专利名称：一株能防治植物细菌病害的产酶溶杆菌无标记工程菌株构建与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一株能防治植物细菌病害的产酶溶杆菌无标记工程菌株构建与应用。
背景技术：
产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)是溶杆菌属(Lysobacter)的模式种，属于黄单胞科(Xanthomonadaceae),该菌菌落黏性、黄色、富含G+C%、有滑行能力，能产生蛋白酶、几丁质酶、β -I, 3-葡聚糖酶，纤维素酶等多种胞外酶,对真菌、卵菌和线虫等多种植物病原物都有很好的拮抗活性。
OHl I菌株分离于辣椒根际土壤，是国内首次报道的一株生防细菌菌株。该菌株对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜腐霉(Pythium ultimum)、辣椒疫霉(Phytophthora capsici)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、小麦赤霉病菌(Fusarum solani)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)等多种植物病原物均具有强烈的拮抗活性。在温室盆栽试验中，OHll对辣椒疫病防治效果达到了 83.6%。然而，到目前为止，仍未见产酶溶杆菌防治植物细菌病害的报道。细菌的QS (Quorum sensing)系统是细菌通过分泌可溶性信号分子(autoinducer, Al)来监测群体密度并调控细菌生物功能的信息交流机制。植物病原细菌产生的Al多数为酰基高丝氨酸内酯(AHL)，该分子由一个可变的酰基链(ayslside chain)尾部与一个稳定的高丝氨酸内酯(HSL)头部相连。不同的AHL分子其酰基链的长度为4至18个碳。大量研究证实植物病原细菌的QS系统调控细菌在寄主植物上的致病性，破坏细菌的QS系统，可以显著降低病菌的致病性或使病菌完全丧失致病性。破坏植物病原细菌QS系统的方法有两种，一种是将Al的合成酶基因敲除，使细菌无法产生Al，导致QS系统完全破坏。另外一种是利用相关外源蛋白(也称为降解酶)来降解细菌QS信号分子，起到干扰或破坏细菌QS的目的,这种机制称为群体淬灭(Quorum quenching, QQ)。在现有报道的降解酶中，研究最为透彻的是AiiA蛋白。该蛋白最早分离于Bacillus sp. 24菌株,能够降解不同碳链分子的AHL类信号分子。在前期工作中，我们将外源的ai iA基因克隆到广宿主载体PBBRI-MCS5，并导入OHll菌株。转化后的OHll菌株能显著降解软腐病菌(Pectobacteriumcarotovorum)产生的AHL信号分子，并显著降低该病菌在大白菜和马铃薯上的致病性，表明基于质粒表达的外源AiiA降解酶有助于实现产酶溶杆菌防治植物细菌病害。然而，含有外源质粒的工程菌株，因为质粒上往往含有抗生素编码基因，导致这类工程菌株在田间应用存在一定的风险，如抗性基因可能会水平转移，也可能会破坏土壤或植物根围的微生物群落组成。针对这种情况，替代的方案是将外源优良基因整合到生防细菌的染色体上，构建出无抗生素标记的工程菌株。无标记工程菌株的构建一般需要两个条件，一是寻找或克隆一个组成型表达的强启动子，便于在染色体上高强度启动外源基因的表达，二是寻找一个合适的整合靶标。因为当外源基因整合到靶基因后，靶基因会被插入突变失活，导致靶基因的功能丧失。因此，我们需要找到一个对产酶溶杆菌生防效果具有负向调控的功能基因来作为外源基因整合的靶标基因。在前期工作中，我们构建了一个新型、有效的启动子探针，并从OHll菌株中克隆了一个组成型表达的强启动子PB500。同时，我们又从产酶溶杆菌中克隆了一个色素合成相关基因hmgA(基因登录号EU717786)。该基因突变后，OHll菌落在LB平板上会产生黑色素，但突变株对水稻纹枯病菌等植物真菌病害的防治效果提高近20%，表明hmgA是一个合适的外源基因整合靶标。
发明内容
本发明将以hmgA为祀标基因，SacB为反向筛选标记,将融合基因PB500_aiiA无标记整合到OHll的染色体上，构建无标记、稳定遗传，并具有降解AHL类信号分子能力的产酶溶杆菌工程菌株OHl 1PA。工程菌株OHllPA对细菌性软腐病具有较好的生防效果。 有益效果本发明提供的无标记遗传工程菌的构建策略可为后续将其他优良的外源基因定向整合到产酶溶杆菌中提供了技术参考。同时，本发明提供的多功能工程菌株OHllPA既能防治植物真菌病害，又具有了防治植物细菌病害的能力，拓宽了产酶溶杆菌的生防范围，为进一步实现该菌的产业化发酵和田间应用奠定了坚实的基础。
图I工程菌株OHllPA的构建示意 2 PB500、ai iA 及 PB500_ai iA 的 PCR 扩增图3 DNA 片段 hmgA-F、hmgA-R、PB500-aiiA 和 pEX18GM 的电泳检测图4重组载体pEX18PAT的酶切验证图5质粒pEX18PAT的图谱图6疑似工程菌株OHl IPA的抗性和表型图7疑似工程菌株OHl IPA的PCR验证图8葡萄糖对OHllPA黑色素产生的抑制现象图9菌株OHl IA对信号分子AHLA的降解活性图10菌株OHllPA对大白菜软腐病的离体生防效果
具体实施例方式以下通过具体实施对本发明作进一步阐述，但不限制本发明实施例I :含PB500-aiiA的产酶溶杆菌无标记工程菌株的构建I材料和方法I. I试验材料本试验所用的大肠杆菌菌株DH5a购置大连宝生物公司(TaKaRa)，SMlO λ pir和DH5a λ pir菌株由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠。产酶溶杆菌由发明人分离并保存。载体pE)(18GM由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠。质粒pME6863由SwissFederal Institute of Technology的Molina教授惠赠。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基，培养温度为37°C，液体培养的转速为225 rpm / min。产酶溶杆菌的培养使用LB培养基，培养温度为30°C，液体培养的转速为225rpm / min。抗生素庆大霉素(Gm)、链霉素(Sm)、5_溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X_gal)均购置南京助研生物公司。I. 2 PB500_aiiA融合片段的构建根据PB500和aiiA序列，设计如下引物PBA-I 5’ -AAGGATCCTGCGAGACAACTTTTTTCCG-3,(下划纬为 BamHI) ;PBA_2 5’-GAAATAAAGCTTCTTTACTGTCATGGATCGAATATTCCTGGTTTTTC-3’ ；PBA-3 :5’-GAAAAACCAGGAATATTCGATCCATGACAGTAAAGAAGCTTTATTTC-3’ ；PBA_4:5’-AAAAGCTTCTATATATATTCAGGGAACAC-3’(下划线为Hindlll)。以OHll菌株的基因组DNA为模板，利用引物PBA-I / PBA_2，PCR扩增启动子PB500 ;以质粒PME6863为模板，利用引物PBA-3 / PBA-4，PCR扩增aiiA基因。之后，将PB500和aiiA的PCR产物按照mol比I : I混合，并以此混合液为模板，利用引 物 PBA-I / PBA-4，通过重叠 PCR 将 PB500 与 aiiA 连接成为 PB500-aiiA。PB500_aiiA 回收纯化后进行“TA”克隆，测序验证序列的正确性。I. 3hmgA-F 和 hmgA-R 的 PCR 扩增根据hmgA 的序列.设计引物EHmgA-1 5, -AAGAATTCCGGCGCGTTCTCGCCGTTCG-3，(下划线为酶切位点 EcoRI) ；BhmgA-2 5, -AA GGATCCCGGCCCCAGATCCGGCAGCC-3，(下划线为BamHI) ;HhmgA_3 :5’ 一 AAAAGCTTATCGGTTCCAACGGCCTGGC-3，(下划线为 HindIII );PhmgA_4 5’ -AACTGCAGCCCGGGGCGAAGCCGCCGGC-3,(下划线为酶切位占PstI)。以OHll菌株的基因组DNA为模板，利用引物EhmgA-I / BhmgA_2，PCR扩增hmgA基因5’端420bp的DNA片段，命名为HmgA-F ;同样，以OHl I基因组DNA为模板，利用引物HmgA-I / PhmgA-4，PCR扩增hmgA基因3’端430bp的DNA片段，命名为hmgA-R。I. 4重组载体的pEX18PAT的构建及验证建立200 μ L的酶切体系。分别使用内切酶EcoRI/BamHI、BamHI / Hindi 11、HindIII / PstI、EcoRI / PstI 对 hmgA-F、PB500_aiiA、HmgA-R 和 pEX18GM 进行双酶切，回收纯化。之后，将纯化后的hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R、pEX18GM在T4 DNA连接酶的作用下于16°C进行连接，反应20h后，转化大肠杆菌DH5 λ pir感受态细胞，在LA平板(含20 μ g / ml Gm)上筛选转化子。阳性转化子的筛选首先使用aiiA的特异性引物(PBAT3 /PBAT4)进行PCR扩增，之后，培养PCR阳性克隆，并提取质粒，用EcoRI / PstI进行双酶切验证，观察hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R能否同时连接到pEX18GM载体上。最后，携带有3个外源插入片段(hmgA-F、PB500-aiiA、hmgA-R)的 pEX18GM 被命名为 pEX18PAT。I. 5无标记工程菌株OHllPA的构建及验证无标记工程菌株0H11PA的构建过程见图I。将ρΕΠ8ΡΑΤ电击转化SMlO λ pir感受态细胞，挑取阳性转化子SM / PEX18PAT，将分别处于对数生长期的0H11(0D_=0. 5)与SM / PEX18GMPAT进行两亲接合，在LA平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)上筛选单交换子。选取10个单交换子分别在空白LA培养基上划线后2天后，再次划线于含有10%蔗糖的LA(无Nacl)培养基中，培养2-3天后生长出来的单菌落(产可溶性黑色素)初步判定为“hmgA-disruption突变体”即工程菌株0H11PA。用灭菌牙签将初步判定的工程菌株OHlIPA平行划线接种于LB平板(100 μ g / mLSm)、LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g / mL Gm)，筛选在 LB 平板(100 μ g / mL Sm+200 μ g /mL Gm)中无法生长同时在LB平板(IOOyg / mL Sm)上生长，并在菌落周围产生黑色晕圈的菌落，将这些菌株活化后，提取DNA，利用aiiA的特异性引物PBAT3 / PBAT4进一步对筛选的疑似突变株进行PCR验证，将阳性突变株命名为OHl 1PA。2结果显示通过PCR扩增，如图2所示，成功获得了 PB500_aiiA的融合片段(1434bp)、hmgA-F(420bp)和hmgA-R(430bp)。随后通过酶促连接反应，成功将hmgA-F、hmgA-R和PB500-ai iA克隆到自杀载体PEH8GM中，构建成重组载体pEX18PAT (图3 ;图4)。通过接合作用，将pEX18PAT导入0Hll中，在LA平板(IOOyg / mLSm+200 μ g / mL Gm)上筛选产生可溶性黑色素的菌落(即hmgA第一次交换接合子)。将接合子在空白LB上划线后，重新划线于10%蔗糖的2YT平板上，在22°C培养2天后，将产生可溶性黑色素的单菌落挑出，验证对Gm的敏感性。如图5所示，从含有10%蔗糖的LA平板上生长出来单菌落均对Gm敏感，而且在LA平板上产生可溶性黑色素。提取产可溶性黑色素的菌株的DNA，利用aiiA的特 异性引物PAT-I / PAT-2对疑似双交换突变株进行验证，发现所有的疑似突变株均能扩增出一条O. 75kb的特异性条带(图6)，以预期相符，表明aiiA已经成功整合到OHll菌株的hmgA基因中，工程菌株OHl IPA构建成功。实施例2 :含PB500_aiiA的产酶溶杆菌无标记工程菌株对细菌性软腐病的生防应用I材料和方法I. I试验材料本试验所用的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)由南京农业大学生命科学学院朱军教授惠赠。产酶溶杆菌和大白菜软腐病菌由发明人分离并保存。载体PME6863由 Swiss Federal Institute of Technology 的 Molina 教授惠赠。细菌培养使用 LB 培养基，培养温度为30°C，液体培养的转速为225rpm / min。抗生素庆大霉素(Gm)、链霉素(Sm)、壮观霉素(Spe)、四环素(Tc)、5_漠-4-氣-3-卩引噪-β -D-半乳糖昔(X-gal)、SDS>NaC03等化学试剂均购置南京助研生物公司。I. 2 AHL类信号分子的提取和检测用乙酸乙酯萃取的方法从大白菜软腐病菌(Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum)中提取AHL类信号分子。将参试细菌进行LB培养(IOOmL)，当细菌培养液浓度达到OD6tltlnm=O. 6时，收集各细菌培养液，离心(12，OOOrpm, IOmin)后收集上清。之后，培养上清用乙酸乙酯萃取两次，并在旋转蒸发仪中将萃取液旋转蒸发，浓缩200倍后于-70°C保存，备用。AHL的定性检测方法如下在96孔板中加入180 μ L AT培养基(2 μ g/mLTc+100 μ g / mL Spe+100 μ g / mL Gm+300 μ g / mL X-gal)，之后将 20 μ L 107cfu / mL 的超敏感检测菌株JZAl加入到上述180 μ L AT培养基中，最后加入100 μ L 1%水琼脂(60°C )，用移液器将培养液均勻混合后，将96孔板放入28°C培养箱培养，10-12h后观察X-gal的水解结果。如果X-gal水解变蓝(即小孔呈蓝色)，表明检测液中存在一定浓度的AHL，颜色越蓝，揭示检测液中AHL的浓度越高；小孔中无蓝色，表明检测液中的AHL被完全降解。AHL的定量检测采用β -半乳糖苷酶法按I 100的比例将检测菌株JZAl加入到AT培养基中，分别加入参试菌株的浓缩培养上清(10% )，培养至OD_为O. 2 I. O ;在2mL离心管中加入Z-bufTer，0. 5% SDS, CHCl3及O. 2mL上述培养菌液，充分振荡。加入显色底物ONPG，计时至溶液显黄色，加入IM NaCO3终止反应，计算Miller Units，检测β-半乳糖苷酶活性。I. 3 AHL类信号分子的降解试验在5mL液体LB培养基中加入5 μ L浓缩的AHL类信号分子，配成LB-AHL液体培养基。之后，将10 μ L OHll和OHllPA的细菌培养液(OD600nm=O. 6)加入LB-AHL培养液中，过夜培养后，利用AHL类信号分子超敏感检测菌株JZAl检测过夜培养中AHL的浓度，通过比较过夜培养液和空白培养液(LB-AHL)中AHL浓度差异(β-半乳糖苷酶的活性)来评价OHl IA菌株对AHL的降解能力。I. 4大白菜软腐病的离体生防试验及发病组织中病菌和生防菌的重新分离
用自来水清洗新鲜大白菜的叶片，之后，用70%的酒精进行表面消毒。待叶片表面的酒精挥发后，用灭菌手术刀片将叶片切成10X4cm的小方块。产酶溶杆菌和软腐病菌在LB培养液中培养48h后，将菌液浓度调整为IO7 CFU / mL，之后将产酶溶杆菌菌液与软腐病菌菌液按体积比I : I混合，并在28°C培养箱中放置4h。随后，用灭菌牙签在消毒过的叶片表面扎一个2mm深的小孔，将5μ L产酶溶杆菌与软腐病菌混合菌液接种于小孔中，接种后的叶块放置在含有无菌滤纸(无菌水湿润)的培养皿中，并在28°C培养箱中放置12h后，观察叶块的发病程度。采用十字交叉法测定病斑的最长直径和最短直径，平均值最为有效直径，利用公式^!※(直径/ 2)2计算发病面积，并作为发病严重度的评价指标。病原真菌或卵菌的平板拮抗活性测定2、结果显示由于菌株OHllPA在LB-AHLA (LB中含有2% (v / V)信号分子AHLA)中产生可溶性黑色素，使得培养上清变为黑色，这给后续利用JZAl检测培养液中AHLA的浓度带来了困难，因为黑色素干扰了小孔中X-gal被水解后蓝色的观察。为了克服这一问题，我们筛选了能抑制黑色素产生的物质。我们发现当培养基含有2%葡萄糖时，OHllPA则不产生黑色素，揭示葡萄糖可以抑制OHlIPA产生黑色素(图7)。因此，在后续的AHLA降解试验中，我们在原先的LB-AHLA培养中又额外添加了终浓度为2 %葡萄糖，有效抑制了 OHl IPA产生黑色素。因此，使用LB-AHLA-glucose培养基，并结合AHL超敏感检测菌株JZAl，可以评价OHl IPA对外源信号分子AHLA的降解效率。如图8所示，在AHL的定性试验中，根据每个小孔是否蓝色，可以发现菌株OHllPA能显著降解由A. tumefaciens RlO产生的信号分子AHLA,小孔基本没有显蓝。在同样的操作条件下，野生型OHll则无法降解AHLA，导致小孔呈现明显蓝色。为了进一步确定OHllPA对AHLA的降解效率，我们进行了 AHL的定量检测，如图9所示，通过测定培养液中半乳糖苷酶的活性，发现在对照培养液(AHLA与LB混合液)中β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) : 1579. I± 111. O。同时，在OHl IPA与AHLA的混合培养液中半乳糖苷酶的活性(Miller unite)为149. 3±7. 8，表明大部分的AHLA已被OHlIPA降解，进一步确认OHlIPA能对AHLA的降解效率。此外，在OHll与AHLA混合培养液中，β-半乳糖苷酶的活性(Miller unite) :1448. 5±34. 7，与对照培养液中β-半乳糖苷酶的活性相似，进一步表明OHll不能降解AHLA。离体试验表明，菌株OHllPA能显著降低软腐病菌在大白菜上的致病性。如图10所示，接种12h后，在大白菜叶片上，单独接种软腐病菌的接种点周围变得腐烂，腐烂面积达到I. 44±0. 07cm2。同时，OHll与软腐病菌共同接种的接种点周围的腐烂面积也达到了
I.51±0. 13cm2，表明OHll不能降低软腐病菌在大白菜上的致病性。然而，在同样的操作条件下，OHllPA与软腐病菌共同接种的接种点周围腐烂面积最小，仅有O. 38±0. 07cm2，表明OHllPA降低病菌在大白菜上的致病性。
权利要求
1.一株能防治植物细菌病害的产酶溶杆菌无标记工程菌株构建。
2.编码权利要求I所述的工程菌对细菌性软腐病菌产生的群体感应信号分子AHL的降解应用。
3.编码权利要求I所述的工程菌对细菌性软腐病的生防应用。
全文摘要
本发明涉及一株能防治植物细菌病害的产酶溶杆菌无标记工程菌株构建策略及过程，属于微生物基因工程领域。本发明提供的产酶溶杆菌无标记工程菌株只是将外源优良基因aiiA定向整合到染色体上，无任何标记基因带入。该工程菌株能高效破坏植物病原细菌的群体感应系统，显著降低病原细菌在寄主植物(大白菜)上的致病性，实现对植物细菌病害的生物防治。
文档编号C12N1/21GK102943061SQ20121049251
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者刘凤权, 钱国良 申请人:南京农业大学