专利名称：非同步链延伸聚合酶链反应的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种正负两条链非同步合成的DNA体外扩增技术。
在现有的DNA体外扩增技术中，聚合酶链反应(polymeras chain reaction，PCR)是最主要也是最有效的技术。该技术系将含有耐热DNA聚合酶、特异性引物、dNTP底物、模板DNA、镁离子等的反应体系反复进行高温模板变性、低温引物与模板结合、中温引物延伸的热循环，而使靶DNA片段在体外得到扩增。但在扩增较大拷贝数的重复序列时，由于重复序列模板很容易发生退火，常规PCR很难获得满意的扩增结果。首先是扩增效率低，一般的检测手段如溴乙锭染色或银染难以检测，其次是容易出现多条影子带，影响扩增结果的判定。我们认为这主要是由于重复序列在低温和中温时很容易相互退火，影响了新链的合成过程和合成效率造成的。目前尚未见从根本上解决这一难题的办法。
本发明目的在于提供一种操作简单，能够有效扩增较大拷贝数的重复序列的DNA体外扩增技术。
本发明非同步链延伸聚合酶链反应(asynchronous strand-extension polymerase chain reaction，ASE-PCR)首先根据待扩增的靶DNA序列合成一对特异性的单链引物，这一对引物界定要扩增的靶DNA片段，再根据要扩增的重复序列合成一段15-20碱基的重复序列，并在其3’-末端进行加双脱氧核苷酸或磷酸化修饰，使其失去延伸能力，记作寡重复序列(oligo-repeat sequence，ORS)。将ORS、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系，在热循环仪上进行高温、低温、中低温、中温的反复热循环。反应体系处于高温时，模板DNA变性；体系降到低温和中低温时，引物与特异的靶DNA结合引导新链的合成，同时，ORS与其互补链的重复序列退火，从而抑制模板之间的重复序列相互退火。中低温时未与ORS结合的链能够作为模板首先指导合成完整互补新链；与ORS结合的链则在重复序列区新链延伸受阻，不能合成完整互补新链。中温时ORS从与其结合的模板链上脱离下来，该模板此时则可以指导合成完整互补新链。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的含重复序列的靶DNA片段。
下面以扩增脆性X智力低下1号基因(fragile X mental retardation 1，FMR1)的5’非翻译区为例来进行详细说明。
首先根据FMR1的序列(GenBanK S74494和Nature Genet，8(1)88-94，1994)合成一对FMR1特异的正引物FF5’-GTTTCGGTTTCACCTTCCGGTGGAGG-3’，FR5’CCTCCATCTTCTCTTCAGCCCTGC-3’；再合成寡重复序列并在其3’-末端进行磷酸化或加双脱氧核苷酸修饰5’-CGGCGGCGGCGGCGGCGG-3’，记作ORS混合50ul反应体系，内含两引物各20pmol，寡重复序列ORS100pmol正常人DNA 50-100 ng，1XPCR缓冲液，Taq DNA聚合酶2u，Mg++终浓度2mmol／L，在96℃下变性5分钟，然后在PE9600上按96℃20秒，56℃30秒，65℃30秒，75℃1分30秒下循环35次，2％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察，可以发现预期大小的DNA条带。
上述反应体系中，反应体系处于高温时，模板DNA变性；体系降到56℃和65℃时，引物与特异的靶DNA结合引导新链的合成，同时，ORS与(GCC)n重复序列退火，从而抑制模板之间的重复序列相互退火，使未与ORS结合的(CGG)n链能够作为模板首先指导合成完整的互补新链；与ORS结合的链则在重复序列区新链延伸受阻，不能合成完整互补新链。75℃时ORS从(GCC)n模板链上脱离下来，使该模板此时可以指导合成完整互补新链。这样经过25-35个热循环后，就能获得上百万拷贝的特异的含重复序列的靶DNA片段。
权利要求
1.一种将含有寡重复序列、引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等的反应体系进行高温、低温、中低温、中温反复热循环而达到目的DNA片段大量扩增的DNA体外扩增技术，其中的寡重复序列为依据靶DNA的重复序列合成的与其一条链的一小段重复序列互补的寡核苷酸，其3’-末端经过修饰失去了延伸能力；该寡重复序列在热循环过程中的低温和中低温阶段时，与相应的互补模板链的重复序列退火，从而抑制模板之间的重复序列相互退火，使另一条模板链首先指导合成完整的互补新链；在热循环过程中的中温阶段时，从与其结合的模板链上脱离下来，该模板随即指导合成完整互补新链；经过多次的热循环，产生大量的目的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的DNA体外扩增技术，其特征在于反应体系中含有寡重复序列。
3.根据权利要求2所述的寡重复序列，其特征为系依据靶DNA的重复序列合成的3’-末端经过修饰失去延伸能力的与一条链的重复序列互补的15-25nt的寡核苷酸。
4.根据权利要求3所述的3’-末端经过修饰的失去延伸能力的寡核苷酸，其3’-末端进行磷酸化或加双脱氧核苷酸修饰，或使用能够与正引物特异结合但又不能在耐热DNA聚合酶的作用下延伸的其他物质，如肽核酸(PNA)。
5.根据权利要求1所述的DNA体外扩增技术，依据该技术装配的DNA体外扩增试剂盒。
全文摘要
本发明是一种两条链非同步延伸的DNA体外扩增技术。首先根据待扩增的靶DNA序列合成一对特异性引物,再合成一条3’－末端经过修饰的失去延伸能力的一条靶DNA链的重复序列互补的寡重复序列。将该寡重复序列、链引物、耐热DNA聚合酶、dNTP底物、模板DNA、镁离子、PCR缓冲液、超纯水等混匀成反应体系,在热循环仪上进行高温、低温、中低温、中温和反复热循环,从而获得上百万拷贝的特异的靶DNA片段。本发明中的寡重复序列在热循环过程中的低温和中低温阶段时,与相应的互补模板链的重复序列退火,从而抑制模板之间的重复序列相互退火,使另一条模板链首先指导合成完整的互补新链;在热循环过程中的中温阶段时,则从模板链上脱离下来,并允许另一完整互补新链的合成。经过多次的热循环,产生大量的靶DNA片段。
文档编号C12Q1/68GK1278558SQ99114949
公开日2001年1月3日 申请日期1999年6月22日 优先权日1999年6月22日
发明者夏庆杰 申请人:夏庆杰