一种防治植物病害的生防菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物防治和生物工程技术领域，具体涉及一种防治植物病害的生防菌 株、由上述菌株制备的植物病害防治剂、防治植物病害的方法、以及上述菌株或植物病害防 治剂的应用。
【背景技术】
[0002] 伴随着农业经济的迅猛发展，农业生产中的植物病虫害防治越来越依赖于化学农 药的广泛应用。但是在化学农药大量使用的同时，环境污染问题也随之而来，由此人们对现 代农业的防治技术提出了更高的要求。生防农药作为一种新型的绿色农药，以其安全可靠、 不污染环境、抗菌效果好的特点，近年来受到世界各国的广泛关注，因此寻找有效的生防菌 株也成为人们日益关注的热点。
[0003] 鉴于此，克服以上现有技术中的缺陷，提供一种新的防治植物病害的生防菌株成 为本领域亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种防治植物病害的生防菌 株、由上述菌株制备的植物病害防治剂、防治植物病害的方法、以及上述菌株或植物病害防 治剂的应用。
[0005] 本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：
[0006] -种防治植物病害的生防菌株，该菌株为保藏号为CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢 杆菌 SY-BA2。
[0007] 本发明第二方面提供了一种植物病害防治剂，其包括上述的保藏号为CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢杆菌SY-BA2。
[0008] 优选地，包括保藏号为CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株的营养细胞 或完整培养物。
[0009] 优选地，包括保藏号为CCTCC Μ 2015385的枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株的培养物浓 缩物或细菌悬液或发酵液或发酵清液。
[0010] 优选地，由SY-BA2菌株的发酵液、载体、湿润剂和分散剂混合后干燥制成，其中， 所述发酵液中活菌数量在1X 10scfu/mL~1X K^cfu/mL，所述载体与所述发酵液重量比 为1:1~1:5,所述载体与所述湿润剂重量比为1:0. 0001~1:0. 1，所述载体与所述分散剂 重量比为1:0. 0001~1:0. 1。
[0011] 优选地，所述载体选自娃藻土、高岭土、膨润土、稻壳粉、草炭土、白炭黑、轻质碳酸 钙、凹凸棒土或滑石粉，所述湿润剂选自十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸 盐中的一种或多种；所述分散剂选自烷基萘磺酸盐缩聚物钠盐、羧甲基纤维素钠中的一种 或多种。
[0012] 本发明第三方面提供了一种防治植物病害的方法，其特征在于，将上述的菌株或 上述的植物病害防治剂施用给植物以防止植物受到植物病原菌的侵染。
[0013] 优选地，所述植物病害选自玉米锈病、小麦白粉病、黄瓜霜霉病或黄瓜炭疽病。
[0014] 优选地，所述菌株或植物病害防治剂施用时作用于植物的叶、生根区和/或种子。
[0015] 本发明第四方面提供了上述菌株或上述的植物病害防治剂在植物病害防治中的 应用。
[0016] 本发明的枯草芽孢杆菌菌株以及植物病害防治剂生防效果好、生产成本低廉、易 于生产、实际应用操作简单、对化学药剂难以防控的土传病害防治效果明显，在无公害大田 作物和蔬菜种植中可发挥重要作用。
【具体实施方式】
[0017] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施例对本 发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用 于限定本发明。
[0018] 术语"发酵培养液"是指液体培养基；术语"发酵液"是指菌株在液体培养基中发 酵培养一段时间后所形成的液体（包括了培养液）；术语"发酵清液"是指发酵液离心去除 菌体沉淀后所得上清液；术语"细菌悬液"是发酵液经过离心处理后收集沉淀（菌株培养 物或菌体），将沉淀溶于水或缓冲液中，经过震荡或吹打使得沉淀状的菌株培养物悬浮起来 所形成的均一的悬浊液。
[0019] 当将本发明的枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株用于防治植物病害时，通常可以使用枯 草芽孢杆菌SY-BA2菌株的营养细胞、完整培养物等。可以通过常规方法培养属于枯草芽孢 杆菌SY-BA2菌株以获得培养物，再由上述培养物制备植物病害防治剂。例如，通过对完整 培养物按照原状进行冷冻干燥可以将所得完整培养物制备成完整培养物粉末。再例如，可 以通过下列步骤将营养细胞制备成细胞沉淀：在培养后离心整个培养物以去除污染物，进 一步离心所得上清液，然后洗涤沉淀细胞。再例如，可以通过将以上所获得的细胞沉淀悬浮 于蒸馏水中并且冷冻干燥所得混悬液将孢子制备成冻干孢子粉。
[0020] 现有技术中已经有多株枯草芽孢杆菌作为生防菌在植物病害中应用，部分进行了 产品登记。本发明的特点在于提供的枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株分离自渤海湾海边土壤，由 于海洋环境的特殊性，海洋微生物及其代谢产物都具有不同于陆地微生物的特点，那么利 用海洋微生物开发的生物制剂具有其独特性，可以为生防制剂增加多样性，从而减轻、减缓 病原微生物产生的抗药性问题。
[0021] 本发明提供的枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株繁殖快、生长周期短、芽孢产生量大、易 于工业化生产；本发明提供的由SY-BA2菌株制备的植物病害防治剂抗菌谱广、环境兼容性 好、可防治多种植物病害，尤其对化学药剂难以防控的土传病害具有理想的防治效果。
[0022] 在筛选枯草芽孢杆菌SY-BA2菌株时首先采用高温湿热条件将土壤样品处理 lOmin，筛选掉大部分不耐高温抗性差的菌株，再增加碳氮源激活剩余存活菌株，采用常规 平板稀释法分离获得纯菌株样品，通过该方法获得的抗病菌株比例高，而且菌体本身抗性 强、耐高温，利于菌剂后期加工和储存。因此该分离筛选方法可极大减轻分离大量菌株所需 工作量，缩短工作时间，提高工作效率。具体如下：一种快速分离筛选具有生防功能菌株的 方法，所述方法为将采集土壤样品用锡箱纸包好高温湿热65°C处理20min待冷却后倒入装 有50mL无菌水的250mL三角瓶中，补加少量葡萄糖和硫酸铵，30°C摇床振荡2d，取5 mL系 列稀释至10 4、10 5、10 6、10 7,各取0. 2mL涂布于改进的蛋白胨培养基（胰蛋白胨10g，酵母 粉3g，葡萄糖5g，NaCl 5g，pH 7. 0)，30°C培养2d，挑取单菌落反复划线纯化，获得纯系菌 株。
[0023] 利用离体平板对峙培养法测试筛选菌株的抑菌活性，选择离体抑菌谱宽的菌株作 为重点筛选对象，并结合菌株的生长速度和生长要求明确生防菌株。
[0024] 本发明提供了一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)SY-BA2,保藏号为CCTCC Μ 2015385。
[0025] 本发明中发酵细菌SY-BA2分离自渤海湾海边土壤，经16S rDNA基因测序法鉴定 为枯草芽孢杆菌，已于2015年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省 武汉市武昌区八一路珞珈山），保藏号为CCTCC Μ 2015385。该菌为革兰氏阳性好氧菌，平 板培养为圆形或近圆形，乳白色，伴随培养时间延长，菌落有褶皱和突起，显微镜下观察菌 体杆状，大小为1.2-1.4以111\0.6-〇.8以111，内生芽抱。枯草芽抱杆菌（13&(3；[11118 811131:;[118) SY-BA2CCTCC Μ 2015385 简称枯草芽孢杆菌 SY-BA2。
[0026] 本发明另一方面提供了一种由上述菌株制备的植物病害防治剂，所述植物病害 防治剂可以直接以发酵液形式施用，也可以制成可湿性粉剂，可湿性粉剂是由枯草芽孢杆 菌SY-BA2发酵液、载体、湿润剂和分散剂组成。具体制备步骤为，首先发酵枯草芽孢杆菌 SY-BA2生产发酵液，用于培养本发明菌株的营养源没有特别的限制，碳源可以是葡萄糖、蔗 糖、乳糖、麦芽糖、各种淀粉、甘油、肌醇、甘露醇其中的一种或几种。氮源可以是蛋白胨、酵 母粉、牛肉膏、大豆粉、玉米粉、麦皮其中的一种或几种。另外还可添加无机氮源如硝酸铵、 硫酸铵、氯化铵，还有无机盐如氯化钠、碳酸钙、硫酸镁、磷酸盐一种或几种。通常采用常规 LB培养基。本发明不局限于本文中列举的这些培养基配方。
[0027] 培养本发明菌株的培养条件亦没有特别限制，培养温度、pH、振荡速度、装液量、通 气比等适合所述菌株生长即可。通常温度控制在25-30°C、pH在6. 0-8. 0之间，振荡速度在 120-200rpm/min、装液量一般250mL装80~120mL培养基，培养24~72h，最终菌体浓度在 lX10s~lX1010cfu/mL〇
[0028] 本发明的生物制剂可以直接以发酵液形式施用，包括分离获得的活菌体和去菌体 的发酵清液，也可以制成载体形式的微生物制剂，所述载体为不影响枯草芽孢杆菌SY-BA2 活性的常用载体，如硅藻土、高岭土、膨润土、稻壳粉、草炭土、白炭黑、轻质碳酸钙、凹凸 棒土、滑石粉等，载体宜事先研磨加工成粒度在300目，载体与含活菌数量在IX 10s~ 1 X K^cfu/mL的发酵液重量比在1:1至1:5,另外添加适当助剂，湿润剂如十二烷基苯磺酸 钠、十二烷基硫酸钠、烷基萘磺酸盐中的一种或多种，分散剂如烷基萘磺酸盐缩聚物钠盐、 羧甲基纤维素钠中的一种或几种，载体与湿润剂重量百分比为1:0. 0001~1:0. 10,载体与 分散剂重量比为1:0. 0001~1:0. 10,载体与枯草芽孢杆菌SY-BA2发酵液、湿润剂、分散剂 混合后干燥，干燥方法不限，含水量控制在6%以下。
[0029] 枯草芽孢杆菌菌株SY-BA2以及生物制剂在植物病害防治中的应用。将枯草芽孢 杆菌生物制剂喷施于植株上可防治多种植物病害，如将枯草芽孢杆菌SY-BA2发酵液（菌体 浓度达到1X 10s~1X 10 Ifu/mL)或者将载体形式枯草芽孢杆菌SY-BA2稀释100倍至500 倍液直接喷施于玉米、小麦、黄瓜叶片上，可有效防治玉米锈病、小麦白粉病、黄瓜霜霉病、 黄瓜炭疽病；将枯草芽孢杆菌SY-BA2发酵液（菌体浓度达到1 X 105-1 X 106cfu/mL)或者将 载体形式枯草芽孢杆菌SY-BA2稀释100倍至800倍液浸种处理黄瓜种子0. 5h至1. 5h，然 后将处理后的黄瓜种子种植于土壤中可有效防治黄瓜枯萎病。
[0030] 本发明还涉及所述枯草芽孢杆菌生物制剂用于防治植物苗期各种土传病害，如青 枯病、立枯病、枯萎病。
[0031] 实施例1:
[0032] 枯草芽孢杆菌SY-BA2的获得和鉴