专利名称：一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法
技术领域：
本发明属于基因克隆与鉴定技术领域，尤其涉及一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法。该基因参与植物氮素同化、转移与利用，为通过转基因方法选育氮高效品种提供了材料。
背景技术：
氮素是影响植物生长发育的主要元素，无论是直接来源于硝酸盐、氨离子、微生物固定氮还是植物代谢过程中释放的氨，都必须经过谷氨酰胺合成酶(GS)催化才能同化为氨基酸。大麦、玉米、水稻、拟南芥等许多植物的GS基因已被克隆，GS功能研究已经成为提高氮素利用效率的研究热点之一。高等植物中有两类GS，一类定位于胞液中，称为胞液型GSjP GS1，主要参与种子萌发时储存氮源的转运及叶片衰老时氮源的转移及再利用；另一类定位于质体中，称为质体型GS，即GS2，主要参与光呼吸、硝酸还原产生的氨(初级氮)的同化过程[。前人研究表明豌豆GSl转化的烟苗在氮胁迫时能提高叶片的光合速率，增加植株的生物产量，促进氮素的转移与再利用(Fuentes，2001)。转GSl基因玉米的穗粒数及千粒重增加，氮素利用率提高(Martin，20006)。高效表达GSl和GS2基因能提高水稻对土壤氮素缺乏的耐性，促进氮的吸收与再利用(孙辉等，2005)。
发明内容
在前期研究工作基础上，我们设计克隆小麦GSl和GS2基因的全长cDNA引物及相应的PCR循环，得到了 GSl和GS2基因的全长cDNA。并设计特异性引物，利用半定量PCR鉴定GSl和GS2在小麦不同组织中的表达状态。本发明实施例是这样实现的，一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，该方法包括以下步骤利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用I %的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；cDNA合成采用20 ii L反应体系，42 V温浴Ih ；GSl 全长 cDNA 克隆；GS2 全长 cDNA 克隆；利用半定量PCR鉴定小麦GSl和GS2基因表达的方法，通过获得cDNA，利用表I中的弓I物进行PCR扩增，产物于琼脂糖凝胶电泳鉴定。进一步，cDNA合成采用 20 ilL 反应体系为RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP,125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。进一步，GSl全长cDNA克隆方法为GSl 全长正向引物GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物GSlQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循环预变性 94°C，2min ;变性 94°C，45s ;退火61 °C,45s ；延伸72°C，IOmin ;扩增30个循环，4°C，5min。PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带(图1A)，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP IO，挑选阳性菌落测序鉴定。进一步，GS2全长cDNA克隆方法为GS2 全长正向引物 GS2QF :5，-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’ 和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ；PCR 循环:预变性 94°C，2min ;变性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ；扩增30个循环，4°C，5min ；
PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定；利用DNA凝胶回收试剂盒回收目的条带(图1B)，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌TOP 10，挑选阳性菌落测序鉴定。进一步，利用半定量PCR鉴定小麦GSl和GS2基因表达的方法为通过获得cDNA，利用引物进行PCR扩增预变性94°C，2min，变性94°C，30s ;退火54°C,30s ;延伸72°C，30s ;扩增28个循环，延伸72°C，5min，产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定。进一步，所述引物设计为(I)GSl全长cDNA的引物设计；正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'，(2) GS2 全长 cDNA 的弓丨物设计；正向引物 GS2QF 5 ’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3 ’ 和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCITTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’(3) GSl半定量PCR特异性引物。正向引物5' -TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'；(4) GS2 半定量 PCR 特异性引物。正向引物 5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。本发明首次从普通小麦栽培品种叶片中克隆了 GSl和GS2的全长cDNA，探索了GSl和GS2在小麦不同组织中转录与表达特点，不仅为进一步研究其在小麦生长发育过程中的调控方式及在氮素利用中的作用奠定了基础。更为通过转基因方法选育氮高效品种提供了材料。
图I是本发明实施例提供的小麦谷氨酰胺合成酶全长cDNA的PCR扩增图。A、GS1基因扩增；B、GS2基因扩增。图2是本发明实施例提供的利用半定量PCR鉴定小麦谷氨酰胺合成酶基因在小麦苗期叶片中的表达特点。A、GS1基因；B、GS2基因。1-6分别表示小麦出苗后2、4、8、20、28及30天。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。在前期研究工作基础上，我们设计克隆小麦GSl和GS2基因的全长cDNA引物及相应的PCR循环，得到了 GSl和GS2基因的全长cDNA。并设计特异性引物，利用半定量PCR鉴定GSl和GS2在小麦不同组织中的表达状态。本发明的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定是通过以下技术方案实现的I、利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用I %的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。2、cDNA 合成采用 20 yL 反应体系(RNA，2u g ;M_MLV，200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT, IOOpmol ;RNasin，25U)，42°C温浴 lh。3、GSl全长cDNA克隆。GSl全长正向引物GSlQF :
5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 ' 和反向弓I 物 GSlQR 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循环预变性 94°C，2mi n ;变性 94°C，45s ;退火61°C，45s ;延伸72°C，IOmin ;扩增30个循环，4°C，5min。PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌T0P10，挑选阳性菌落测序鉴定。4、GS2 全长 cDNA 克隆。GS2 全长正向引物 GS2QF :5’ -CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTITTAATAACGTAGTTCTCCG-3’。PCR 循环预变性 94°C，2min ；变性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;扩增 30 个循环，4°C，5min。PCR 产物于
I%琼脂糖凝胶电泳鉴定。利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌T0P10，挑选阳性菌落测序鉴定。5、利用半定量PCR鉴定小麦GSl和GS2基因表达的方法。通过步骤I和2获得cDNA，利用表I中的引物进行PCR扩增:预变性94°C，2min，变性94°C，30s ;退火54°C，30s ；延伸72°C，30s ;扩增28个循环，延伸72°C，5min，产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定。表I半定量PCR引物
权利要求
1.一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，该方法包括以下步骤 利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性； cDNA合成采用20 ii L反应体系，42 °C温浴Ih ； GSl全长cDNA克隆； GS2全长cDNA克隆； 利用半定量PCR鉴定小麦GSl和GS2基因表达的方法，通过获得cDNA，利用表I中的引物进行PCR扩增，产物于琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.如权利要求I所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，cDNA 合成采用 20 ii L 反应体系为RNA, 2 u g ；M-MLV, 200U ；dNTP, 125pmol ；oligodT,IOOpmol ;RNasin,25U。
3.如权利要求I所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，GSl全长cDNA克隆方法为 GSl 全长正向引物 GSl QF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3 '和反向引物 GSIQR :5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'。PCR 循环预变性 94°C，2min ;变性 94°C，45s ;退火61。。，45s ;延伸72°C，IOmin ;扩增30个循环，4°C，5min。PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定；利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌T0P10，挑选阳性菌落测序鉴定。
4.如权利要求I所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，GS2全长cDNA克隆方法为 GS2 全长正向引物 GS2QF :5，CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3，和反向引物 GS2QR 5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTC TCCG-3’ ； PCR 循环:预变性 94°C，2min ;变性 94°C，45s ;退火 56°C，45s ;延伸 72°C, IOmin ;扩增30 个循环，4°C，5min ； PCR产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定； 利用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接PMD-19载体，转化大肠杆菌T0P10，挑选阳性菌落测序鉴定。
5.如权利要求I所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，利用半定量PCR鉴定小麦GSl和GS2基因表达的方法为 通过获得cDNA，利用引物进行PCR扩增预变性94°C，2min，变性94°C，30s ;退火54°C，30s ;延伸72°C，30s ;扩增28个循环，延伸72°C，5min，产物于I %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
6.如权利要求5所述的小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，其特征在于，所述引物设计为 (1)GSl全长 cDNA 的引物设计；正向引物 GSlQF :5' -CTGCAGAAAGCACCACCCCCACC-3'和反向引物 GSIQR : 5' -CAGCTGGTGTGGTACCACGGCAGC-3'， (2)GS2全长cDNA的引物设计；正向引物GS2QF:5’-CTTCCCTCCCTCCTCTCCTC-3’和反向引物 GS2QR :5’ -TATCCTTTTAATAACGTAGTTCTCCG-3’ (3)GSl半定量PCR特异性引物；正向引物5'-TCCTGTGGAAGCCCTGAAGC-3'和反向引物 5' -CGACGATGATGCGACCTACCTAA-3'； (4 )GS2半定量PCR特异性引物；正向引物5' -GAACGGAGGCTGACAGGGCTAC-3'和反向引物 5' -ACAAGAATGGACGACGGACGAAC-3'。
全文摘要
本发明公开了一种小麦谷氨酰胺合成酶基因的克隆与鉴定方法，该方法包括以下步骤利用Trizol试剂盒提取小麦组织总RNA，DNaseI处理后DEPC处理水定容，利用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；cDNA合成采用20μL反应体系，42℃温浴1h；GS1全长cDNA克隆；GS2全长cDNA克隆；利用半定量PCR鉴定小麦GS1和GS2基因表达的方法，通过获得cDNA，利用表1中的引物进行PCR扩增，产物于琼脂糖凝胶电泳鉴定。本发明首次从普通小麦栽培品种叶片中克隆了GS1和GS2的全长cDNA，探索了GS1和GS2在小麦不同组织中转录与表达特点，不仅为进一步研究其在小麦生长发育过程中的调控方式及在氮素利用中的作用奠定了基础。更为通过转基因方法选育氮高效品种提供了材料。
文档编号C12Q1/68GK102965383SQ201210492359
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者王小纯, 马新明, 李高飞 申请人:王小纯