一种针对合成基因定点突变修复的方法
【专利摘要】本发明公开了一种针对合成基因定点突变修复的方法，包括以下步骤：（1）根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正、反向引物；（2）以含有突变基因的质粒为模板，加入正、反向引物，在高保真DNA聚合酶的作用下进行环状延伸PCR；（3）采用DpnI酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2）产物进行酶切，去除质粒模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌感受态细胞，挑选转化子测序验证。本发明的方法正向引物、反向引物设计简便，扩增效率高；引物与模板的结合效率高，目的条带易得；修复成功率高。不需胶回收、无需连接与筛选，是一种简便可行、成功率高、节约时间、降低成本的针对合成基因定点突变修复的方法。
【专利说明】一种针对合成基因定点突变修复的方法 【技术领域】
[〇〇〇1] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种针对合成基因定点突变修复的方法。 【背景技术】
[0002] 基因突变是指DNA分子上核苷酸序列或数目发生改变。由一个或一对碱基发生改 变引起的核苷酸序列改变所致的突变，称为定点突变。定点突变的方式包括碱基的替换、插 入和缺失。
[0003] 碱基替换改变了密码子的组成，可能会出现四种不同的生物学效应：同义突变、错 义突变、无义突变和终止密码突变。
[0004] 在DNA编码序列中插入或缺失一个或几个碱基对（3个或3的倍数除外)，从而使 插入或缺失点以后的DNA编码框架全部改变，这种基因突变称为移码突变。其结果导致插 入或缺失以后部分翻译出的氨基酸的种类和顺序也发生改变，从而影响蛋白质或酶的生物 功能。
[0005] 随着合成生物学的快速发展，对异源基因优化与合成的需求不断增加。在人工 合成基因的过程中，由于单链寡核苷酸精度与纯度的限制（Ai-Sheng Xiong，Quan-Hong Yao，Ri_He Peng，et al.Nature Protocols.2006, 1(2):791_797·)，以及基因序列的复杂 性，如：重复序列、GC含量分布不均、二级结构复杂等，导致基因突变。如若从头合成，则面 临着成功率低、时间与资源浪费的双重风险，这些客观因素导致的基因突变是常规基因合 成无法避免的，基因突变修复显然是更简便可行、成功率高、节约时间、降低成本的一种方 法。
[0006] 基因突变修复可以采用商业化的定点突变试剂盒，但该试剂盒价格昂贵，在针 对合成基因突变的多种复杂情况时，效率较低。而较常用的基因突变修复技术搭桥PCR (Yue-Hua Xiao，Meng_Hui Yin，Lei Hou，et al.Biotechnol Lett. 2007, 29:925-930)，虽然 成本较低，但是需要经过两轮PCR，两步胶回收，需要连接与筛选，步骤稍显繁琐，周期略长。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简便可行、成功率高、节约时 间、降低成本的针对合成基因定点突变修复的方法。
[0008] 本发明的技术方案概述如下：
[0009] -种针对合成基因定点突变修复的方法，包括以下步骤：
[〇〇1〇] 一种针对合成基因定点突变修复的方法，包括以下步骤：
[〇〇11] (1)根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正向引物和反向引物；
[0012] (2)以含有突变基因的质粒为模板，加入步骤（1)合成的正向引物和反向引物，在 高保真DNA聚合酶的作用下进行环状延伸PCR ;
[0013] (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒 模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌感受态细胞，挑选转化子测 序验证。
[0014] 步骤（1)所述突变为一个碱基对的替换、一个碱基对的插入或一个碱基对的缺失。
[0015] 正向引物长度优选为50?80个碱基，反向引物长度优选为50?80个碱基，在正 向引物、反向引物的5'端优选具有15?45个碱基的重叠区，修复位点位于重叠区。
[0016] 正向引物为SEQ ID N0. 1、SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 5所示的序列；反向引物为 SEQIDN0·2、SEQIDN0·4或SEQIDN0·6所示的序列，其中SEQIDN0·1和SEQIDN0·2 成对；SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 成对；SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 成对。
[0017] 正向引物、反向引物的5'端最好是具有23?40个碱基的重叠区，修复位点位于 重叠区。
[0018] 步骤（2) PCR的程序为温度梯度PCR或降落PCR。
[〇〇19] 温度梯度PCR的反应条件为：
[0020] 95°C 预变性 2min ?5min ;
[0021] 95°C 变性 20s ?30s ;51°C ?66°C 退火 30s ;72°C 延伸，延伸时间 lmin/2kb ? lmin/4kb ;25 ?35 个循环；
[0022] 72? 延伸 5min ?10min。
[0023] 降落PCR的反应条件为：
[0024] 95°C 预变性 2min ?5min ;
[0025] 95°C 变性 20s ?30s ;50°C ?69°C 退火 30s ;72°C 延伸，延伸时间 lmin/2kb ? lmin/4kb ;25?35个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环降低0. 3°C?0. 5°C ;
[0026] 72? 延伸 5min ?10min。
[0027] 本发明的优点：本发明提出了一种在人工合成基因突变率较高的情况下，对已有 的基因定点突变进行修复的方法。本发明的方法正向引物、反向引物设计简便，提高了扩增 的效率；PCR程序提供了温度梯度PCR和降落PCR两种可选的优化程序，提高了引物与模板 的结合效率，使得目的条带更易获得；目的条带无需纯化、允许非特异条带的存在，酶切反 应后，无需将酶灭活即可进行大肠杆菌转化实验；转化后得到的转化子无需菌落PCR或提 质粒酶切验证，即可扩大培养后直接测序验证，而且，修复成功率很高。不需胶回收、无需连 接与筛选，是一种简便可行、成功率高、节约时间、降低成本的针对合成基因定点突变修复 的方法。 【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1是本发明实施例1的F214-1的常规引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0029] 图2是本发明实施例2的Q213-8的常规引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0030] 图3是本发明实施例2的Q213-8的本发明的引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 图；
[0031] 图4是本发明实施例3的H407-14的本发明的引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 图；
[0032] 图5是本发明实施例4的K401-6的本发明的引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测 图。 【具体实施方式】
[0033] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明作进一步的详细说明，但本发明并不局限于此。
[0034] 大肠杆菌T0P10等宿主细胞具有甲基化酶基因，能够将体内质粒甲基化。因此，从 大肠杆菌T0P10细胞提取的含有突变基因的质粒上有被甲基化的位点。而Dpnl酶能够识 别甲基化的GATC位点。
[0035] 实施例1 :基因片段F214 (SEQ ID N0. 11)的定点突变修复
[0036] (1)与正确DNA序列相比，定点突变菌株F214-1 (宿主菌是大肠杆菌T0P10菌株） 在DNA序列的439位碱基缺失，突变位点处有连续的5个T，在基因合成时易发生插入或缺 失突变；
[0037] 根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的常规正向引物、反向引物(修 复位点加下划线、字体加粗表示）；常规正向引物为SEQ ID N0. 7所示的序列，反向引物为 SEQ ID N0. 8所示的序列；
[0038] (2)以含有突变基因的质粒为模板，加入SEQ ID N0. 7所示常规正向引物、SEQ ID NO. 8所示常规反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金）的作用下进行环状 延伸PCR ;PCR程序为温度梯度PCR ;
[0039] (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒 模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌感受态细胞，挑选转化子测 序验证。
[0040] 常规正向引物为：SEQ ID NO. 7:5 ' -GGTATGGCGGGITTIlCGAITTGGAAG-3 '（ Tm 值 64. 8°C，Vector NTI AdvancelO 计算）
[0041] 常规反向引物为：SEQ ID NO. 8:5'-GAAAAACCCGCCATACCTGTTCAAATTTACC-3'（Tm 值 64.7°C，Vector NTI AdvancelO 计算）
[0042] PCR反应体系：
[0043] 5XPCR 缓冲液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（10μΜ) 1 μ 1，模板质粒（100 ?200ng)0. 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25 μ 1， 加水补足至25 μ 1。
[0044] 同样的反应体系做4个温度梯度平行。
[0045] 温度梯度PCR反应条件：
[0046] 95°C 预变性 5min ;
[0047] 95°C变性30s ;51°C?66°C温度梯度（Bio-Rad PCR仪，A-H8个通道的温度分别 为 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根据常规引物的退 火温度选用ABCD四个温度，退火30s ;72°C延伸2min20s (质粒长度为733bp，TransStart FastPfu DNA聚合酶的延伸速率为15s/kb?30s/kb) ;30个循环；
[0048] 72? 延伸 10min。
[0049] 1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μ 1 PCR产物，如图1所示，Μ为1Kb DNA Ladder，ABCD 为从高温到低温的四个平行PCR产物，检测出目的条带。
[0050] 选用A通道的PCR产物进行后续实验。
[0051] Dpnl酶切去除甲基化的模板质粒：
[0052] 酶切反应体系：10 X酶切缓冲液1 μ 1，PCR产物8. 5 μ 1，Dpnl酶0. 5 μ 1，总体积 10 μ 1〇
[0053] 反应条件：37°C，lh。
[0054] 取5 μ 1酶切产物转化50 μ 1大肠杆菌T0P10感受态细胞，37°C过夜培养。
[0055] 挑取单菌落，在含终浓度50ng/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37°C，220r/min过 夜培养。
[0056] 测序验证。
[0057] 测序结果：送测的五个克隆全部修复成功。
[0058] 实施例2 :基因片段Q213 (SEQ ID N0. 12)的定点突变修复
[0059] 对于突变位点附近DNA序列环境较为简单的定点突变，以常规引物利用本发明优 化的PCR程序即可达到修复效果，但是对于突变位点附近DNA序列环境相对复杂的定点突 变，常规引物很难扩增出目的条带，而本发明的引物能扩增出目的条带。
[0060] (1)与正确DNA序列相比，定点突变菌株Q213-8 (宿主菌是大肠杆菌T0P10菌株） 在DNA序列的433位碱基C突变为T，突变位点附近有TATAA等重复序列，容易在基因合成 时发生突变，对基因合成及突变修复都提出了较高的要求；
[0061] 根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正向引物、反向引物(修复位 点加下划线、字体加粗表示）；正向引物为SEQ ID NO. 1所示的序列，反向引物为SEQ ID NO. 2所示的序列；设计了由SEQ ID NO. 9所示的常规正向引物和SEQ ID NO. 10所示的常 规反向引物作为对照实验；
[0062] (2)以含有突变基因的质粒为模板，加入SEQ ID NO. 1所示正向引物、SEQ ID N0. 2 所示反向引物，或加入SEQ ID NO. 9所示常规正向引物、SEQ ID NO. 10所示常规反向引物， 在TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金）的作用下进行环状延伸PCR;PCR程序为温度 梯度PCR ;
[0063] (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒 模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑选转 化子测序验证。
[0064] 常规正向引物为：SEQ ID NO. 9:5' -GACTAGTTTATAACTT￡GTATAATGTACATTATACG-3' (Tm 值 51.8°C，Vector NTI AdvancelO 计算）
[0065] 常规反向引物为：SEQ ID Ν0· 10:5' -￡AAGTTATAAACTAGTCACTTGAATCGG-3'（Tm 值 51. 5°C，Vector NTI AdvancelO 计算）
[0066] 正、反向引物在5'端存在40个碱基的重叠区，正、反向引物分别为：
[0067] SEQ ID NO. 1:5, -TTTATAACTTCGTATAATGTACATTATACGAAGTTATTTGTATACTTTTTTAAT GAAGATGACATTGCTCC-3 '
[0068] SEQ ID NO. 2:5, -CAAATAACTTCGTATAATGTACATTATACGAAGTTATAAACTAGTCACTTGAAT CGGTAATACCTTTTTCACCAAT-3 '
[0069] PCR反应体系：
[0070] 5XPCR 缓冲液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（10μΜ) 1 μ 1，模板质粒（100 ?200ng)0. 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25 μ 1， 加水补足至25 μ 1。
[0071] 同样的反应体系做4个温度梯度平行。
[0072] 温度梯度PCR反应条件：
[0073] 95Γ 预变性 2min;
[0074] 95°C变性20s ;51°C?66°C温度梯度（Bio-Rad PCR仪，A-H8个通道的温度依次 为 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根据常规引物的退火 温度选用EFGH四个温度，退火30s ;72°C延伸2min20s (质粒长度为4419bp，TransStart FastPfu DNA聚合酶的延伸速率为15s/kb?30s/kb) ;25个循环；
[0075] 72? 延伸 5min。
[0076] 1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μ 1 PCR产物，如图2所示，Μ为1Kb DNA Ladder，1、2、 3、4为常规引物PCR产物，未检测出目的条带，平行实验即本发明的引物PCR产物检测出目 的条带，如图3所示，EFGH为从高温到低温的四个平行PCR产物。
[0077] 选用本发明的引物E通道的PCR产物进行后续实验。
[0078] 其余操作步骤参照实施例1。
[〇〇79] 测序结果：送测的五个克隆全部修复成功。
[0080] 实验证明，温度梯度PCR反应条件还可以是：
[0081] 95°C 预变性 5min ;
[0082] 95°C变性30s ;51°C?66°C温度梯度（Bio-Rad PCR仪，A-H8个通道的温度依次 为 66. 0°C、64. 8°C、63. 0°C、60. 1°C、56. 5°C、53. 9°C、52. 0°C、51. 0°C)，根据常规引物的退火 温度选用EFGH四个温度，退火30s ;72°C延伸2min20s (质粒长度为4419bp，TransStart FastPfuDNA聚合酶的延伸速率为15s/kb?30s/kb) ;35个循环；
[0083] 72°C延伸lOmin。其它同本实施例，也可以对基因片段Q213的定点突变进行修复。
[0084] 实施例3 :基因片段H407 (SEQ ID N0. 13)的定点突变修复
[0085] (1)与正确DNA序列相比，定点突变菌株H407-14(宿主菌是大肠杆菌T0P10菌株） 在DNA序列的213位后插入碱基T，常规引物未扩增出目的条带；
[〇〇86] 根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正向引物和反向引物(修复 位点加下划线、字体加粗表示）；正向引物为SEQ ID N0. 3所示的序列，反向引物为SEQ ID NO. 4所示的序列；
[0087] (2)以含有突变基因的质粒为模板，加入SEQ ID N0. 3所示正向引物、SEQ ID N0. 4 所示反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下进行环状延伸PCR ;PCR程序为 降落PCR ;
[0088] (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒 模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑选转 化子测序验证。
[0089] 正向引物、反向引物在5'端存在45个碱基的重叠区，正、反向引物分别为：
[0090] SEQ ID NO. 3:5, -GCATTATTTCTGTTTAGTTGATAAATTTTGATTTCTAGTCTGTTGAAAGCCTAA TGCATGCAGATGACATA-3 ?
[0091] SEQ ID NO. 4:5, -CAACAGACTAGAAATCAAAATTTATCAACTAAACAGAAATAATGCAACGTCTCA TAAAGTATTTACTGG-3'
[0092] PCR反应体系：
[0093] 5XPCR 缓冲液 5μ 1，2· 5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ)1μ 1，反向引物（ΙΟμΜ) 1 μ 1，模板质粒（100 ?200ng)0. 25μ l，TransStart FastPfu DNA聚合酶(全式金)0· 25μ 1， 加水补足至25 μ 1。
[0094] 降落PCR的反应条件为：
[0095] 95°C 预变性 5min ;
[0096] 95°C变性 30s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (质粒长度 4512bp);35 个循环， 每个循环的退火温度比前一循环降低〇. 3°C ;
[0097] 72°C 延伸 7min。
[0098] 1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μ 1 PCR产物，如图4所示，Μ为1Kb DNA Ladder，S1为 PCR产物，检测出目的条带。
[0099] 其余操作步骤参照实施例1。
[0100] 测序结果：送测的五个克隆修复成功两个。
[0101] 实施例4 :基因片段K401 (SEQ ID N0. 14)的定点突变修复
[0102] (1)与正确DNA序列相比，定点突变菌株K401-6 (宿主菌是大肠杆菌T0P10菌株） 在DNA序列的464位碱基缺失，常规引物未扩增出目的条带；
[0103] 根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正向引物和反向引物(修复 位点加下划线、字体加粗表示）；正向引物为SEQ ID N0. 5所示的序列，反向引物为SEQ ID NO. 6所示的序列；
[0104] (2)以含有突变基因的质粒为模板，加入SEQ ID N0. 5所示正向引物、SEQ ID N0. 6 所示反向引物，在TransStart FastPfu DNA聚合酶的作用下进行环状延伸PCR ;PCR程序为 降落PCR ;
[0105] (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒 模板得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，挑选转 化子测序验证。
[0106] 正向引物和反向引物在5'端存在23个碱基的重叠区，正、反向引物分别为：
[0107] SEQ ID NO. 5:5, -TACAGCTGCCGCTATTGCGTATGGGCTGGACAAGAAATCGCAGAAGGAGCACAA CGTC-3 ,
[0108] SEQ ID NO. 6:5, -CATACGCAATAGCGGCAGCTGTAGGTTCATTAATGATACGAAGAACGTTCAAGC CCGCGA-3 ,
[0109] PCR 反应体系：5XPCR 缓冲液 5μ l，2.5mM dNTPs5y 1，正向引物（10μΜ) 1μ 1，反 向弓丨物（10 μ Μ) 1 μ 1，模板质粒（100 ?200ng) 0· 25 μ 1，TransStart FastPfu DNA 聚合酶 (全式金）0. 25 μ 1，加水补足至25 μ 1。
[0110] 降落PCR反应条件：
[0111] 95°C 预变性 5min ;
[0112] 95°C变性 30s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (质粒长度 4599bp);30 个循环， 每个循环的退火温度比前一循环降低〇. 5°C ;
[0113] 72°C 延伸 5min。
[0114] 1%琼脂糖凝胶电泳检测5 μ 1 PCR产物，如图5所示，Μ为1Kb DNA Ladder，S2为 PCR产物，检测出目的条带。
[0115] 其余操作步骤参照实施例1。
[0116] 测序结果：送测的五个克隆修复成功三个。
[0117] 实验证明，降落PCR反应条件还可以选用：
[0118] 95°C 预变性 2min ;
[0119] 95°C变性 20s ;69°C，退火 30s ;72°C延伸 2min20s (质粒长度 4599bp);25 个循环， 每个循环的退火温度比前一循环降低〇. 5°C ;
[0120] 72°C延伸lOmin。其它同本实施例，也可以对基因片段K401的定点突变进行修复。
[0121] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保 护范围。
[0001]
【权利要求】
1. 一种针对合成基因定点突变修复的方法，其特征在于包括以下步骤： (1)根据基因定点突变的碱基位置设计包含修复位点的正向引物和反向引物； (2 )以含有突变基因的质粒为模板，加入步骤（1)合成的正向引物和反向引物，在高保 真DNA聚合酶的作用下进行环状延伸PCR ; (3)采用Dpnl酶将琼脂糖凝胶电泳检测正确的步骤（2)产物进行酶切，去除质粒模板 得到具有修复位点的带有缺刻的开环质粒；转化大肠杆菌感受态细胞，挑选转化子测序验 证。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)所述突变为一个碱基对的替 换、一个碱基对的插入或一个碱基对的缺失。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于正向引物长度为50?80个碱基，反向引物 长度为50?80个碱基，在正向引物、反向引物的5'端具有15?45个碱基的重叠区，修复 位点位于重叠区。
4. 根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述正向引物为SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 5所示的序列；所述反向引物为SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 6 所示的序列，其中 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 成对；SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 成 对；SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 成对。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述正向引物、反向引物的5'端具有23? 40个碱基的重叠区，修复位点位于重叠区。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2) PCR的程序为温度梯度PCR或降 落 PCR。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述温度梯度PCR的反应条件为： 95°C 预变性 2min ?5min ; 95 °C变性20s?30s ;51 °C?66 °C退火30s ;72 °C延伸，延伸时间lmin/2kb? lmin/4kb ;25 ?35 个循环； 72°C延伸 5min ?10min。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述降落PCR的反应条件为： 95°C 预变性 2min ?5min ; 95 °C变性20s?30s ;50 °C?69 °C退火30s ;72 °C延伸，延伸时间lmin/2kb? lmin/4kb ;25?35个循环，其中每个循环的退火温度比前一循环降低0. 3°C?0. 5°C ; 72°C延伸 5min ?10min。
【文档编号】C12N15/10GK104109665SQ201310141220
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2013年4月22日 优先权日:2013年4月22日
【发明者】李炳志, 王霞, 赵鹃, 元英进 申请人:天津大学