢杆菌bacillusvanilleazy122的分子分类地位的确定：

采用细菌16srrna基因通用引物25f和1492r进行扩增，将pcr产物直接进行序列测定。将获得的dna序列输入ezbiocloud进行比对，初步确定本发明的菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的芽孢杆菌属于芽孢杆菌属bacillus，与bacillusvanilleaxy18(t)芽孢杆菌的同源性为99.42%，但二者的序列不完全一致，有0.58%的差异，表明二者是同种内不同的菌株。结合上述的生理生化特性、16srdna序列分析，本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122应归属于芽孢杆菌属bacillus。

本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122可用于水稻纹枯病的生物防治。更具体地，所述芽孢杆菌菌株zy122可应用于抑制水稻纹枯病病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris。芽孢杆菌bacillusvanilleazy122对水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris抑菌率可达81.9％，对水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris防治效果可达70.0％以上。

上述内生芽孢杆菌菌株zy122在制备抑制水稻纹枯病的生物制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

一种具有抑制水稻纹枯病的的生物制剂，所述生物制剂中含有权利要求1所述内生芽孢杆菌菌株zy122。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过采用选择性培养基，以水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌为防治对象，对生长于长期未施肥的健康野生稻植株中存在的拮抗内生细菌进行分离、纯化，得到一株拮抗水稻纹枯病的芽孢杆菌，为水稻纹枯病的生物防治奠定了基础。本发明提供的内生芽孢杆菌菌株zy122的合理应用可以减少化学药剂对环境造成的污染，有利于保护生态平衡，对水稻的栽培和增收增产都能够起到很大的提高和促进作用，具有一定的研究意义。

附图说明

图1为实施例1提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122在lb培养基上稀释涂布的菌落图片；

图2为水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris对照组在pda培养基上的生长图；

图3为实施例1提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122对病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的拮抗效果图；

图4为实施例1提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122全基因组dna及16srdna的pcr产物1%的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合图表对本发明的技术方案作进一步的说明，但此说明并不做任何形式方面的限定，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1芽孢杆菌bacillusvanilleazy122的分离、筛选以及分子分类学地位的确定本实施提供的抑制水稻纹枯病的生防菌株芽孢杆菌bacillusvanilleazy122保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址广州市先烈中路100号，保藏日期为2017年4月11日，保藏编号为gdmccno.60161。

本实施方式的芽孢杆菌bacilluszy122来源于广西梧州野生稻田，采用选择性培养基对野生稻健康植株进行内生细菌分离获得，具体方法如下：

（1）野生稻内生菌的分离

将采集的野生稻材料用蒸馏水洗净，选取适量的根、茎、叶组织，用无菌剪刀剪成碎片状，放入无菌培养皿中，用75％乙醇浸泡3min，然后在2％naclo溶液中浸泡3min，取出后用无菌水冲洗3次，每次5min，最后一次清洗的无菌水涂布lb，作为对照检测是否材料消毒彻底。在无菌研钵内加入无菌水研磨成匀浆，将匀浆稀释十倍以后，用移液枪分别吸取100ul至无菌lb固体平板上，涂抹均匀后放入37℃恒温培养箱培养，观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势好且形态不同的菌苔，用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色（石碳酸复红染色）和显微镜镜检（油镜），进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。纯化后的菌株于15%的甘油中-20℃和-80℃分别保存。

（2）内生菌拮抗水稻纹枯病原菌的初筛

采用平板对峙法对野生稻内生菌拮抗纹枯病病原真菌进行初筛。将水稻纹枯病病原菌用无菌水制成浓度为10⁸/ml^-1的菌悬液，取20ul平板涂布在pda培养基上，然后在涂布的pda平板上划十字线分出4个区域，在每个区域中心分别用无菌牙签接入少量已纯化出的野生稻内生菌，放于28℃恒温培养箱中培养，5天后观察记录抑菌圈的有无及大小，共重复3次。选出抑菌圈宽度最大的5株内生菌进行复筛。

（3）内生菌拮抗水稻纹枯病原菌的复筛

采用平板对峙法对内生菌拮抗病原真菌进行复筛。将水稻纹枯病病原菌用无菌水制成浓度为10⁸/ml^-1的菌悬液，然后取20ul在pda培养基上涂布，在已涂布平板上划十字线分出4个区域，每个区域中心分别用无菌牙签接入初步筛选出来有拮抗作用的内生菌，设无菌水为对照，重复3次。置于28℃恒温条件下培养，5天后观察抑菌效果，测量抑菌圈大小。选出效果最好的一株菌，保存备用。

抑菌率(％)＝(处理组抑菌圈直径－对照组抑菌圈直径/处理组抑菌圈直径)×100％

本实施例中所应用的培养基配方如下：

lb培养基：酵母提取物5g、细菌学蛋白胨10g、nacl5g、agar20g、无菌水1l，ph=7.0。

pda培养基：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、agar20g、无菌水1l，自然ph。

图1为本实施例提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122在lb培养基上稀释涂布的菌落图片，左图为菌落背面照，右图为菌落正面照。由图1可观察到本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122菌落形态特征：该菌株在lb培养基上生长速度较快（37℃，20h），呈灰白状，为黏液型菌株，细胞微透明，呈（长1.3～1.8um宽0.4～0.7um）杆状，菌落中间有凸起，能够产生芽孢，周生鞭毛。

图2为水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris对照组在pda培养基上的生长图，左图为瓜亡革菌正面照，右图为瓜亡革菌背面照；图3为芽孢杆菌bacillusvanilleazy122对水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌效果图，左图为抑菌正面照，右图为抑菌背面照。芽孢杆菌bacilluszy122对水稻纹枯病的病原菌瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的抑菌率可达81.9％。

（4）芽孢杆菌bacillusvanilleazy122的分子分类学地位的确定

挑取拮抗芽孢杆菌bacillusvanilleazy122接种于lb固体培养基中，12h后收集菌体并提取菌株基因组dna，用1%琼脂糖电泳验证dna组片段的大小。图4为本实施例提供的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122全基因组dna及16srdna的pcr产物1%的琼脂糖凝胶电泳图，其中左图为全基因组dna的1%琼脂糖凝胶电泳图，右图为16srdna的pcr产物1%的琼脂糖凝胶电泳图。由图4可知：左图中全基因组的电泳条带单一清晰，全基因组大于10000bp；右图中的pcr产物的电泳条带单一清晰，片段长度约为1500bp左右。

以基因组dna为模板，应用细菌16srdna基因通用引物：上游引物5’-agagtttgatc-ctggctcag-3’和下游引物5’-aaggaggtgatccagcc-3；

pcr反应体系：10×pcrbuffer2.5μl，dntp2.0μl，上下游引物各0.5μl，dna模板1.0μl，taqdna聚合酶0.2μl，补双蒸水至25μl。pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1.5min，循环扩增30次：最后72℃延伸10min。用1%琼脂糖电泳验证pcr产物dna片段的大小，如图4可知，芽孢杆菌bacillusvanilleazy122dnapcr产物通过凝胶电泳扩增到单一条带，条带清晰，大小约为1500bp。将pcr产物委托北京擎科新业生物技术有限公司进行测序，获得的dna序列输入genbank进行blast比对，初步确定本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现所述的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122，与bacillusvanilleaxy18(t)芽孢杆菌的同源性为99.42%，结合上述形态学特征、生理生化特性、16srdna系统发育分析及文献查阅，本发明的芽孢杆菌bacillusvanilleazy122应归属于芽孢杆菌属bacillus。

测序结果如下：

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本实施例中的病原菌为从水稻茎基部分离得到的瓜亡革菌thanatephoruscucumeris。

实施例2芽孢杆菌bacillusvanilleazy122在水稻纹枯病的生物防治中的应用

本实施方式中芽孢杆菌bacillusvanilleazy122可用于水稻纹枯病的生物防治，防治效果实验如下：

设置三个实验组进行盆栽实验，分别为健康对照组、感病对照组和防治组，每组20株水稻。用瓜亡革菌thanatephoruscucumeris配置成浓度为1×10⁸个/ml的孢子悬浮液。将水稻进行表面消毒后，用针刺法对健康对照组注入20μl无菌水，感病对照组和防治组各注入20μl瓜亡革菌悬浮液后接种于花盆中。并将防治组植株根部浇灌3ml拮抗芽孢杆菌培养液(浓度为0.6×10⁷～1×10⁹cfu/l)。保证每个实验组的水稻在阴凉通风处生长，每天进行浇灌，15d后观察并记录水稻发病情况。

防治效果＝(感病组植株数-对照组感病植株数-防治组感病植株数)/接种植株数×100％。

表1芽孢杆菌bacillusvanilleazy122抑制瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的测试

据实验结果可知，芽孢杆菌bacillusvanilleazy122对瓜亡革菌thanatephoruscucumeris的防治效果可达70.0％以上。

sequencelisting

<110>华南农业大学

<120>一株具有抑制水稻纹枯病的内生芽孢杆菌菌株zy122及其应用

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<212>dna

<213>芽孢杆菌bacillusvanilleazy122的16srdna

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