用于诊断、监测和治疗肥胖和/或糖尿病的组合物、试剂和试剂盒以及方法

专利名称：用于诊断、监测和治疗肥胖和/或糖尿病的组合物、试剂和试剂盒以及方法
技术领域：
本发明涉及肥胖和糖尿病标记物，涉及可以检测肥胖和糖尿病标记物转录物和翻译产物的试剂，涉及用于检测肥胖和糖尿病标记物转录物和翻译产物的试剂盒，涉及用于筛查和诊断个体中的肥胖和糖尿病以及监测诊断为患有肥胖和糖尿病的患者中的治疗反应、疾病进展和疾病复发的方法和试剂盒，涉及特异性结合于肥胖和/或糖尿病标记物转录物的翻译产物的化合物，涉及用几种肥胖和糖尿病标记物或其翻译产物的组合物作为治疗剂治疗肥胖和/或糖尿病，涉及用于治疗肥胖和/或糖尿病的组合物和方法。
背景技术：
肥胖在美国是第二重要的可预防性的死亡原因。估计在美国，肥胖影响58,000,000人，每年导致300,000人死亡，并且其发病率逐渐增加。患有该疾病的个体患高血压、脂紊乱、冠心病、II型糖尿病、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠呼吸暂停、呼吸问题和某些癌症的风险增加。
当摄取的能量相对使用的能量过量时，发生肥胖。该过量的原因在不同的患者之间可能是不同的，并且认为来源于多种遗传学、社会和环境因素。目前的研究支持以下观点，即，在相同的环境条件下，不同的人以不同的速度增长体重，他们获得的量似乎是遗传决定的。已经提出了自然选择导致我们的远古祖先获得了“健壮基因”，它们加强了从每次饱食储存脂肪的能力，以便维持身体经过下一次饥荒。在目前的过度的高脂肪、高卡路里“西方式”食物的环境中，“健壮基因”成为一种倾向。
越来越多的科学家和医生开始反对传统的观点，即不良的饮食控制和缺乏锻炼是肥胖的原因，他们越来越倾向于将其看作一种医学状况。健康经济学家用前瞻性研究和国家健康统计学计算了1995年美国的肥胖造成的损失为992亿美元。到2005年，估计全球将有超过1亿2千万人肥胖。肥胖在美国的经济影响目前已经与糖尿病相似，并且并列于心脏病和高血压。医学研究者计算出在超重的美国人中诊断的至少88％的II型糖尿病所有病例、57％的冠心病病例、11％的乳腺癌和10％的结肠癌可以归因于肥胖。
世界卫生组织将肥胖状况分类为流行病，并且建立了特派工作组以解决对人类健康和的最大威胁。
仍然需要肥胖和/或糖尿病特异性标记物。仍然需要能够用于检测患者样品中肥胖和/或糖尿病标记物的存在的试剂和试剂盒。仍然需要能够用于检测患者样品中发生肥胖和/或糖尿病的未来倾向的试剂和试剂盒。仍然需要筛查和诊断患有肥胖和/或糖尿病的个体的方法和监测诊断为患有肥胖和/或糖尿病的患者中的治疗反应、疾病进展和疾病复发的方法。
仍然需要用于确定肥胖个体所患有的肥胖和/或糖尿病的类型的试剂、试剂盒和方法。仍然需要能够特异性导向于肥胖和/或糖尿病相关细胞的组合物。仍然需要治疗怀疑患有肥胖和/或糖尿病的个体的改进的方法。
术语表以下说明书和权利要求中常常会用到多个术语，所述术语的含义应该根据本发明进行如下解释“肥胖和/或糖尿病核酸序列”——SEQ ID NO1-SEQ ID NO4和SEQ ID NO22-SEQ ID NO25的任一个中所示的序列、与所述序列具有至少90％同一性的序列(参见下文表2)和上述序列的长度为至少15b.p.的片段。这些序列是编码天然和已知的Adiponectin的天然存在的可变剪接变体的序列，所述Adiponectin在Locus Link中描述为基因座Hs.9370，编号为NM_004797，它是244个氨基酸的人30kDa糖蛋白的编码序列。应该强调，本发明的新变体是得自Adiponectin的可变剪接的天然存在的序列，而不仅仅是该基因的截短、突变或片段形式。
——SEQ ID NO5-SEQ ID NO9和SEQ ID NO26-SEQ ID NO30的任一个中所示的序列、与所述序列具有至少90％同一性的序列(参见下文表2)和上述序列的长度为至少15b.p.的片段。这些序列是编码天然和已知的Adiponectin的天然存在的可变剪接变体的序列，所述Adiponectin在Locus Link中描述为基因座Mm.11450，编号为NM_009605，它是247个氨基酸的小鼠30kDa糖蛋白的编码序列。应该强调，本发明的新变体是得自Adiponectin的可变剪接的天然存在的序列，而不仅仅是该基因的截短、突变或片段形式。
——SEQ ID NO10-SEQ ID NO11和SEQ ID NO31-SEQ ID NO32的任一个中所示的序列、与所述序列具有至少90％同一性的序列(参见下文表2)和上述序列的长度为至少15b.p.的片段。这些序列是编码天然和已知的Ghrelin的天然存在的可变剪接变体的序列，所述Ghrelin在Locus Link中描述为基因座Hs.51738，编号为NM_016362，它是117个氨基酸的人13kDa糖蛋白的编码序列。应该强调，本发明的新变体是得自Ghrelin的可变剪接的天然存在的序列，而不仅仅是该基因的截短、突变或片段形式。
——SEQ ID NO12-SEQ ID NO18和SEQ ID NO33-SEQ ID NO39的任一个中所示的序列、与所述序列具有至少90％同一性的序列(参见下文表2)和上述序列的长度为至少15b.p.的片段。这些序列是编码天然和已知的11-β-HSD的天然存在的可变剪接变体的序列，所述11-β-HSD在Locus Link中描述为基因座Hs.3290，编号为NM_005525，它是292个氨基酸的人32kDa糖蛋白的编码序列。应该强调，本发明的新变体是得自11-β-HSD的可变剪接的天然存在的序列，而不仅仅是该基因的截短、突变或片段形式。
——SEQ ID NO19-SEQ ID NO21和SEQ ID NO40-SEQ ID NO42的任一个中所示的序列、与所述序列具有至少90％同一性的序列(参见下文表2)和上述序列的长度为至少15b.p.的片段。这些序列是编码天然和已知的11-β-HSD的天然存在的可变剪接变体的序列，所述11-β-HSD在Locus Link中描述为基因座Mm.15483，编号为NM_008288，它是292个氨基酸的小鼠32kDa糖蛋白的编码序列。应该强调，本发明的新变体是得自11-β-HSD的可变剪接的天然存在的序列，而不仅仅是该基因的截短、突变或片段形式。
下表1概括了肥胖和/或糖尿病相关基因变体和它们与原始序列的不同
表1
SEQ ID NOS1-21是核苷酸序列。
SEQ ID NOS22-42是由SEQ ID NOS 1-21编码的蛋白序列。
表2SEQ ID NO1-9 Adiponectin变体SEQ ID NO1NM_004797_T1|长度4517CTGATTCCATACCAGAGGGGCTCAGGATGCTGTTGCTGGGAGCTGTTCTACTGCTATTAGCTCTGCCCGGGCATGACCAGGAAACCACGACTCAAGGGCCCGGAGTCCTGCTTCCCCTGCCCAAGGGGGCCTGCACAGGTTGGATGGCGGGCATCCCAGGGCATCCGGGCCATAATGGGGCCCCAGGCCGTGATGGCAGAGATGGCACCCCTGGTGAGAAGGGTGAGAAAGGAGATCCAGGTCTTATTGGTCCTAAGGGAGACATCGGTGAAACCGGAGTACCCGGGGCTGAAGGTCCCCGAGGCTTTCCGGGAATCCAAGGCAGGAAAGGAGAACCTGGAGAAGGTGCCTATGTATACCGCTCAGCATTCAGTGTGGGATTGGAGACTTACGTTACTATCCCCAACATGCCCATTCGCTTTACCAAGATCTTCTACAATCAGCAAAACCACTATGATGGCTCCACTGGTAAATTCCACTGCAACATTCCTGGGCTGTACTACTTTGCCTACCACATCACAGTCTATATGAAGGATGTGAAGGTCAGCCTCTTCAAGAAGGACAAGGCTATGCTCTTCACCTATGATCAGTACCAGGAAAATAATGTGGACCAGGCCTCCGGCTCTGTGCTCCTGCATCTGGAGGTGGGCGACCAAGTCTGGCTCCAGGTGTATGGGGAAGGAGAGCGTAATGGACTCTATGCTGATAATGACAATGACTCCACCTTCACAGGCTTTCTTCTCTACCATGACACCAACTGATCACCACTAACTCAGAGCCTCCTCCAGGCCAAACAGCCCCAAAGTCAATTAAAGGCTTTCAGTACGGTTAGGAAGTTGATTATTATTTAGTTGGAGGCCTTTAGATATTATTCATTCATTTACTCATTCATTTATTCATTCATTCATCAAGTAACTTTAAAAAAATCATATGCTATGTTCCCAGTCCTGGGGAGCTTCACAAACATGACCAGATAACTGACTAGAAAGAAGTAGTTGACAGTGCTATTTTGTGCCCACTGTCTCTCCTGATGCTCATATCAATCCTATAAGGCACAGGGAACAAGCATTCTCCTGTTTTTACAGATTGTATCCTGAGGCTGAGAGAGTTAAGTGAATGTCTAAGGTCACACAGTATTAAGTGACAGTGCTAGAAATCAAACCCAGAGCTGTGGACTTTGTTCACTAGACTGTGCCCTTTTATAGAGGTACATGTTCTCTTTGGAGTGTTGGTAGGTGTCTGTTTCCCACCTCACCTGAGAGCCATTGAATTTGCCTTCCTCATGAATTAAAACCTCCCCCAAGCAGAGCTTCCTCAGAGAAAGTGGTTCTATGATGAAGTCCTGTCTTGGAAGGACTACTACTCAATGGCCCCTGCACTACTCTACTTCCTCTTACCTATGTCCCTTCTCATGCCTTTCCCTCCAACGGGGAAAGCCAACTCCATCTCTAAGTGCTGAACTCATCCCTGTTCCTCAAGGCCACCTGGCCAGGAGCTTCTCTGATGTGATATCCACTTTTTTTTTTTTTTGAGATGGAGTCTCACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTACAGTGACACGACCTCGGCTCACTGCAGCCTCCTTCTCCTGGGTCCAAGCAATTATTGT
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CAGGTTTTCTTCGTGTGTCCTACAGGGCGCCCTGAGCCAGGTCCCTGTTTGATGGCAGTTATGAAAAATTACCTCCTCCCGATCCTGGTGCTCTTCCTGGCCTACTACTACTATTCTACAAATGAAGAGTTCAGACCAGAAATGCTCCAGGGAAAGAAAGTGATTGTCACTGGGGCCAGCAAAGGGATTGGAAGAGAAATGGCATATCATCTGTCAAAAATGGGAGCCCATGTGGTATTGACTGCCAGGTCGGAGGAAGGTCTCCAGAAGGTAGTGTCTCGCTGCCTTGAACTCGGAGCAGCCTCTGCTCACTACATTGCTGGCACTATGGAAGACATGACATTTGCGGAGCAATTTATTGTCAAGGCGGGAAAGCTCATGGGCGGACTGGACATGCTTATTCTAAACCACATCACTCAGACCTCGCTGTCTCTCTTCCATGACGACATCCACTCTGTGCGAAGAGTCATGGAGGTCAACTTCCTCAGCTACGTGGTCATGAGCACAGCCGCCTTGCCCATGCTGAAGCAGAGCAATGGCAGCATTGCCGTCATCTCCTCCTTGGCTGGGGGAAGAACAGTTCCACAACAGAGAAGTCGCAGTGTTACTCCTGACTCCCGCGGCCCGTGATTAATATCACCAGCCACAGAATGGACTGGAACCCTGTATCGATCTGGTGGGATTGGATATAACGAACATAGAATTACTCCTGAGACTACCAGAACTGAATAGTTCAAATCAAATCATGCCAGAATATCAGACAAATCCAAATGGCAAAACAGTTGCASEQ ID NO22-30 Adiponectin变体产物SEQ ID NO22NP_004788_P1|长度244|转录物1WTMLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO23NP_004788_P2|长度160|转录物2MPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGAYVYRSAFSVGLETYVTIPNMPIRFTKIFYNQQNHYDGSTGKFHCNIPGLYYFAYHITVYMKDVKVSLFKKDKAMLFTYDQYQENNVDQASGSVLLHLEVGDQVWLQVYGEGERNGLYADNDNDSTFTGFLLYHDTNSEQ ID NO24NP_004788_P3|长度153|转录物3MLLLGAVLLLLALPGHDQETTTQGPGVLLPLPKGACTGWMAGIPGHPGHNGAPGRDGRDGTPGEKGEKGDPGLIGPKGDIGETGVPGAEGPRGFPGIQGRKGEPGEGALLSPTCPFALPRSSTISKTTMMAPLVNSTATFLGCTTLPTTSQSI
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SEQ ID NO31-32 Ghrelin变体SEQ ID NO31NP_057446|长度117|转录物1WTMPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMAGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRALAGWLRPEDGGQAEGAEDELEVRFNAPFDVGIKLSGVQYQQHSQALGKFLQDILWEEAKEAPADKSEQ ID NO32NP_057446|长度116|转录物2MPSPGTVCSLLLLGMLWLDLAMAGSSFLSPEHQRVQVRPPHKAPHVVPALPLSNQLCDLEQQRHWASVFSQSTKDSGSDLTVSGRTWGLRVLNRLFPPSSRERSRRSHQPSCSPELSEQ ID NO33-42 HSD11B变体SEQ ID NO33NP_005516|长度292|转录物1WTMAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO34NP_005516|长度163|转录物2MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTASSAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSMCALLLECYHVVHLSSXSEQ ID NO35NP_005516|长度295|转录物3MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMEGLFCLMFI
SEQ ID NO36NP_005516|长度274|转录物4MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO37NP_005516|长度274|转录物5MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTASSAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO38NP_005516|长度262|转录物6MLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAGKVAYPMVAAYSASKFALDGFFSSIRKEYSVSRVNVSITLCVLGLIDTETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO39NP_005516|长度244|转录物7MAFMKKYLLPILGLFMAYYYYSANEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLAKMGAHVVVTARSKETLQKVVSHCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFVAQAGKLMGGLDMLILNHITNTSLNLFHDDIHHVRKSMEVNFLSYVVLTVAALPMLKQSNGSIVVVSSLAETAMKAVSGIVHMQAAPKEECALEIIKGGALRQEEVYYDSSLWTTLLIRNPCRKILEFLYSTSYNMDRFINKSEQ ID NO40XP_110304|长度292|转录物1WTMAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVVLTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGK
MTQPMIAPYSASKFALDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIINAQASPKEECALEIIKGTALRKSEVYYDKSPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSNSEQ ID NO41XP_110304|长度250|转录物8MAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGKMTQPMIAPYSASKFALDGFFSTIRTELYITKVNVSITLCVLGLIDTETAMKEISGIINAQASPKEECALEIIKGTALRKSEVYYDKSPLTPILLGNPGRKIMEFFSLRYYNKDMFVSNSEQ ID NO42XP_110304|长度192|转录物9MAVMKNYLLPILVLFLAYYYYSTNEEFRPEMLQGKKVIVTGASKGIGREMAYHLSKMGAHVVLTARSEEGLQKVVSRCLELGAASAHYIAGTMEDMTFAEQFIVKAGKLMGGLDMLILNHITQTSLSLFHDDIHSVRRVMEVNFLSYVVMSTAALPMLKQSNGSIAVISSLAGGRTVPQQRSRSVTPDSRGP“肥胖和/或糖尿病变体产物”，有时也称作“肥胖和/或糖尿病蛋白”或“肥胖和/或糖尿病变体多肽”——是指由肥胖和/或糖尿病变体核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列是作为可变剪接的结果获得的天然存在的mRNA序列。所述氨基酸序列可以是肽、蛋白、以及具有化学修饰的氨基酸(见下文)的肽或蛋白，如糖肽或糖蛋白。肥胖和/或糖尿病变体产物如SEQ ID NO22-SEQ ID NO42的任意一个所示。该术语也包括添加、缺失、取代(见下文)一个或多个氨基酸或对一个或多个氨基酸进行了化学修饰的(见下文)所述序列的同源物(见下文)以及具有至少10个氨基酸的所述序列的片段(见下文)。
“肥胖和/或糖尿病相关变体核酸序列的片段”——SEQ ID NO1-SEQ ID NO21的任意一个的部分序列，其包含含有变体和原始序列之间的核苷酸变异的区域。这些区域(在氨基酸水平)描述于上文表1。
“肥胖和/或糖尿病相关变体产物的片段”——由上述核酸片段编码的氨基酸序列，包含上文表1所示的变体与原始序列不同的区域。
“核酸序列”——由DNA核苷酸、RNA核苷酸或这两种类型的组合组成的序列，并且可以包含天然核苷酸、化学修饰的核苷酸和合成的核苷酸。
“氨基酸序列”——由20种天然存在的氨基酸中的任意氨基酸、经化学修饰的氨基酸(见下文)、或由合成的氨基酸组成的序列。
“变体/产物的同源物”——添加、缺失或取代了一个或多个氨基酸的变体的氨基酸序列。例如，根据表1的解释，改变的氨基酸应该位于变体与原始序列不同的区域内。
“保守取代”——一类氨基酸被同类的氨基酸取代，其中所述类是由共同的生理化学氨基酸侧链特性和天然同源蛋白中的高取代频率而限定，所述取代频率是由例如标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵确定的。已经分类了6大类的氨基酸侧链，包括I类(Cys)；II类(Ser，Thr，Pro，Ala，Gly)；III类(Asn，Asp，Gln，Glu)；IV类(His，Arg，Lys)；V类(Ile，Leu，Val，Met)；和VI类(Phe，Tyr，Trp)。例如，用另一个III类的残基，如Asn、Gln或Glu取代Asp，是保守取代。
“非保守取代”——将属于一类的氨基酸取代为属于另一类的氨基酸；例如，用III类残基，如Asp、Asn、Glu或Gln取代II类残基Ala。
“化学修饰的”——指本发明的产物时，表示通过天然过程，如加工或其它翻译后修饰，或通过本领域公知的化学修饰技术而修饰了至少一个氨基酸残基的产物(蛋白)。在多种公知的修饰中，典型但并非唯一的例子包括乙酰化、酰化、辛酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚形成、脂或脂衍生物的共价连接、甲基化、豆蔻酰化、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、遍在蛋白化或相似的方法。
“生物活性的”——是指具有某类生物活性，例如结合肥胖和/或糖尿病相关基因或结合其它已知的原始肥胖和/或糖尿病相关基因的激动剂的能力。
“免疫活性的”——定义了天然、重组或合成变体产物或其片段在适当的动物或细胞中诱导特异性免疫应答和结合特异性抗体的能力。因此，例如，变体产物的免疫活性片段是指保留了变体产物的某些或全部免疫原性特性，如能够结合特异性抗变体产物抗体或能够诱导产生所述抗体的免疫应答或导致产生变体的特定免疫细胞增殖的片段。
“最优比对”——定义为得到最高百分同一性评分的比对。所述比对可以采用多种可商购的序列分析程序，如采用等于1的ktup、缺省参数和缺省PAM的局部比对程序LALIGN进行。优选的比对是用来自MacVectorTM的CLUSTAL-W程序进行的比对，采用等于10.0的开放空位罚分，等于0.1的延伸的空位罚分，以及BLOSUM相似性矩阵进行操作。如果需要将空位插入第一个序列以将其与第二个序列进行最优比对，仅仅采用与相应的氨基酸残基配对的残基计算百分同一性(即，该计算不考虑位于第一个序列的“空位”中的第二个序列)。在将已知基因序列与新变体进行比对的情况下，最优比对总是包括将两个序列的相同部分一起进行比对，然后将两个序列彼此不同的序列保持分开和不进行比对。
“具有至少90％同一性”——关于两个氨基酸或核酸序列，是指当对序列进行最优比对时，相同的残基的百分比。因此，90％氨基酸序列同一性是指两个或更多个最优比对的多肽序列中90％的氨基酸是相同的。
“具有变体核酸序列的分离的核酸分子”——是指包含肥胖和/或糖尿相关变体核酸编码序列的核酸分子。所述分离的核酸分子可以包括肥胖和/或糖尿病相关变体核酸序列作为独立的插入物；可以包括与其它编码序列融合的肥胖和/或糖尿病相关变体核酸序列，它们一起编码融合蛋白，其中变体编码序列是决定性的编码序列(例如，其它编码序列可能编码信号肽)；肥胖和/或糖尿病相关变体核酸序列可以与非编码序列，如内含子或对照元件，例如启动子和终止子元件或有效用于在合适的宿主中表达编码序列的5′和/或3′非编码区组合；或者可以是载体，其中肥胖和/或糖尿病相关变体蛋白编码序列是异源的。
“表达载体”——是指具有在外源细胞中插入和表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是公知的和/或可商购的。选择合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围内。
“缺失”——是核苷酸或氨基酸序列中的改变，其中分别缺少了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
“插入”或“添加”——是核苷酸或氨基酸序列中的改变，其导致与天然存在的序列相比，分别增加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。
“取代”——分别用不同的核苷酸或氨基酸替代一个或多个核苷酸或氨基酸。至于氨基酸序列，取代可以是保守的或非保守的。
“抗体”——是指IgG，IgM，IgD，IgA和IgG抗体。该定义包括多克隆抗体或单克隆抗体。该术语是指完整抗体或包含抗变体产物抗体的抗原结合域的抗体片段，如没有Fc部分的抗体、单链抗体、基本仅仅由抗体的可变抗原结合域组成的片段等。
“治疗疾病”——是指给予有效缓解与疾病相关的症状、减轻疾病的严重程度或治愈疾病，或防止疾病发生的治疗物质。
“检测”——是指检测疾病、紊乱、病理或正常状况的方法。该术语可以指检测发生疾病的倾向以及通过确定疾病的严重程度而确定患者的预后。
“探针”——肥胖和/或糖尿病变体核酸序列，或其互补序列，用于检测样品中其它相似序列或与该序列具有一定同源性的序列的存在。该检测是通过鉴定探针和测定的序列之间的杂交复合体而进行的。探针可以与固体支持物或可检测标记。
“原始的肥胖和/或糖尿病相关基因”——由于可变剪接而改变了氨基酸或核酸序列，从而得到本发明的肥胖和/或糖尿病相关变体。原始的核酸序列对于人Adiponectin是描述于SEQ ID NO1的人肥胖和/或糖尿病相关基因的序列，原始的氨基酸序列是由其编码的序列；对于小鼠Adiponectin是SEQ ID NO5，原始的氨基酸序列是由其编码的序列；对于Ghrelin是SEQ ID NO10，原始的氨基酸序列是由其编码的序列；对于人11-β-HSD是SEQ ID NO12，原始的氨基酸序列是由其编码的序列；对于小鼠11-β-HSD是SEQ ID NO19，原始的氨基酸序列是由其编码的序列。
发明概述本发明涉及分离的核酸分子，具有选自下组的序列SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21及其包含至少15个核苷酸的片段。本发明涉及包含SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的分离的核酸分子和包含SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的片段的分离的核酸分子，所述片段包含至少15个氨基酸。
本发明涉及可以使用SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列作为模板而扩增产物的PCR引物。
本发明涉及筛查、诊断、监测个体的肥胖和/或糖尿病的方法。该方法包括检测样品中包含选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列的转录产物的存在、不存在或量。所述转录产物的存在或量，指示肥胖和/或糖尿病。
本发明涉及治疗患肥胖和/或糖尿病的个体的方法，包括给予具有选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的序列的转录物的翻译产物的步骤。
本发明涉及用于筛查、诊断、监测个体的肥胖和/或糖尿病的试剂盒。
本发明涉及由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白及其免疫原性片段。
本发明涉及特异性结合于由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白上的表位的抗体。
本发明涉及特异性结合于由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白上的表位的抗体，其与可检测标记或活性剂连接。
本发明涉及药物组合物，该药物组合物包含特异性结合于由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白上的表位的抗体，所述抗体与活性剂连接。
本发明涉及治疗怀疑患有肥胖和/或糖尿病的个体的方法。该方法包括给予个体抗体的步骤，该抗体特异性结合于由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白上的表位，并且与活性剂连接。
本发明涉及给个体的肥胖和/或糖尿病细胞送递核酸分子的方法。该方法包括给予个体药物组合物的方法，该药物组合物包含特异性结合于由选自SEQ ID NO2-4；6-9；11；13-18；20-21的核酸序列编码的蛋白上的表位的抗体和核酸分子。
附图简述

图1表示人来源的4个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO22-SEQID NO25)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图2表示小鼠来源的5个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO26-SEQ ID NO30)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图3表示人来源的两个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO31-SEQID NO32)与原始序列的比对。
图4表示人来源的7个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO33-SEQ IDNO39)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图5表示人来源的3个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO40-SEQ IDNO42)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图6表示人来源的4个核酸序列(描述于SEQ ID NO1-SEQ IDNO4)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图7表示小鼠来源的5个核酸序列(描述于SEQ ID NO5-SEQ IDNO9)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图8表示人来源的两个核酸序列(描述于SEQ ID NO10-SEQ IDNO11)与原始序列的比对。
图9表示人来源的7个核酸序列(描述于SEQ ID NO12-SEQ IDNO18)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
图10表示人来源的3个氨基酸序列(描述于SEQ ID NO19-SEQID NO21)彼此之间以及与原始序列的多重比对。
优选实施方案的详述申请人特此引入在本公开内容中引用的所有参考文献的完整内容。此外，当以一个范围、优选范围、或一系列高优选值和低优选值给出量、浓度或其它值或参数时，应该理解，这如同特别公开了由任意一对任意上限或优选值和任意下限或优选值形成的所有范围，而无论是否单独公开了范围。当此处指出数字值的范围时，除非特别指出，该范围意欲包括其终点，以及该范围内的所有整数和分数。当限定一个范围时，本发明的范围并不限于指出的特定值。
肥胖和/或糖尿病变体核酸序列本发明的核酸序列包括编码肥胖和/或糖尿病变体产物及其片段和类似物的核酸序列。或者，核酸序列可以是与上述编码序列互补，或与所述编码序列的区域互补的序列。互补序列的长度足够避免编码序列的表达。核酸序列可以是RNA形式或DNA形式，并且包括信使RNA、合成RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链，可以是编码链或非编码(反义、互补)链。核酸序列也可以包括dNTPs、rNTPs以及非天然存在的序列。该序列可以是氨基酸序列和核酸序列之间的杂交体的一部分。
在一般的实施方案中，核酸序列与SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ ID NO21所示序列的任意一个具有至少90％同一性。
核酸序列可以包括编码序列自身。另一方面，编码区可以与其它编码序列，如编码融合蛋白或信号肽的那些序列组合，与非编码序列，如有效用于在合适的宿主内表达编码序列的内含子和控制元件、启动子和终止子元件或5′和/或3′非翻译区组合，和/或位于载体或宿主环境中，其中将变体核酸序列作为异源序列而导入。
本发明的核酸序列也可以包括与使得能够纯化变体产物的标记物序列框内融合的肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列。例如，在细菌宿主的情况下，标记物序列可以是六组氨酸标志，其提供与标记物融合的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物宿主，如COS-7细胞时，标记物序列可以是血凝素(HA)标志。HA标志相当于来源于流感血凝素蛋白的表位(Wilson，I.，et al.Cell 37767(1984))。
本发明的范围内也包括上文所定义的片段，此处也称作寡核苷酸，它们通常具有相当于核酸序列的编码序列区的至少17个碱基，优选17-30个碱基。根据公知方法，这些片段可以用作探针、引物，并且当互补时，也可以作为反义剂。
如上文所述，核酸序列可以基本上如SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQ ID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ ID NO21所述，或者可以是其片段或上文所解释，与上述序列具有至少90％同一性。或者，由于遗传密码的简并性质，该序列可以是编码SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42的氨基酸序列的任意一个或所述氨基酸的片段或类似物的序列。
A.制备核酸序列可以通过用能够与编码此处公开的肥胖和/或糖尿病变体产物的核酸序列杂交、或可以PCR扩增编码此处公开的肥胖和/或糖尿病变体产物的核酸序列的寡核苷酸探针获得核酸序列。从多种组织制备的cDNA文库是可以商购的，并且，用于筛选和分离cDNA克隆的程序是本领域技术人员公知的。所述技术描述于，例如，Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd Edition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.和Ausubel FM et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，N.Y。
可以延伸核酸序列，以获得上游和下游序列，如启动子、调节元件和5′和3′非翻译区(UTRs)。可获得的转录物序列的延伸可以用本领域技术人员公知的多种方法进行，如PCR或引物延伸(Sambrook et al.，supra)，或通过使用例如Marathon RACE试剂盒(Clontech，Cat.#K1802-1)进行的RACE方法进行。
或者，可以采用“限制位点”PCR(Gobinda et al.PCR MethodsAppl.2318-22(1993))的技术，该技术使用通用引物提取邻接于已知基因座的侧翼序列。首先，在接头序列的引物和已知区域的特异性引物存在下扩增基因组DNA。扩增的序列用相同的接头引物和第一种特异性引物内部的另一种特异性引物进行第二轮PCR。用合适的RNA聚合酶转录每一轮PCR的产物，并且用逆转录酶测序。
可以使用背驰引物，基于已知区域，用反向PCR扩增或延伸序列(Triglia，T.et al.，Nucleic Acids Res.168186(1988))。可以用OLIGO4.06引物分析软件(1992；National Biosciences Inc，Plymouth，Minn.)，或另一种合适的程序设计引物，该引物长度为22-30个核苷酸，具有50％或更多的GC含量，并且在大约68-72℃的温度下与靶序列退火。该方法使用几种限制酶以制备已知基因区中的合适的片段。然后通过分子内连接对该片段环化，并且用作PCR模板。
捕获PCR(Lagerstrom，M.et al.，PCR Methods Appl.1111-19(1991))是一种用于对人和酵母人工染色体DNA中的已知序列进行PCR扩增的方法。捕获PCR也要求多次限制酶消化和连接，以便在PCR之前将工程化的双链序列置于DNA分子的侧翼部分。
可以用于提取侧翼序列的另一种方法是Parker，J.D.，et al.，Nucleic Acids Res.193055-60(1991)的方法。此外，可以使用PCR、巢式引物和PromoterFinderTM文库在基因组DNA中“行走”(PromoterFinderTM；Clontech，Palo Alto，CA)。该过程避免了对筛选文库的需要，并且可以用于发现内含子/外显子连接。用于筛选全长cDNAs的优选文库是进行了大小选择以包括更大cDNAs的那些。同样，随机引物文库是优选的，因为它们将包括更多含有基因的5’和上游区的序列。
如果寡d(T)文库不产生全长cDNA，那么随机引物文库可以特别有用。基因组文库用于延伸到5’非翻译调节区中。
也可以根据公知的合成方法，通过固相方法制备本发明的核酸序列和寡核苷酸。典型地，分别合成最多达大约100个碱基的片段，然后连接形成最多达几百个碱基的连续序列。
B.用肥胖和/或糖尿病变体核酸生产肥胖和/或糖尿病变体产物根据本发明，上文指出的核酸序列可以用作指导肥胖和/或糖尿病变体产物表达的重组DNA分子。
如本领域技术人员将理解的，生产具有在人类基因组中天然存在的SEQ ID NO2-SEQ ID NO4或SEQ ID NO6-SEQ ID NO9或SEQID NO11或SEQ ID NO13-SEQ ID NO18或SEQ ID NO20-SEQ IDNO21中存在的密码子以外的密码子的肥胖和/或糖尿病变体产物编码核苷酸序列是有利的。可以选择特定原核或真核宿主优选的密码子(Murray，E.et al.Nucleic Acids Res.17477-508(1989))，以便例如，增加变体产物表达速度或生产具有需要的特性的重组RNA转录物，如比天然存在的序列产生的转录物更长的半衰期。
可以对本发明的核酸序列进行工程化，以便为了多种目的改变肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列，所述目的包括，但不限于，修饰产物的克隆、加工和/或表达的改变。例如，可以使用本领域公知的技术，如定点诱变而导入改变，以插入新的限制位点、改变糖基化模式、改变密码子偏好等。
本发明也包括包含上文广泛描述的一种或多种序列的重组构建体。所述构建体包括载体，如质粒或病毒载体，其中以正向或反向方向插入了本发明的核酸序列。在该实施方案的优选方面，所述构建体还包含调节序列，包括，例如与序列可操作性连接的启动子。大量合适的载体和启动子是本领域技术人员公知的，并且是可商购的。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体也描述于Sambrook，et al.(上文)。
本发明也涉及用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞和通过重组技术生产本发明的产物。用本发明的载体对宿主细胞进行遗传工程化(即，转导、转化或转染)，所述载体可以是，例如，克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。工程化的宿主细胞可以在经过修饰以适用于激活启动子、选择转化体或扩增变体核酸序列的表达的常规营养培养基中培养。培养条件，如温度、pH等，是以前用于为进行表达而选择的宿主细胞中的那些，并且对于本领域技术人员是显而易见的。
本发明的核酸序列可以包含在用于表达产物的多种表达载体中。所述载体包含染色体、非染色体和合成DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA、病毒DNA的组合的载体，所述病毒如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。然而，可以使用任何其它的载体，只要它是可复制的，并且在宿主中是可存活的。可以通过多种程序将合适的DNA序列插入载体。概言之，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性核酸内切酶位点。所述程序和相关的亚克隆程序也被认为在本领域技术人员的知识范围内。
将表达载体中的DNA序列可操作性连接于合适的转录控制序列(启动子)以指导mRNA合成。所述启动子的例子包括LTR或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λPL启动子和其它已知能够控制原核或真核细胞或其病毒中的基因表达的启动子。表达载体也包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体也可以包含用于扩增表达的合适序列。此外，表达载体优选包含一个或多个选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或例如大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
可以使用含有上文所述合适的DNA序列以及合适的启动子或控制序列的载体转化合适的宿主，以使得宿主表达蛋白。合适的表达宿主的例子包括细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌、伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞，如果蝇和夜蛾Sf9；动物细胞，如CHO，COS，HEK 293或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等。根据此处的教导，合适的宿主细胞的选择被认为是在本领域技术人员的知识范围内。本发明不受所使用的宿主细胞的限制。
在细菌系统中，可以根据肥胖和/或糖尿病变体产物的用途而选择多种表达载体。例如，当诱导抗体需要大量肥胖和/或糖尿病变体产物时，可能需要指导容易纯化的融合蛋白的高水平表达的载体。所述载体包括，但不限于，多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如Bluescript(Stratagene)，其中可以将肥胖和/或糖尿病变体多肽编码序列与氨基端Met和随后β-半乳糖苷酶的7个残基的编码序列框内连接，以便生产杂交蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster J.Biol.Chem.2645503-5509(1989))；pET载体(Novagen，Madison WI)等。
在啤酒糖酵母中，可以使用多个含有组成型或诱导型启动子，如α因子、醇脱氢酶和PGH启动子的载体。综述可参见Ausubelet al.(上文)和Grant et al.(Methods in Enzymology 153516-544(1987))。
当使用植物表达载体时，可以通过许多启动子中的任意一个驱动序列编码变体产物的表达。例如，可以单独使用病毒启动子，如CaMV的35S和19S启动子(Brisson et al.，Nature 310511-514(1984))或与TMV的ω前导序列(Takamatsu et al.，EMBO J.6307-311(1987))组合使用。或者，可以使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基(Coruzzi et al.，EMBO J.31671-1680(1984)；Broglie et al.，Science 224838-843(1984))；或热激启动子(Winter J andSinibaldi R.M.，Results Probl.Cell Differ.1785-105(1991))。可以通过直接DNA转化或病原体介导的转染将这些构建体导入植物细胞。关于所述技术的综述，参见Hobbs S.or Murry L.E.(1992)in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp 191-196；或Weissbach and Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。
也可以在昆虫系统中表达肥胖和/或糖尿病变体产物。在一个所述系统中，将Autographa californica核型多角体病毒(AcNPV)用作在草地夜蛾细胞中或粉蚊夜蛾幼虫中表达外源基因的载体。可以将肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列克隆到病毒的非必须区，如多角体蛋白基因，并且置于多角体启动子的控制下。肥胖和/或糖尿病编码序列的成功插入，将使得多角体蛋白基因失活并产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后将重组病毒用于感染草地夜蛾细胞或粉蚊夜蛾幼虫，其中表达了变体蛋白(Smith et al.，J.Virol.46584(1983)；Engelhard，E.K.et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 913224-7(1994))。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用多种基于病毒的表达系统。当腺病毒用作表达载体时，可以将肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列连接到由晚期启动子和三分前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必须的E1或E3区，将得到能够在感染的宿主细胞中表达变体蛋白的可存活的病毒(Logan and Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-59(1984)。此外，可以用转录增强子，如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子来增加在哺乳动物宿主细胞中的表达。
变体产物编码序列的有效翻译也可能需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近的序列。在肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列的情况下，将其起始密码子和上游序列插入合适的表达载体，可以不需要其它的翻译控制信号。但是，当仅仅将编码序列或其部分插入时，必须提供包括ATG起始密码子的外源转录控制信号。此外，起始密码子必须在正确的读框中，以确保完整插入物的转录。外源转录元件和起始密码子可以是病毒来源，可以是天然的和合成的。可以通过导入适用于所使用的细胞系统的增强子而增强表达效率(Scharf，D.et al.，Results Probl.Cell Differ.20125-62(1994)；Bittner et al.，Meth.Enzymol.153516-544(1987))。
在另一实施方案中，本发明涉及包含上文所述构建体的宿主细胞。该宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，and Battey，I.(1986)Basic Methods in MolecularBiology)将构建体导入宿主细胞。也可以采用无细胞的翻译系统，用来源于本发明的DNA构建体的RNA生产多肽。
可以选择宿主细胞株，以选择其调节插入序列的表达或以需要的方式加工表达的蛋白的能力。所述蛋白的修饰包括，但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割“前-原”形式的蛋白的翻译后加工对于正确的插入、折叠和/或功能也可以是重要的。不同的宿主细胞，如CHO，HeLa，MDCK，293，WI38等，具有所述翻译后活性的特定细胞机制和特征性机理，可以对其进行选择以用于确保导入的外源蛋白的正确修饰和加工。
对于重组蛋白的长期高产率生产，优选稳定的表达。例如，可以用含有病毒复制起点或内源表达元件和选择标记基因的表达载体转化稳定表达变体产物的细胞系。在导入载体后，可以让细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转移到选择培养基中。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，其存在允许生长和回收成功表达导入的序列的细胞。可以用适于细胞类型的组织培养技术增殖稳定转化的细胞的抗性簇。
可以使用任何数目的选择系统回收转化的细胞系。这些包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler M.，et al.，Cell 11223-32(1977))和腺苷磷酸核糖基转移酶(Lowy I.，et al.，Cell 22817-23(1980))基因，可以将其分别用于tk-或aprt-细胞。同样，也可以将抗代谢物、抗生素或除草剂抗性用作选择基础，例如，赋予对氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler M.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567-70，(1980))；赋予对氨基糖苷类新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin，F.et al.，J.Mol.Biol.1501-14(1981))；和赋予对chlorsulfuron和膦丝菌素乙酰转移酶抗性的als或pat(Murry，上文)。已经描述了其它可选择的基因，如允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB，或允许细胞利用组氨醇代替组氨酸的hisD(Hartman S.C.and R.C.Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.858047-51，(1988))。使用可见标记已经在花青素、β-葡糖醛酸酶及其底物、GUS和荧光素酶及其底物、荧光素及ATP等标记获得了普及，所述标记不仅广泛用于鉴定转化体，也用于对特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白表达量进行定量(Rhodes，C.A.et.al.，MethodsMol.Biol.55121-131(1995))。
可以在适于从细胞培养物表达和回收编码的蛋白的条件下培养用编码肥胖和/或糖尿病变体产物的核苷酸序列转化的宿主细胞。由重组细胞生产的产物可以取决于所使用的序列和/或载体而分泌到细胞内或包含在细胞内。如本领域技术人员能理解的，可以用指导通过原核或真核细胞膜分泌肥胖和/或糖尿病变体产物的信号序列设计包含编码肥胖和/或糖尿病变体产物的核苷酸序列的表达载体。
也可以将肥胖和/或糖尿病变体产物作为具有一个或多个添加以促进蛋白纯化的额外多肽结构域的重组蛋白而表达。所述纯化促进结构域包括，但不限于金属螯合肽，如使得能够在固定化的金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸组件、使得能够在固定化的免疫球蛋白上进行纯化的蛋白A结构域、和在FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)中使用的结构域。在纯化结构域和肥胖和/或糖尿病变体产物之间引入蛋白酶可切割的多肽接头序列，对促进纯化是有用的。一种这样的表达载体提供了融合蛋白的表达，所述融合蛋白包含与通过肠激酶切割位点隔开的聚组氨酸区域融合的变体多肽。组氨酸残基促进了在IMIAC(固定化的金属离子亲和层析，如Porath，et al.，Protein Expr.Purif.3263-281(1992)中的描述)上的纯化，而肠激酶切割位点提供了用于从融合蛋白分离变体多肽的工具。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于表达作为与谷胱苷肽S-转移酶(GST)融合的融合多肽的外源多肽。通常，所述融合蛋白是可溶的，并且可以通过吸附于配体-琼脂糖珠(如在GST-融合体的情况下是谷胱苷肽-琼脂糖)然后在游离配体存在下洗脱，很容易从裂解的细胞纯化。
在转化合适的宿主菌株并且使宿主菌株生长到合适的细胞密度时，通过合适的方法(如温度转变或化学诱导)诱导所选择的启动子，并且培养细胞额外的一段时间。通常通过离心收获细胞，通过物理或化学方法破坏，将得到粗提取物保留用于进一步纯化。可以通过包括冻-融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂的任何常规方法，或通过本领域技术人员公知的其它方法破坏在蛋白表达中使用的微生物细胞。
可以通过本领域公知的多种方法中的任意方法从重组细胞培养物回收并纯化肥胖和/或糖尿病变体产物，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析、和凝集素层析。在完成成熟蛋白构型的过程中，可以根据需要使用蛋白重折叠步骤。最后，可以使用高效液相层析(HPLC)用于最后的纯化步骤。
C.利用核酸序列的诊断应用本发明的核酸序列可以用于多种诊断目的。通过检测编码肥胖和/或糖尿病变体产物的mRNA的存在，可以用核酸序列检测和定量肥胖和/或糖尿病变体在患者细胞，如活检组织中的表达。或者，该测定可以用于检测血清或血液中的可溶性变体。该测定通常包括从组织或血清获得总mRNA，并且将mRNA与核酸探针接触。所述探针是至少20个核苷酸，优选20-30个核苷酸的核酸分子，能够在杂交条件下与包含在编码肥胖和/或糖尿病变体产物的核酸分子中的序列杂交，检测与探针杂交的mRNA的存在，从而检测变体的表达。该测定可以用于区分肥胖和/或糖尿病变体产物的不存在、存在和过量表达，以及用于监测治疗干涉期间肥胖和/或糖尿病变体表达的水平。此外，该测定可用于比较本发明的肥胖和/或糖尿病变体水平与经改变而得到变体的原始肥胖和/或糖尿病序列，或比较相互之间的水平，该比较可以具有某些生理含义。
本发明也包括使用核酸序列诊断由遗传缺陷变体序列导致的疾病或得到肥胖和/或糖尿病变体的原始肥胖和/或糖尿病序列与本发明的新的肥胖和/或糖尿病变体的比例发生改变的疾病。可以通过比较缺陷的(即突变的)肥胖和/或糖尿病变体编码区的序列与正常编码区的序列而检测这些序列。编码突变的肥胖和/或糖尿病变体产物的序列与正常变体产物活性的关系可以改变。此外，可以将编码突变的肥胖和/或糖尿病变体产物的序列插入合适的载体，用于在功能测定系统(如在HEK293细胞的变体蛋白缺陷株中的比色测定、互补实验)中表达，作用证明或鉴定突变的另一种方法。一旦鉴定了突变基因，可以筛查感兴趣群体中突变基因的携带者。
可以通过多种技术在DNA水平检测携带本发明的核酸序列中的突变的个体。用于诊断的核酸可以获自患者的细胞，包括，但不限于例如获自血液、尿、唾液、胎盘、组织活检物和尸检材料。可以直接将基因组DNA用于检测或可以通过使用PCR进行酶促扩增(Saiki，etal.，Nature 324163-166(1986))然后用于分析。可以将RNA或cDNA用于相同的目的。例如，可以将与本发明的核酸互补的PCR引物用于鉴定和分析本发明基因中的突变。通过扩增产物与正常基因型相比的大小改变而检测突变和插入。
可以通过将扩增的DNA与放射性标记的本发明的RNA或放射标记的本发明的反义DNA序列杂交。也可以通过核酸酶保护测定，如RNA酶和S1保护或化学裂解方法(如Cotton，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 854397-4401(1985))或通过解链温度的差异发现特定位点的序列改变。也可以用“分子信标”(Kostrikis L.G.et al.，Science 2791228-1229(1998))，即一种含有与本发明的核酸互补的探针序列的发夹形、单链合成寡核苷酸检测点突变或其它序列改变，以及监测变体产物的表达水平。所述诊断方法对产前检测特别有用。
另一种用于检测突变的方法使用两个DNA探针，所述探针设计为与靶的具有邻接碱基的邻接区杂交，其中已知或怀疑突变的区域位于或邻近所述邻接的碱基。可以在连接酶的存在下，在邻接的碱基处连接两个探针，但只能在两个探针都在探针连接区域正确进行碱基配对的条件下连接。然后可以通过连接的探针的存在与否检测突变的存在与否。
例如美国专利No.5,547,839中描述的基于通过杂交进行测序(SBH)的寡核苷酸阵列方法也适用于检测肥胖和/或糖尿病变体产物编码序列中的突变。在典型的方法中，DNA靶分析物与在微芯片上形成的寡核苷酸阵列杂交。然后可以从靶与阵列结合的模式“读出”靶的序列。
D.核酸序列的治疗用途本发明的核酸序列也可以用于治疗用途。关于本发明的第二方面(即，抑制肥胖和/或糖尿病变体的表达)，可以通过反义技术调节肥胖和/或糖尿病变体产物的表达，该技术通过互补核酸序列，即反义DNA或RNA与编码变体产物的基因的控制区、5’区或调节区的杂交而控制基因表达。例如，将编码本发明的产物的核酸序列的5’编码部分用于设计长度为大约10-40个碱基对的反义寡核苷酸。来源于转录起始位点，如从起始位点开始的-10到+10位置之间的寡核苷酸是优选的。将反义DNA寡核苷酸设计为与参与转录的核酸序列的区域互补(Lee etal.，Nucl.Acids Res.63073(1979)；Cooney et al.，Science241456(1988)；和Dervan et al.，Science 2511360(1991))，从而防止变体产物的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并且阻断mRNA分子翻译为变体产物(Okano，J.Neurochem.56560(1991))。可以通过本领域公知的程序将反义构建体送递到细胞，以便可以体内表达反义RNA或DNA。反义可以是反义mRNA或能够编码所述反义mRNA的DNA。反义mRNA或其编码DNA可以与编码肥胖和/或糖尿病变体蛋白的序列或者与所述序列的片段互补，其长度足够抑制蛋白产物生产。也可以将反义技术用于抑制一种变体相对于另一种变体的表达，或抑制变体相对于原始序列的表达。
关于本发明的第一方面，即，肥胖和/或糖尿病变体的表达，可以通过提供在合适的控制元件的控制下编码所述肥胖和/或糖尿病变体产物的编码序列而增加肥胖和/或糖尿病变体产物的表达，所述控制元件在需要的宿主中终止所述编码序列的表达。
本发明的核酸序列可以与合适的药用载体组合使用。所述组合物包含治疗有效量的化合物和药学可接受的载体或附形剂。所述载体包括，但不限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。所述制剂应当适于给药模式。
本发明的产物也可以通过在体内表达所述多肽而用于本发明，通常称作“基因治疗”。可以用编码多肽的核酸序列(DNA或RNA)对来自患者的细胞进行离体工程化，然后给用所述多肽治疗的患者提供工程化的细胞。所述方法是本领域公知的。例如，通过使用含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒，可以通过本领域公知的程序对细胞进行工程化。
类似地，可以对细胞进行体内工程化，用于通过本领域公知的程序体内表达多肽。如本领域公知的，可以将用于生产包含编码本发明的多肽的RNA的逆转录病毒颗粒的生产细胞给予患者，以便对细胞进行体内工程化并且在体内表达多肽。根据本发明的教导，通过所述方法给予本发明的产物的这些和其它方法对本领域技术人员应该是显而易见的。例如，用于对细胞进行工程化的表达载体可以是逆转录病毒以外的那些，例如，可以用于在与合适的送递载体组合后对细胞进行体内工程化的腺病毒。
可以得到上述逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括，但不限于，鼠莫洛尼白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录病毒，如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白细胞增多症病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和哺乳动物肿瘤病毒。
将逆转录病毒质粒载体用于转导包装细胞系以形成生产细胞系。可以被转染的包装细胞包括，但不限于Miller描述的PE501，PA317，psi-2，psi-AM，PA12，T19-14X，VT-19-17-H2，psi-CRE，psi-CRIP，GP+E-86，GP+envAm12，和DAN细胞系(Human Gene Therapy，Vol.1，pg.5-14，(1990))。载体可以通过本领域公知的任何方法转导包装细胞。所述方法包括，但不限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。在一种替代方式中，可以将逆转录病毒质粒载体包裹到脂质体中，或与脂质偶联，然后给予宿主。
生产细胞系产生包含编码多肽的核酸序列的传染性逆转录病毒载体颗粒。然后可以用所述逆转录病毒载体颗粒体外或体内转导真核细胞。转导的真核细胞将表达编码多肽的核酸序列。可以转导的真核细胞包括，但不限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞、以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和支气管上皮细胞。
可以将导入细胞的基因置于诱导型启动子，如放射诱导的Egr-1启动子(Maceri，H.J.，et al.，Cancer Res.56(19)4311(1996))的控制下，以刺激反应于放射，如用于治疗肿瘤的放射治疗的变体产生或反义抑制。
肥胖和/或糖尿病变体产物本发明的基本纯化的肥胖和/或糖尿病变体产物定义为由本发明的核酸序列编码的产物。氨基酸序列优选是与SEQ ID NO23-SEQ IDNO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ IDNO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。蛋白或多肽可以是上文所定义的成熟和/或修饰的形式，例如通过切除前导序列进行修饰。也包括具有来源于肥胖和/或糖尿病变体产物的至少5个连续氨基酸残基，优选至少5-20个残基的蛋白片段，以及上文解释的同源物。
序列变异优选是上文定义的认为是保守取代的那些。因此，例如，优选通过上文所述的保守取代得到的具有与SEQ ID NO23-SEQ IDNO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ IDNO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示产物具有至少90％序列同一性的序列的蛋白也是本发明的一部分，前提是它与经改变(通常，取代是在变体与原始序列不同的区域，例如表1所示)得到它的原始肽不同。在更特定的实施方案中，蛋白具有或含有SEQ IDNO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ IDNO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列。肥胖和/或糖尿病变体产物可以是(i)其中上文所列序列中的一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选保守氨基酸残基)取代的序列，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代的基团的序列，或(iii)其中肥胖和/或糖尿病变体产物与另一种化合物融合的序列，所述另一种化合物如增加蛋白半衰期的化合物(例如聚乙二醇(PEG))、或作为将蛋白导向于其靶组织或靶细胞群的导向工具的部分(如抗体)，或(iv)其中额外的氨基酸与肥胖和/或糖尿病产物融合的序列。根据此处的教导，所述片段、变体和衍生物被认为在本领域技术人员的知识范围内。
A.肥胖和/或糖尿病变体产物的制备上文描述了用于生产和分离肥胖和/或糖尿病变体产物的重组方法。
除了重组生产，可以采用固相技术通过直接肽合成(参见Stewartet al.，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co，San Francisco；Merrifield J.，J.Am.Chem.Soc.852149-2154(1963))而生产变体产物的片段和部分。可以用人工技术或通过自动化进行体外肽合成。例如，根据制造商提供的说明，可以用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)完成自动化合成。可以单独化学合成肥胖和/或糖尿病变体产物的片段，并且用化学方法组合以生产全长分子。
B.利用肥胖和/或糖尿病变体产物的治疗用途和组合物本发明的肥胖和/或糖尿病变体产物通常用于治疗肥胖和/或糖尿病。
可以通过设计在靶器官或组织提供一致的和可预测的化合物浓度的许多途径和方法中的任何一种，给予肥胖和/或糖尿病变体产物或片段。可以单独给予含产物的组合物，或与其它的试剂如稳定化合物组合，和/或与其它药剂，如药物或激素组合。
可以通过多种途径给予含肥胖和/或糖尿病变体产物的组合物，包括，但不限于口服、静脉内、肌内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠途径，以及通过鼻施用。含肥胖和/或糖尿病变体产物的组合物也可以通过脂质体给药。所述给药途径和合适的制剂是本领域技术人员公知的。
可以通过静脉内或腹膜内注射给予肥胖和/或糖尿病变体产物。类似地，可以将产物注射到身体的其它局部区域。也可以通过鼻吹入法给予所述产物。肠内给药也是可以的。对于所述给药，可以将产物配制于合适的胶囊或酏剂中用于口服给药，或配制于栓剂中用于直肠给药。
前述示例性给药方式可能需要将产物配制于合适的载体中，包括，例如油膏、凝胶或栓剂。合适的制剂是本领域技术人员公知的。
产物的剂量将根据所选择的特定多肽的效力和治疗指数而改变。
用于治疗方法中的治疗性组合物可以包括无菌可注射溶液中的产物、口服送递载体中的多肽、适于鼻给药的气溶胶中的产物、或喷雾化形式的产物，所有这些都是根据公知方法制备的。所述组合物包含治疗有效量的化合物和药学可接受的载体或附形剂。所述载体包括，但不限于，盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明的产物也可以用于调节内皮分化和增殖，以及用于离体或体外调节例如细胞培养物中的细胞凋亡。
抗病毒抗体A.合成在本发明的另一方面，将纯化的变体产物用于生产抗病毒抗体，所述抗体具有与肥胖和/或糖尿病变体产物的活性、分布和表达相关的诊断和治疗用途。
可以通过本领域技术人员公知的方法制备抗肥胖和/或糖尿病变体的抗体。所述抗体可以包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab片段和通过Fab表达文库制备的片段。抗体，即抑制二聚体形成的那些，对于治疗用途是特别优选的。
用于抗体诱导的肥胖和/或糖尿病变体产物的片段不需要以生物学活性为特征，但必须以免疫学活性为特征；但是，蛋白片段或寡肽必须是抗原性的。用于诱导特异性抗体的肽可以具有SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42所示序列的至少5个氨基酸，优选至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。它们优选应该模拟天然蛋白的氨基酸序列的一部分，并且可以含有小的天然存在分子的完整氨基酸序列。肥胖和/或糖尿病变体蛋白氨基酸的短片段可以与其它蛋白如匙孔血蓝蛋白的片段和针对嵌合分子产生的抗体融合。可以将本领域公知的程序用于生产抗肥胖和/或糖尿病变体产物的抗体。
为了生产抗体，可以通过注射肥胖和/或糖尿病变体产物或保留免疫原性特性的任何部分、片段或寡肽而免疫各种宿主，包括羊、兔、大鼠、小鼠等。根据宿主的物种，可以用多种佐剂增加免疫应答。所述佐剂包括，但不限于弗氏佐剂、矿物凝胶，如氢氧化铝，和表面活性物质，如溶血卵磷脂、多元醇、聚阴离子、肽、油乳状液、匙孔血蓝蛋白的和二硝基苯酚。BCG(bacilli Calmette-Guerin)和小棒杆菌是潜在有用的人佐剂。
可以用任何技术制备抗肥胖和/或糖尿病变体蛋白的单克隆抗体，该技术通过连续培养细胞系生产抗体分子。这些包括，但不限于最初由Koehler和Milstein描述的杂交瘤技术(Nature 256495-497(1975))，人B细胞杂交瘤技术(Kosbor et al.，Immunol.Today 472(1983)；Cote et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030(1983))和EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，Mol.Cell Biol.62109-120(1984))。
也可以使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术，将小鼠抗体基因剪接于人抗体基因，以获得具有合适抗原特异性和生物活性的分子(Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816851-6855(1984)；Neuberger et al.，Nature 312604-608(1984)；Takedaet al.，Nature 314452-454(1985))。或者，可以改进对生产单链抗体所描述的技术(U.S.Pat.No.4,946,778)以适于生产变体蛋白的特异性单链抗体。
也可以按照Orlandi等的描述(Proc.Natl.Acad.Sci.USA863833-3837(1989))，和Winter G and Milstein C.(Nature349293-299(1991))，通过体内诱导淋巴细胞群中的生产或通过筛选重组免疫球蛋白文库或组而制备抗体。
也可以制备含有肥胖和/或糖尿病变体蛋白的特异性结合位点的抗体片段。例如，所述片段包括，但不限于可以通过用胃蛋白酶消化抗体分子制备的F(ab′)2片段和可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而制备的Fab片段。或者，可以构建Fab表达文库，以便允许迅速和容易鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse W.D.et al.，Science 2561275-1281(1989))。
B.抗体的诊断用途用于使用具有建立的特异性的多克隆或单克隆抗体的竞争性结合或免疫放射性测量分析的多种方案是本领域公知的。所述免疫测定通常涉及肥胖和/或糖尿病变体产物及其特异性抗体之间的复合物形成和复合物形成的测量。优选的是利用与特异性变体产物上的两个不干扰的表位反应的单克隆抗体的两位点、基于单克隆的免疫测定，但也可以使用竞争性结合测定。这些测定描述于Maddox D.E.，等人的文献(J.Exp.Med.1581211(1983))。
特异性结合于肥胖和/或糖尿病变体产物的抗体可以用于通过肥胖和/或糖尿病变体的超量表达或表达不足而诊断特征在于表达本发明的新的肥胖和/或糖尿病变体(正常情况下不表达)的状况或疾病，也可以用于检测这样的疾病，其中本发明的肥胖和/或糖尿病变体和发生改变而得到变体的原始肥胖和/或糖尿病序列的量之间的比例发生了改变。或者，所述抗体可以用于监测用肥胖和/或糖尿病变体产物治疗的患者的测定中。用于变体蛋白的诊断性测定包括利用抗体和标记检测人类体液或细胞或组织提取物中的变体产物的方法。可以使用经过修饰或未修饰的本发明的产物和抗体。通常，通过与报道分子共价或非共价连接，可以标记蛋白和抗体。多种报道分子是本领域公知的。
多种利用各自蛋白的特异性多克隆或单克隆抗体测量肥胖和/或糖尿病变体产物的方案是本领域公知的。其例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活的细胞分选(FACS)。如上文所述，优选的是利用与特异性变体产物上的两个不干扰的表位反应的单克隆抗体的两位点、基于单克隆的免疫测定，但也可以使用竞争性结合测定。这些测定描述于Maddox D.E.，等人的文献(上文)和其它文献。所述方案提供了诊断肥胖和/或糖尿病变体产物表达水平改变或异常的基础。通过在本领域公知的适于复合物形成的条件下将采集自正常受试者，优选人的体液或细胞提取物与抗肥胖和/或糖尿病变体产物的抗体混合，确立肥胖和/或糖尿病变体产物表达的正常或标准值。可以通过多种方法，优选通过光测量法对标准复合物形成进行定量。然后，可以将从正常样品获得的标准值与从优先受疾病影响的受试者的样品获得的值进行比较。标准值和受试者值的差异确定了疾病状态的存在。
抗体测定可以用于确定存在于体液样品中的肥胖和/或糖尿病变体产物的水平，以便确定它是否在组织被表达，是否被过量表达或表达不足，或作为可变产物的肥胖和/或糖尿病变体水平如何与药物治疗相对应的指标。
C.抗体的治疗用途除了诊断用途，所述抗体可以具有治疗用途，用于阻断或降低病理状况中的肥胖和/或糖尿病变体产物的活性，其中通过所述降低，可以达到有益效果。
使用的抗体优选是通过公知的球蛋白-基因文库方法制备的人源化单克隆抗体，或人Mab。通常通过IV注射，给予作为无菌溶液的抗体，但是其它的肠胃外途径也是合适的。通常抗体的给药量是约1-15mg/kg受试者体重。例如用每1-7天给药而继续进行治疗，直到观察到治疗改进。
尽管参照特定方法和实施方案描述了本发明，应当理解，可以进行多种修改和改变而不背离本发明。
实施例1——分离以等于2的MOI，用表达包含SEQ ID NO23-SEQ ID NO25或SEQ ID NO27-SEQ ID NO30或SEQ ID NO32或SEQ ID NO34-SEQ ID NO39或SEQ ID NO41-SEQ ID NO42的氨基酸序列的肥胖和/或糖尿病变体(AC-肥胖和/或糖尿病变体)的杆状病毒感染Sf-9细胞。在28℃，连续振荡(90rpm)下生长细胞。在感染后(hpi)60小时，收集培养基，通过以5000rpm离心5分钟而从培养基分离细胞。采用SP-Sepharose柱，通过阳离子交换层析分离10mL培养基。用PBS pH6.5平衡柱子，并且在将样品加样到柱子上后，用PBS洗涤柱子，以洗脱未结合的蛋白(流通级分)。用浓度逐渐增加的NaCl，以2mL/min(5％NaCl/min)的流速进行洗脱。
对不同的级分进行SDS-PAGE电泳，并且用抗肥胖和/或糖尿病变体抗体进行蛋白印迹。
实施例2——分泌以等于2的MOI，用表达肥胖和/或糖尿病变体(AC-肥胖和/或糖尿病变体)的杆状病毒感染Sf-9细胞。在28℃，连续振荡(90rpm)下生长细胞，在感染后(hpi)24、48和60小时收集1mL样品。离心后，用裂解缓冲液(50mM Tris pH 7.5，1％ triton X100，和蛋白酶抑制剂混合物)在4℃下裂解细胞沉淀30分钟，并且超声处理30秒。以14000rpm离心样品10分钟，将上清液指定为Pellet。将样品缓冲液补加到40μL Pellet制剂和40μL培养基(指定培养基)，在15％SDS-PAGE上电泳。电泳后，对凝胶进行半干蛋白转移，以便转移到硝酸纤维素膜上。将所述膜与抗肥胖和/或糖尿病变体温育2小时，并且与第二抗-兔抗体再温育1小时。
用商购的蛋白印迹检测试剂盒进行信号检测。
序列表<110>Mintz，Liat<120>用于诊断、监测和治疗肥胖和/或糖尿病的组合物、试剂和试剂盒以及方法<130>28238-001<150>US 10/659,782<151>2003-09-11<160>42<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>4517<212>DNA<213>人<400>1ctgattccat accagagggg ctcaggatgc tgttgctggg agctgttcta ctgctattag 60ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga ctcaagggcc cggagtcctg cttcccctgc 120ccaagggggc ctgcacaggt tggatggcgg gcatcccagg gcatccgggc cataatgggg 180ccccaggccg tgatggcaga gatggcaccc ctggtgagaa gggtgagaaa ggagatccag 240gtcttattgg tcctaaggga gacatcggtg aaaccggagt acccggggct gaaggtcccc 300gaggctttcc gggaatccaa ggcaggaaag gagaacctgg agaaggtgcc tatgtatacc 360gctcagcatt cagtgtggga ttggagactt acgttactat ccccaacatg cccattcgct 420ttaccaagat cttctacaat cagcaaaacc actatgatgg ctccactggt aaattccact 480gcaacattcc tgggctgtac tactttgcct accacatcac agtctatatg aaggatgtga 540aggtcagcct cttcaagaag gacaaggcta tgctcttcac ctatgatcag taccaggaaa 600ataatgtgga ccaggcctcc ggctctgtgc tcctgcatct ggaggtgggc gaccaagtct 660ggctccaggt gtatggggaa ggagagcgta atggactcta tgctgataat gacaatgact 720ccaccttcac aggctttctt ctctaccatg acaccaactg atcaccacta actcagagcc 780tcctccaggc caaacagccc caaagtcaat taaaggcttt cagtacggtt aggaagttga 840ttattattta gttggaggcc tttagatatt attcattcat ttactcattc atttattcat 900tcattcatca agtaacttta aaaaaatcat atgctatgtt cccagtcctg gggagcttca 960caaacatgac cagataactg actagaaaga agtagttgac agtgctattt tgtgcccact1020gtctctcctg atgctcatat caatcctata aggcacaggg aacaagcatt ctcctgtttt1080tacagattgt atcctgaggc tgagagagtt aagtgaatgt ctaaggtcac acagtattaa1140gtgacagtgc tagaaatcaa acccagagct gtggactttg ttcactagac tgtgcccttt1200tatagaggta catgttctct ttggagtgtt ggtaggtgtc tgtttcccac ctcacctgag1260agccattgaa tttgccttcc tcatgaatta aaacctcccc caagcagagc ttcctcagag1320aaagtggttc tatgatgaag tcctgtcttg gaaggactac tactcaatgg cccctgcact1380
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<400>21actgttggcc tctggawtca gaggctgctg cctgcctggg aggttgtaga aagctctgca 60ggttttcttc gtgtgtccta cagggcgccc tgagccaggt ccctgtttga tggcagttat 120gaaaaattac ctcctcccga tcctggtgct cttcctggcc tactactact attctacaaa 180tgaagagttc agaccagaaa tgctccaggg aaagaaagtg attgtcactg gggccagcaa 240agggattgga agagaaatgg catatcatct gtcaaaaatg ggagcccatg tggtattgac 300tgccaggtcg gaggaaggtc tccagaaggt agtgtctcgc tgccttgaac tcggagcagc 360ctctgctcac tacattgctg gcactatgga agacatgaca tttgcggagc aatttattgt 420caaggcggga aagctcatgg gcggactgga catgcttatt ctaaaccaca tcactcagac 480ctcgctgtct ctcttccatg acgacatcca ctctgtgcga agagtcatgg aggtcaactt 540cctcagctac gtggtcatga gcacagccgc cttgcccatg ctgaagcaga gcaatggcag 600cattgccgtc atctcctcct tggctggggg aagaacagtt ccacaacaga gaagtcgcag 660tgttactcct gactcccgcg gcccgtgatt aatatcacca gccacagaat ggactggaac 720cctgtatcga tctggtggga ttggatataa cgaacataga attactcctg agactaccag 780aactgaatag ttcaaatcaa atcatgccag aatatcagac aaatccaaat ggcaaaacag 840ttgca 845<210>22<211>244<212>PRT<213>人<400>22Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly His1 5 10 15Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro Leu Pro20 25 30Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly His Pro Gly35 40 45His Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly Thr Pro Gly Glu50 55 60Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly Pro Lys Gly Asp Ile65 70 75 80Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly Pro Arg Gly Phe Pro Gly85 90 95Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg100 105 110
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<400>30Met Leu Leu Leu Gln Ala Leu Leu Phe Leu Leu Ile Leu Pro Ser His1 5 10 15Ala Glu Asp Asp Val Thr Thr Thr Glu Glu Leu Ala Pro Ala Leu Val20 25 30Pro Pro Pro Lys Gly Thr Cys Ala Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly35 40 45His Pro Gly His Ile Lys Ile Lys Phe Glu Gly His Pro Pro Gly Arg50 55 60Leu Asn Cys Ala Lys Ile Trp His Phe Leu Gln Asp65 70 75<210>31<211>117<212>PRT<213>人<400>31Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115<210>32<211>116<212>PRT<213>人<400>32
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Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala165 170 175Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys260 265 270Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg275 280 285Phe Ile Asn Lys290<210>34<211>163<212>PRT<213>人<220>
<221>综合特征<222>(163)..(163)<223>Xaa可以是任何天然存在的氨基酸<400>34Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu
20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Ser Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe65 70 75 80Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp85 90 95Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe His100 105 110Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe Leu Ser115 120 125Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Met Cys Ala Leu Leu Leu Glu Cys Tyr His Val Val His Leu145 150 155 160Ser Ser Xaa<210>35<211>295<212>PRT<213>人<400>35Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met
85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala165 170 175Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys260 265 270Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Glu Gly275 280 285Leu Phe Cys Leu Met Phe Ile290 295<210>36<211>274<212>PRT<213>人<400>36Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu
20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala Tyr Pro145 150 155 160Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe165 170 175Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val Ser Ile180 185 190Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Ala195 200 205Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu Cys Ala210 215 220Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val Tyr Tyr225 230 235 240Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys Arg Lys245 250 255Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg Phe Ile260 265 270Asn Lys
<210>37<211>274<212>PRT<213>人<400>37Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met15 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Ser Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe65 70 75 80Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp85 90 95Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu Phe His100 105 110Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe Leu Ser115 120 125Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn130 135 140Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys Val Ala Tyr Pro145 150 155 160Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe165 170 175Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val Asn Val Ser Ile180 185 190Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Ala195 200 205Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu Cys Ala210 215 220Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val Tyr Tyr225 230 235 240
Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys Arg Lys245 250255Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg Phe Ile260 265 270Asn Lys<210>38<211>262<212>PRT<213>人<400>38Met Leu Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile1 5 10 15Gly Arg Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val20 25 30Val Thr Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys35 40 45Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu50 55 60Asp Met Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met65 70 75 80Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu85 90 95Asn Leu Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val100 105 110Asn Phe Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu115 120 125Lys Gln Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Gly Lys130 135 140Val Ala Tyr Pro Met Val Ala Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu145 150 155 160Asp Gly Phe Phe Ser Ser Ile Arg Lys Glu Tyr Ser Val Ser Arg Val165 170 175Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr180 185 190
Ala Met Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys195 200 205Glu Glu Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu210 215 220Glu Val Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn225 230 235 240Pro Cys Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met245250 255Asp Arg Phe Ile Asn Lys260<210>39<211>244<212>PRT<213>人<400>39Met Ala Phe Met Lys Lys Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Gly Leu Phe Met1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Ala Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ala Lys Met Gly Ala His Val Val Val Thr50 55 60Ala Arg Ser Lys Glu Thr Leu Gln Lys Val Val Ser His Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Val Ala Gln Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Asn Thr Ser Leu Asn Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His His Val Arg Lys Ser Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160
Ser Asn Gly Ser Ile Val Val Val Ser Ser Leu Ala Glu Thr Ala Met165 170 175Lys Ala Val Ser Gly Ile Val His Met Gln Ala Ala Pro Lys Glu Glu180 185 190Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Gly Ala Leu Arg Gln Glu Glu Val195 200 205Tyr Tyr Asp Ser Ser Leu Trp Thr Thr Leu Leu Ile Arg Asn Pro Cys210 215 220Arg Lys Ile Leu Glu Phe Leu Tyr Ser Thr Ser Tyr Asn Met Asp Arg225 230 235 240Phe Ile Asn Lys<210>40<211>292<212>PRT<213>小鼠<400>40Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ser Lys Met Gly Ala His Val Val Leu Thr50 55 60Ala Arg Ser Glu Glu Gly Leu Gln Lys Val Val Ser Arg Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Gln Thr Ser Leu Ser Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg Val Met Glu Val Asn Phe130 135 140
Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Lys Met Thr165 170 175Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser Lys Phe Ala Leu Asp Gly180 185 190Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr Ile Thr Lys Val Asn Val195 200 205Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile Asp Thr Glu Thr Ala Met210 215 220Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln Ala Ser Pro Lys Glu Glu225 230 235 240Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala Leu Arg Lys Ser Glu Val245 250 255Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile Leu Leu Gly Asn Pro Gly260 265 270Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys Asp Met275 280 285Phe Val Ser Asn290<210>41<211>250<212>PRT<213>小鼠<400>41Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Leu Gln Lys Val20 25 30Val Ser Arg Cys Leu Glu Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala35 40 45Gly Thr Met Glu Asp Met Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala50 55 60Gly Lys Leu Met Gly Gly Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr65 70 75 80
Gln Thr Ser Leu Ser Leu Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg85 90 95Val Met Glu Val Asn Phe Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala100 105 110Leu Pro Met Leu Lys Gln Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser115 120 125Leu Ala Gly Lys Met Thr Gln Pro Met Ile Ala Pro Tyr Ser Ala Ser130 135 140Lys Phe Ala Leu Asp Gly Phe Phe Ser Thr Ile Arg Thr Glu Leu Tyr145 150 155 160Ile Thr Lys Val Asn Val Ser Ile Thr Leu Cys Val Leu Gly Leu Ile165 170 175Asp Thr Glu Thr Ala Met Lys Glu Ile Ser Gly Ile Ile Asn Ala Gln180 185 190Ala Ser Pro Lys Glu Glu Cys Ala Leu Glu Ile Ile Lys Gly Thr Ala195 200 205Leu Arg Lys Ser Glu Val Tyr Tyr Asp Lys Ser Pro Leu Thr Pro Ile210 215 220Leu Leu Gly Asn Pro Gly Arg Lys Ile Met Glu Phe Phe Ser Leu Arg225 230 235 240Tyr Tyr Asn Lys Asp Met Phe Val Ser Asn245 250<210>42<211>192<212>PRT<213>小鼠<400>42Met Ala Val Met Lys Asn Tyr Leu Leu Pro Ile Leu Val Leu Phe Leu1 5 10 15Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Ser Thr Asn Glu Glu Phe Arg Pro Glu Met Leu20 25 30Gln Gly Lys Lys Val Ile Val Thr Gly Ala Ser Lys Gly Ile Gly Arg35 40 45Glu Met Ala Tyr His Leu Ser Lys Met Gly Ala His Val Val Leu Thr50 55 60
Ala Arg Ser Glu Glu Gly Leu Gln Lys Val Val Ser Arg Cys Leu Glu65 70 75 80Leu Gly Ala Ala Ser Ala His Tyr Ile Ala Gly Thr Met Glu Asp Met85 90 95Thr Phe Ala Glu Gln Phe Ile Val Lys Ala Gly Lys Leu Met Gly Gly100 105 110Leu Asp Met Leu Ile Leu Asn His Ile Thr Gln Thr Ser Leu Ser Leu115 120 125Phe His Asp Asp Ile His Ser Val Arg Arg Val Met Glu Val Asn Phe130 135 140Leu Ser Tyr Val Val Met Ser Thr Ala Ala Leu Pro Met Leu Lys Gln145 150 155 160Ser Asn Gly Ser Ile Ala Val Ile Ser Ser Leu Ala Gly Gly Arg Thr165 170 175Val Pro Gln Gln Arg Ser Arg Ser Val Thr Pro Asp Ser Arg Gly Pro180 185 190
权利要求
1.分离的核酸序列，选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ IDNO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21及其互补序列。
2.核酸片段，包含权利要求1的分离的核酸序列的至少15个连续碱基对区段。
3.权利要求2的核酸片段，包含权利要求1的分离的核酸序列的15-30个连续碱基对区段。
4.包含权利要求2的核酸片段的引物。
5.包含权利要求2的核酸片段的探针。
6.权利要求1的分离的核酸序列，其中至少一个优选的密码子替代了所述序列的至少一个密码子。
7.由权利要求1的分离的核酸序列编码的氨基酸序列。
8.权利要求7的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自SEQ IDNO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQ ID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQ ID NO39，SEQ ID NO41和SEQ ID NO42。
9.包含权利要求8的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸区段的肽。
10.权利要求9的肽，包含权利要求8的氨基酸序列的5-20个连续氨基酸区段。
11.包含权利要求1的分离的核酸序列的表达载体，所述序列与用于在宿主细胞中表达所述序列的控制元件可操作性连接。
12.用权利要求11的表达载体转染的宿主细胞。
13.反义寡核苷酸，包含选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20和SEQ IDNO21的核酸序列的反向互补序列的10-40个连续碱基对区段。
14.检测肥胖和/或糖尿病相关基因的至少一个变体核酸序列在生物样品中的存在的方法，包括以下步骤(a)将选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21或其互补序列的分离的核酸序列与生物样品中的核酸物质杂交；和(b)检测由步骤(a)产生的杂交复合物；其中杂交复合物的存在与至少一种变体核酸在生物样品中的存在相关。
15.测定生物样品中的变体核酸序列水平的方法，包括以下步骤(a)将选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ IDNO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQ ID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21或其互补序列的分离的核酸序列与生物样品中的核酸物质杂交；和(b)确定由步骤(a)产生的杂交复合物的量；和(c)对杂交复合物的量进行归一化，以提供生物样品中的变体核酸序列水平。
16.确定第一种生物样品中肥胖和/或糖尿病相关基因变体的核酸序列水平与第二种生物样品中通过可变剪接制备的变体的比例的方法，包括以下步骤(a)确定第一种生物样品中肥胖和/或糖尿病相关基因变体的第一种核酸序列的水平；(b)确定第二种生物样品中可变剪接形式的变体的第二种核酸序列的水平；和(c)比较步骤(a)和步骤(b)获得的水平，以得到比例。
17.权利要求16的方法，其中所述第一种生物样品和第二种生物样品是相同的样品。
18.权利要求16的方法，其中第一种核酸序列和第二种核酸序列是mRNA转录物。
19.权利要求18的方法，其中第一种核酸序列和第二种核酸序列沉积在核酸芯片上。
20.鉴定能够影响肥胖和/或糖尿病相关蛋白与所述蛋白的受体结合亲和力的化合物的方法，包括以下步骤(a)提供选自SEQ ID NO24，SEQ ID NO25，SEQ ID NO27，SEQID NO28，SEQ ID NO29，SEQ ID NO30，SEQ ID NO32，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ ID NO36，SEQ ID NO37，SEQ ID NO38，SEQID NO39，SEQ ID NO41和SEQ ID NO42的氨基酸序列；(b)在肥胖和/或糖尿病相关基因的至少一种受体的存在下使候选化合物与氨基酸序列接触；(c)确定候选化合物对氨基酸序列与至少一种受体的结合的影响；和(d)选择能够影响肥胖和/或糖尿病相关蛋白与所述蛋白的受体的结合亲和力的化合物。
21.确定第一种生物样品中肥胖和/或糖尿病相关蛋白变体的水平与第二种生物样品中通过可变剪接制备的变体的比例的方法，包括以下步骤(a)确定第一种生物样品中肥胖和/或糖尿病相关基因变体的第一种氨基酸序列的水平；(b)确定第二种生物样品中可变剪接形式的变体的第二种氨基酸序列的水平；和(c)比较步骤(a)和步骤(b)获得的水平，以得到比例。
22.通过聚合酶链反应检测特异性肥胖和/或糖尿病相关核酸序列的方法，包括以下步骤(a)用引物对扩增特异性肥胖和/或糖尿病相关核酸序列，其中至少一个引物包含选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO11，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ ID NO16，SEQID NO17，SEQ ID NO18，SEQ ID NO20，SEQ ID NO21及其互补序列的核酸序列的至少15个连续碱基对片段；和(b)检测步骤(a)的核酸产物。
全文摘要
本发明涉及13种新的肥胖和/或糖尿病相关基因的可变剪接变体。
文档编号C12N9/04GK101023184SQ200480026203
公开日2007年8月22日 申请日期2004年9月9日 优先权日2003年9月11日
发明者利亚特·明茨 申请人:利亚特·明茨