专利名称：一种可用于引物评价的多用途模板的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于引物评价的多用途模板。
背景技术：
对于PCR技术来说，主要包括三个基本要素用于PCR反应的模板、引物以及必要的反应条件。而引物设计则是其中必不可少的步骤。对于大多数的实验来说设计引物并不是一件很困难的事情，但要保证每一引物都能工作且具有高的效率则几无可能。随着PCR技术的发展，从而产生了许多关于引物设计的新方法、新技术、新的发明专利，而且许多私人及大公司已开发了或正在开发用引物设计的应用软件，但其效果却不尽如人意。
一个PCR反应的成败，其决定因素有三个方面1)模板的质量与数量；2)引物数量与质量；3)模板与引物是否发生反应及反应条件是否适合。究竟是由于模板或引物的数量和质量的欠缺，还是由于引物在反应过程中形成了发夹结构或二聚体，而引起的PCR反应的失败则缺乏实用的评价方法。因此开发用于引物评价多用途模板，在基础研究和临床研究及应用方面具有广泛的前景，包括对普通PCR、多重PCR等PCR反应的引物评价，以及在新的实验技术及临床诊断新方法的开发过程中，对于各影响因素的分析，特别是在烈性传染病爆发流行及某些物种其DNA资源很稀少，无法保证研究安全性及难以获得标本的情况下，该多用途模板具有更重要的意义。
通常PCR反应原模板都是根据所要检测的个体而选择的，而引物的设计则是根据各文献已报道的各种方法、原理及利用各大公司和个人所设计的计算机应用软件来设计的。对于一个PCR反应体系来说，其引物是否参与反应，效率如何，都是通过PCR反应的结果来判断的，如果反应失败，通常认定为引物不工作，究竟是由于模板引起的还是由于引物引起则难以辨别。
就现在的技术而言，要在液相的PCR反应体系中使用特异性的模板对引物进行评价是完全可行的，但是，即便是在液相反应体系中，使用长链的模板对引物进行评价仍然是很困难的，更别说对基因芯片和其它固态或半固态反应价体系用特异性的模板对引物进行评价了，而要对以引物延伸反应为基础进行SNP分析的基因芯片的所有引物进行评价，则几乎是不可能的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种可用于引物评价的多用途模板，利用本发明，可对多种实验和检测用引物进行快速检测，保证实验的顺利进行。
本发明的技术方案概述如下一种可用于引物评价的多用途模板，该模板由三部分组成，(1)其五末端为摇摆碱基，(2)中间为含有特定碱基的核苷酸序列，(3)三末端为摇摆碱基。
所述的五末端的摇摆碱基数为15～50个，以22个为宜。
所述的三末端的摇摆碱基数为15～50个，以22个为宜。
所述的中间的含有特定碱基的核苷酸序列的碱基数为15～500个，优选的是20～100个，以45个为最佳。
本多用途模板具有如下优点和效果1.本发明的一种可用于引物评价的多用途模板可广泛用分子生物学研究的各个领域，简单、经济，降低了引物设计的难度及复杂性。
2.采用本发明的一种可用于引物评价的多用途模板对实验及检测用引物进行预先评价，可降低实验的风险性，便于对实验各环节进行分析，保证实验的顺利进行。
3.采用本发明的一种可用于引物评价的多用途模板对实验及检测用引物进行预先评价，可节约实验时间，若测试结果显示引物可用于实验，则实验失败是由于其它原因造成；若测试结果显示引物不能用于实验或临床检测，则需立即设计其他引物。
4.对于那些难以得到的基因或很稀有的珍贵标本，采用本发明的一种可用于引物评价的多用途模板预先对引物进行评价，可避免标本的损耗，节约原材料。
5.本发明的一种可用于引物评价的多用途模板用于引物评价时，所采用的PCR其反应体系、反应条件和反应原理与普通PCR相同，对PCR仪器及其它仪器设备也无特殊要求，凡能进行普通PCR操作的人员均能进行操作。
本发明的一种可用于引物评价的多用途模板的最大优点可利用单条引物进行双向引物延伸反应，这一点是本产品在国际上的初创。
图1为实施例结果电泳图。
具体实施例方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
在图1中M表示MARKER，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13表示不同的反应体系，1表示H1+模板，2表示H2+模板，3表示H1+H2+模板，4表示H1+H2，5表示I1+模板，6表示I2+模板，7表示I1+I2+模板，8表示I1+I2，9表示K1+模板，10表示K2+模板，11表示K1+K2+模板，12表示K1+K2，13表示仅有模板。
本发明所介绍的用于引物评价的多用途模板由三部分组成1)由15个至50个的摇摆碱基组成的五末端；2)由15个至500个碱基组成的具有确定碱基序列的中间部分；3)由15个至50个的摇摆碱基组成的三末端。其通式如下5′(n)a(N)b(n)c3′其中n表示摇摆碱基；(摇摆碱基存在于人工合成的DNA或引物中，在DNA或引物的合成过程中，对于同一位点，G、A、T、C四种碱基出现的频率相同，即含量相等，对于任意碱基的互补链，都可以找到与其配对的碱基序列，使得聚合反应能够进行，故称该位点的碱基为摇摆碱基。)N表示中间部分确定序列的碱基，a、b、c分别表示各部分的碱基数。其中50≥a≥15；500≥b≥15；50≥c≥15。
本发明一种可用于引物评价的多用途模板，可用于PCR反应(PCR指聚合酶链式反应。)、DNA测序等的引物评价。(引物指与特异模板中一段碱基序列互补的寡核苷酸，长度一般在10～50个碱基之间。)(聚合酶指具有合成核酸分子的酶，其反应温度可以是37℃，也可以高于37℃。)实施例1我们最近在开发SARS早期诊断方法的研究中，无法获得SARS病原标本，而SARS基因组序列则于4月13号就在网上公布了，为了检测我们所设计的几十条引物的敏感性与可靠性，我们发明了一种可用于引物评价的多用途模板，并已在实验室成功对两组SARS相关引物，及以前本实验室在进行神经性耳聋研究时所设计的在理论上应该有产物而无产物产生的引物进行了检测。
1)设计一条用于引物评价的多用途模板，其具体序列如下5′nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncatctgaact cttctgaagga(g∶t＝1∶1)cctgat cttctggtctaaacgaaa nnnnnnnnnnnnnnnnnnnn nn3′其五末端及三末端均为22个摇摆碱基，中间为45个序列固定的碱基，其序列与SARS基因组DNA的26307至26452号碱基序列相同。
2)用于引物评价的引物SARS相关引物H1ct tatgtactca ttcgtttcgg aagH2ata gtt agt tcg ttt aga cca gaa gI1aacta caagcaagtc gagcgtggcaI2cac agt tga gta tac ttt gcg aca tK1a cagtaataaaactgttggcg agctK2t ca cag ctt cta cac ccgttaaggt3)具体实验操作每一组引物分三管做，第一管反应底物为正向引物和多用途模板(H1+模板，I1+模板，K1+模板)，第二管反应底物为反向引物和多用途模板(H2+模板，I2+模板，K2+模板)，第三管反应底物为正向引物、反向引物和多用途模板(H1+H2+模板，I1+I2+模板，K1+K2+模板)。反应条件均为普通PCR的反应条件，94℃变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，循环40次。PCR完成后，通过琼脂糖凝胶电泳对结果进行分析。
4)结果如图1、表1所示，引物H1、H2和K1、K2三管均有引物延伸产物，而对于引物I1、I2，当反应底物为I1+模板时有产物，反应底物为I1+I2+模板时有部分产物，反应底物为I2+模板时，没有产物。以上结果说明H1、H2和K1、K2两套引物在反应过程中不会单独形成发夹结构，也不会相互结合而形成二聚体，可用于实际操作；I1、I2这套引物中，有I1存在时，就会有产物，说明I1在反应过程中没有单独形成发夹结构，也不会与I2形成二聚体；而I2当其单独存在时，没有产物，并且I1+I2+模板的反应体系中，产物与I1+模板反应体系相比，产物量并不随着引物的增加而增加，说明I2在反应过程中形成了发夹结构，不参加引物延伸反应，因此该套引物不能用于实际操作。
以上实验结果显示引物对H1和H2、K1和K2可用实验，而I1和I2因为I2在反应体系中形成了发夹结构，所以不用于实验。证明该多用途模板可用于引物效率评价。
实验例2设计一条用于引物评价的多用途模板，其五末端及三末端均为15个摇摆碱基，中间为45个序列固定的碱基。
实验例3
设计一条用于引物评价的多用途模板，其五末端及三末端均为50个摇摆碱基，中间为15个序列固定的碱基。
实验例4设计一条用于引物评价的多用途模板，其五末端及三末端均为25个摇摆碱基，中间为100个序列固定的碱基。
实验例5设计一条用于引物评价的多用途模板，其五末端及三末端均为50个摇摆碱基，中间为500个序列固定的碱基。
实验例6设计一条用于引物评价的多用途模板，其五末端及三末端均为44个摇摆碱基，中间为200个序列固定的碱基。
权利要求
1.一种可用于引物评价的多用途模板，其特征在于该模板由三部分组成，(1)五末端为摇摆碱基，(2)中间为含有特定碱基的核苷酸序列，(3)三末端为摇摆碱基。
2.如权利要求1所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的五末端的摇摆碱基数为15～50个。
3.如权利要求1所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的三末端的摇摆碱基数为15～50个。
4.如权利要求1所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的中间的含有特定碱基的核苷酸序列的碱基数为15～500个。
5.如权利要求2所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的五末端的摇摆碱基数为22个。
6.如权利要求3所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的三末端的摇摆碱基数为22个。
7.如权利要求4所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的中间的含有特定碱基的核苷酸序列的碱基数为20～100个。
8.如权利要求7所述的一种可用于引物评价的多用途模板，其特征是所述的中间的含有特定碱基的核苷酸序列的碱基数为45个。
全文摘要
本发明公开了一种可用于引物评价的多用途模板，该模板由三部分组成，(1)五末端为摇摆碱基，(2)中间为含有特定碱基的核苷酸序列，(3)三末端为摇摆碱基，五末端的摇摆碱基数为15～50个，三末端的摇摆碱基数为15～50个，中间的含有特定碱基的核苷酸序列的碱基数为15～500个，本发明对实验及检测用引物进行预先评价，可降低实验的风险性，便于对实验各环节进行分析；节约实验时间；对难以得到的基因或很稀有的珍贵标本，可预先对引物进行评价，可避免标本的损耗，节约原材料；可利用单条引物进行双向引物延伸反应，本发明广泛用分子生物学研究的各个领域，简单、经济，降低了引物设计的难度及复杂性。
文档编号C12P19/00GK1563403SQ200410018788
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月24日 优先权日2004年3月24日
发明者张佳, 胡应和, 廖端芳, 陈琳玲, 张旭, 孟博, 侯赛因·帕丁纳斯, 李凯 申请人:南华大学