专利名称：一种使用高浓度甘油的pcr方法及其反应液和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其反应液和应用。
背景技术：
已有不少文献报导甘油能降低高G+C区域的二级结构，能促进长距离PCR和提高标准PCR方法的反应专一性。此外，有报导在多重PCR(O.Henegariu等，Biotechniques，1997，23504)和等位专一PCR(R.S.Cha等，PCR Methods and Applications，1992，214)反应液中添加甘油。上述研究有二个共同特点，第一，甘油浓度较低通常为5-10％(V/V，下文中未指明的均指体积百分比)，文献报导的最高浓度为20％(Y.H.Liu等，Trends in Gentics，1993和S.Vilcek，Journal Virological Methods，1993，41245) 第二，添加甘油后变性温度包括首次和循环变性均仍采用常规的94或95℃。尚未有文献或专利将甘油浓度扩展至20-45％，并且将含5-45％甘油的PCR反应的首次变性温度提高到大于95℃至98℃，循环变性温度降低到小于94℃至60℃的报道。
在一管法RT-PC方面，至今仅有一篇文献(T.W.Myers等，PCR Strategies，p.58-68，Ed.M.A.Innis等，1995)在反应液中添加3％甘油，加上原来由DNA聚合酶和反转录酶试剂带进的2％甘油，使PCR能在含5％甘油反应液中进行。未有将一管法RT-PCR反应液的甘油浓度扩展至5-25％的报道。
发明内容
所要解决的技术问题本发明所要解决的技术问题是提供一种含高浓度甘油的聚合酶链式反应的方法及其反应液和应用，以突破现有PCR方法中甘油浓度的常规，克服经典PCR反应容易出现非专一性扩增产物的缺陷，减少了模板顺序突变而导致的假阴性。
发明构思应用高浓度甘油的思路是在文献检索和对PCR反应机制及甘油作用进行分析的基础上发展形成的。
1.现有的PCR技术观点通常认为当扩增产物区域含有高比例G+C时，添加甘油或其他变性剂能降低核酸的二级结构，促进目标产物的扩增。我们认为，除上述机制外，甘油的关键作用是它能促进半扩增链和最初扩增产物的形成，从而对目标扩增的形成和扩增的专一性起重要作用。根据扩增产物的形成机制，从基因组DNA形成半扩增链和从半扩增链形成最初的扩增产物对PCR扩增产物在数量上的贡献可以忽略。但是，半扩增链和最初扩增产物的形成对完成目标产物扩增的关键性作用却不容忽略。目前各种教科书和专著在描述PCR原理的图解中，都将基因组变性后的大分子单链DNA标示为一条直线型分子，按照这种模式图解，引物与目标顺序和非目标顺序的结合并得到延伸的机会在空间效应上是等同的。根据此模式，如果引物有良好的严谨性，那么在严谨的退火温度下出现非专一产物的可能性应很小，只出现非专一产物而无目标产物几乎不可能。对于一个20碱基长的引物，在目标顺序以外出现与之完全匹配的顺序的机会约一万亿分之一(1/420)，此数值比人基因组的总碱基数高几个数量级。另外，一段核酸顺序必须分别具有与正反引物匹配的位点才可能能被扩增。概率计算表明，在基因组DNA中几乎不可能存在一段目标顺序以外的几百至几千碱基长的核酸片段，其上下游顺序会分别与正反引物完全匹配。但事实上，在较低退火温度下非专一产物形成相当普遍，即使在引物的最高允许退火温度也常会有非专一产物出现。这是因为引物除了能与完全匹配的目标顺序结合外，也能与有若干错配甚至较严重错配的非目标顺序结合而引发扩增。但是，无论退火温度高还是低，非目标顺序与引物的结合强度总是要比目标顺序与引物的结合强度低，按上述线性分子模式就不能解释为何会出现只有非专一产物而无目标产物形成的现象。空间位阻可能为这种现象提供一种可能的解释。变性后大分子单链DNA需要一定的温度和时间才能完成自身的完全退火，完成退火之前单链大分子DNA不是呈线性或仅有一些小发夹，而是有非常复杂的空间结构。如果目标顺序处在具有复杂结构大分子的内部，则虽然它与引物完全匹配但也可能因位阻现象而不能完成目标半扩增链和最初的目标扩增产物的形成。反之，处在单链模板DNA大分子表面的不存在位阻现象的非目标顺序，虽然它与引物有不同程度的错配，但只要在试验条件下能完成退火就能形成半扩增链和最初的扩增产物。最初的非专一扩增产物的顺序已与引物完全匹配就很容易继续完成以后步骤的扩增。所以，非目标顺序在空间位置上比目标顺序可能占有先机是只形成非扩增产物，以及形成目标扩增产物同时出现非专一条带的主要原因之一。我们曾用不切割目标顺序的识别顺序为4个碱基的几种限制性内切酶来切割基因组DNA，以被切割成小分子的基因组DNA作模板能得到目标扩增产物，在同样反应条件下直接用基因组DNA作模板，却只得到非专一扩增产物而无目标扩增产物，间接证明了我们的推断。在高的退火温度下，模板单链DNA的空间结构比较松散，目标顺序有更多的机会暴露在分子的表面，使目标顺序和引物物顺序完全匹配的优势得到发挥。同样，我们设想高浓度的甘油可以使单链模板DNA的空间结构变得松散，从而促进目标半扩增链和最初的目标扩增产物的形成。由于至今尚未能建立一项技术来预测大分子单链DNA在不同温度下的空间结构，而引物软件虽能自动选择出具有高严谨性的引物，却不能预测与引物匹配的模板顺序是否会受到位阻的影响。所以，克服位阻的简单方法是在比引物最高允许退火温度略低的温度下退火，因为温度越高单链DNA分子的结构越松散。同样使用比临界允许甘油浓度稍低的甘油浓度，会对促进目标扩增产物形成提高PCR专一性有普遍的意义。
2.含50％甘油的缓冲液在-20℃或更低温度下不结冰，商品酶制剂包括TaqDNA聚合酶通常加50％甘油避免反复使用时因冻融而造成酶的失活。甘油也能提高TaqDNA聚合酶的热稳定性。
Landre(PCR Strategies，p.1-16，Ed.M.A.Innis等，1995)指出Taq酶在97.5℃时的半衰期为9-11分钟，添加1，10和20％的甘油能使半衰期分别提高至13，33和60分钟以上。可以推测，高于20％的甘油会使Taq酶仍具有类似的、同样的或更好的热稳定性。所以在众多能降低DNA二级结构、促进PCR扩增的变性剂中我们首选甘油。标准PCR的变性温度为94-95℃，这一温度下并非所有基因组DNA都能得到充分的完全的变性，但如使用更高的变性温度可能对酶的稳定性带来消极影响。使用高浓度甘油使酶在高温下的热失活显著降低，所以可以在95-98℃进行首次变性使所有模板DNA得到充分的变性。
3.Landre等的研究表明10％甘油使Lamda噬菌体DNA的解链温度降低3℃，10％甘油和5％甲酰胺联用使Lamda噬菌体DNA的解链温度降低6.2℃，使其他4种基因组DNA的解链温度降低4.5-6.5℃。显然，扩增产物的解链温度也因导入高浓度甘油而显著降低(见实施例)。所以根据扩增产物的解链温度和甘油的加量，将循环变性温度降至93-60℃是可行的选择。
4.同样，高浓度甘油会使引物与目标顺序的最高允许退火温度降低(见实施例)，使用较低的退火温度会部分抵销甘油降低核酸二级结构的作用。为了充分发挥高浓度甘油的有益作用，可设计解链温度高的引物，长度为30-50碱基的引物或在原有引物的5’端延伸若干碱基，使得引物能在原有的退火温度下与目标顺序结合。
5.有研究表明，10％和20％甘油会使TaqDNA聚合酶在60-74℃时活力比对照降低约20-25％左右。更高浓度的甘油有可能使活力继续下降，由于TaqDNA聚合酶在最适条件下每秒钟能合成70个以上的核苷酸，PCR产物通常长度为几百碱基而延伸时间通常为1分钟，所以即使酶的活力有所下降仍能在原来的或稍长的的延伸时间内完成扩增。
技术方案本发明的一种含高浓度甘油的聚合酶链式反应的反应液，其组分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其中甘油含量为5-45％(V/V)，优选为20-35％(V/V)。
本发明同时提供应用上述的反应液的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互补链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行合成反应；其中，当反应液含5-20％(V/V)甘油时，PCR的首次变性温度范围为95℃至97℃；反应液含20-45％(V/V)甘油时首次变性温度范围为95℃至98℃。
上述的聚合酶链式反应方法，它的一个优选方案为应用5-20％(V/V)甘油时，除反应启动时的首次变性外，在其余各PCR循环中的变性温度为94℃至60℃；应用20-45％(V/V)甘油时，则其余各PCR循环中的变性温度为93℃至60℃。
上述的聚合酶链式反应方法，它的另一个优选方案为应用5-20％(V/V)甘油时，从第三个循环开始，最低变性温度的下限比扩增产物的解链温度低1-4℃；应用20-45％(V/V)甘油时，从第三个循环开始，最低变性温度比扩增产物的解链温度低1-8℃。
本发明同时提供上述的反应液在减少PCR检测结果非专一性扩增产物中的应用方法，即通过应用高浓度的甘油使模板与引物专一性的识别获得提高，相应地减少非专一性识别。
本发明也提供上述的反应液在减少PCR检测结果假阴性中的应用方法，即通过提高甘油浓度使模板DNA链变性充分以减少假阴性。
本发明提供上述的聚合酶链式反应方法在检测变异DNA序列中的应用，即通过降低循环中的变性温度，使有错配碱基的变异的目标DNA序列与引物结合的机会增加，减少了因模板顺序突变而导致的假阴性。
本发明同时提供应用上述反应液的反转录聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)反转录酶催化下以RNA为模板合成DNA链；(2)DNA链模板变性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互补链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；
其中，当反应液含5-20％(V/V)甘油时PCR的首次变性温度范围为95℃至97℃；反应液含20-45％(V/V)甘油时首次变性温度范围为95℃至98℃。
上述的反转录聚合酶链式反应方法的一个优选方案为，在应用5-20％(V/V)甘油时PCR循环中变性温度为94℃至60℃；应用20-45％(V/V)甘油时PCR循环中变性温度为93℃至60℃。
有益效果1.高浓度甘油使呈单链的模板DNA分子的空间结构比同样温度下不加甘油时松散，使目标顺序最初扩增时受到空间位阻的可能性减少，可充分法挥引物与目标顺序完全匹配的优势，专一地得到目标扩增产物。
2.高浓度甘油增强TaqDNA聚合酶等对高温度的耐热性，可提高首次变性温度，使所有模板得到充分变性。
3.高浓度甘油使扩增产物变性温度降低，从而可降低后续循环的变性温度。
4.高浓度甘油使模板空间结构松散，引物与目标顺序结合的竞争力增强，能在较低温度下仍然专一地扩增目标产物。有错配碱基的目标顺序变种与引物专一结合、得到专一扩增的机会增加，减少了模板顺序突变而导致的假阴性。
5.为能在低温保存含高浓度甘油的全预混试剂盒的应用开创了条件。
具体实施例方式
实施例1.
从人甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(基因库编号XM006959)设计一对引物，其顺序和特性示于表1和2。
表1.实施例1引物顺序
表2.实施例1引物特性
PCR采用ClonTech公司的Advantage-2试剂盒，但PCR反应液添加不同浓度甘油。每管反应体积5微升，引物浓度0.5μM。每100微升反应液加cDNA10微升，cDNA由人组织总RNA用ClonTech公司cDNA合成试剂盒，以试剂盒提供的Oligo(dT)作反转录引物合成。PCR首次变性97℃1分钟。试验退火和延伸温度条件时，循环变性温度88℃持续10秒，试验退火和延伸温度范围为66-76℃持续10秒；试验变性温度条件时，退火温度64℃持续10秒，变性温度试验范围80-88℃持续10秒。循环数32。试验结果示于表3。
表3.实施例1试验结果
表3结果说明在首次变性97℃，循环变性88℃和退火延伸温度64℃的条件下，添加0-30％的甘油都能得到目标扩增产物。循环的最低允许变性温度从88℃降低至80℃，循环的最高允许退火温度从76℃降低至64℃。由于设计的正反引物长度分别为30和34碱基解链温度均超过87℃，即使反应液含有30％甘油仍能在64℃下退火完成扩增。
实施例2.
实施例2为一管法RT-PCR，引物顺序为GCCCAGCGGGTGACGATGCC，它与人肌动球蛋白基因(基因库编号BC016045)的134-153及314-299位顺序分别高度互补，能得到长181硷基的扩增产物。正反引物之间跨越一个内涵子RT-PCR的扩增产物能与基因组DNA扩增产物区别。实施例2采用ClonTech公司的TITIUM一管法RT-PCR试剂盒提供的缓冲液，反转录酶和TaqDNA聚合酶混合液等，但只使用部分的或不使用试剂盒提供的热稳定剂，不使用试剂盒提供的GC-Melting试剂。每管反应体积5微升，每100微升反应液加0.5微克人组织总RNA作为原始模板，引物浓度为1μM。试验的甘油浓度范围为0-30％。在35-55℃反转录60分钟然后立即转入PCR程序。首次变性96℃2分钟，循环变性92℃10秒钟，退火50℃1分钟，延伸70℃2分钟，循环数30。结果见表4。
表4.实施例2试验结果
#不使用试剂盒提供的热稳定剂，其他均使用试剂盒规定量50％的热稳定剂。
试验结果表明应用10或20％甘油反转录温度35-55℃均能专一地得到扩增产物而无非专一产物干扰。相反如不加甘油无论在哪一温度反转录在50℃下退火均有大量非专一产物。
实施例3.
实施例3以人基因组DNA为原始模板比较PCR反应液中添加不同浓度甘油对扩增人Beta肾脏腺素受体基因(3451碱基，基因库编号M15169)的作用。引物选自文献(H.G.Xie等，Clin.Pharmacol.Ther，2000，67670-675)，扩增产物长度252碱基，引物对顺序见表5。
表5.实施例3引物顺序
扩增用试剂和方法与实施例1基本相同。不同处为每100微升反应液加10微升商品人基因组DNA(Roche公司，0.2微克/微升)。循环变性92℃10秒，退火45-65℃1分钟，延伸65℃2分钟，循环数32。试验结果示于表6。
表6.实施例3试验结果
-表示无扩增产物+多少代表目标扩增产物强度***表示有非专一产物但不成条带×阿拉伯数字为非专一条带数量结果表明不添加甘油时，仅当退火温度控制在63-65℃之间才得到扩增产物，扩增产物微弱而且有大量非专一扩增产物。随甘油浓度增高非专一产物不断减少，当甘油浓度为35％、控制退火温度为45-53℃时目标扩增产物强而无非专一条带。甘油浓度高至40-45％时，在所试退火温度范围内均无非专一产物，但在适当退火温度下仍有目标扩增产物形成。本实施例反引物的解链温度为62.8℃，引物设计软件预测其最高允许退火温度为65.8C，试验结果证实了软件的计算结果。随甘油浓度增加最高允许退火温度也随之降低。
实施例4实施例4仍以人基因组DNA为原始模板比较PCR反应液中添加不同浓度甘油对扩增人Beta肾脏腺素受体基因的作用。将文献报导(见实施例3)的引物在5’端增长使其解链温度和结合效率增加而其他特性基本未变。引延伸后的引物顺序示于表6，扩增产物长度262碱基，引物对顺序见表7。
表7.实施例4引物顺序
*粗黑体顺序表示为从文文献报导引物(实施例3)延伸的部分。
扩增用试剂和方法与实施例3相同。甘油浓度为35％，结果在所试的45-65℃退火温度范围内均得到强的扩增产物而无非专一产物干扰。
权利要求
1.一种含高浓度甘油的聚合酶链式反应的反应液，其组分包括dNTPs、DNA聚合酶、甘油和水，其特征在于甘油含量为5-45％(V/V)。
2.根据权利要求1所述的反应液，其特征在于甘油含量为20-35％(V/V)。
3.应用权利要求1所述的反应液的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下合成互补链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行合成反应；其特征在于当反应液含5-20％(V/V)甘油时PCR的首次变性温度范围为95℃至97℃；反应液含20-45％(V/V)甘油时首次变性温度范围为95℃至98℃。
4.根据权利要求3所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于应用5-20％(V/V)甘油时PCR循环中变性温度为94℃至60℃；应用20-45％(V/V)甘油时PCR循环中变性温度为93℃至60℃。
5.根据权利要求3或4所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于应用5-20％(V/V)甘油时第三个循环开始的最低变性温度比扩增产物的解链温度低1-4℃；应用20-45％(V/V)甘油时第三个循环开始的最低变性温度比扩增产物的解链温度低1-8℃。
6.权利要求1所述的反应液在减少PCR检测结果非专一性扩增产物中的应用。
7.权利要求1所述的反应液在减少PCR检测结果假阴性中的应用。
8.权利要求3所述的聚合酶链式反应方法在检测变异DNA序列中的应用。
9.应用权利要求1所述的反应液的反转录聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)在反转录酶催化下以RNA为模板合成DNA链；(2)DNA链模板变性；(3)引物退火；(4)DNA聚合酶催化下合成互补链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行合成反应；其特征在于当反应液含5-20％(V/V)甘油时PCR的首次变性温度范围为95℃至97℃；反应液含20-45％(V/V)甘油时首次变性温度范围为95℃至98℃。
10.根据权利要求9所述的反转录聚合酶链式反应方法，其特征在于应用5-20％(VN)甘油时PCR循环中变性温度为94℃至60℃；应用20-45％(V/V)甘油时PCR循环中变性温度为93℃至60℃。
全文摘要
本发明涉及一种含高浓度甘油的聚合酶链式反应的方法及其反应液和应用，特别地，采用在原有的PCR反应液中添加5－45％(V/V)甘油的高甘油配方，大大突破了现有的反应液甘油浓度，并且提供相应的提高首次变性温度至95℃－98℃、降低循环中变性温度至94℃－60℃的反应方法，使非专一性扩增产物显著下降，PCR结果中的假阴性减少，对于目标DNA序列的变异，其检出率亦获得提高。本发明的反应液和反应方法适用于分子生物学实验室高效的常规PCR扩增和快速而特异的临床医学核酸检测。
文档编号C12Q1/68GK1548544SQ0311701
公开日2004年11月24日 申请日期2003年5月20日 优先权日2003年5月20日
发明者徐定邦, 朱德芬, 孙崇荣, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧