专利名称：重组人脂肪酸氧化蛋白及其生产方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种重组人脂肪酸氧化蛋白及其生产方法和用途，是通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法克隆人游离脂肪酸氧化脂蛋白及其C-端球状结构域的cDNA序列，通过基因工程技术生产重组人游离脂肪酸氧化蛋白及其C-端球结构域的方法。该重组蛋白及其球状结构域在肥胖和糖代谢紊乱疾病中具有明确的应用价值。
目前，已知肥胖与糖尿病、心血管疾病、某些肿瘤以及睡眠-呼吸率乱等疾病有明显的相关关系，肥胖病已经取代了由营养不良和感染所引起的疾病，一跃成为危害人类健康的主要杀手。可见，肥胖已经不仅仅是个影响人体形象的问题，而是成为一种流行病，威胁着全人类的健康。
近几十年来，欧美学者致力于肥胖治疗药物的研究和发展，减肥药物按其作用机制大体分为三大发展方向(1)抑制食欲；(2)影响营养物质吸收或代谢；(3)增加能量消耗。目前已有两大类化学药品被美国食品、药品管理局(FDA)或国家药品监督管理局(SDA)批准进入市场，它们的代表分别是曲美(学名西布曲明，sibutramine)、赛尼可(学名奥利可他，orlistat)。前者主要是作用于中枢神经，通过抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺的摄取而增加饱食感，属于中枢类减肥药。后者是一种长效的肠道脂肪酶抑制剂，失活的酶不能将食物中的脂肪(主要是甘油三酯)水解为可吸收的游离脂肪酸，从而减少热量摄入，控制体重。这二类药物都存在明显的毒副作用，同时禁忌症范围广泛。
随着分子生物学、分子内分泌学的发展，有关肥胖发生、发展的分子机制也逐渐被人们认识，这也为肥胖的治疗和预防提供了新的方向和希望。近几年，一系列研究表明脂肪细胞不仅是甘油三酯的贮藏地，而且也是具有生物学活性的细胞群体，它们合成和释放一些具有重要功能的多肽分子，通过自分泌、旁分泌、内分泌调节脂肪代能量平衡，而肥胖正是由这些特定多肽因子缺乏或过多引起的进食调控和能量代谢紊乱的疾病。
经研究发现小鼠的一种脂肪细胞补体相关蛋白(Adipocyte Complement-Related protein of 30Kda，ACRP30)及其蛋白水解产物可促进小鼠血液中的游离脂肪酸高效氧化，阻止脂肪酸进入脂肪细胞，使肥胖小鼠的体重减轻。为此，我们从人脂肪组织cDNA文库中筛选到一种参与脂肪酸氧化的蛋白质的cDNA，Nothern杂交分析表明该基因在脂肪组织上有高丰度表达，而在其他组织上不表达或低分度表达，更为重要的是，部分研究数据表明肥胖患者的体内缺乏该基因编码的蛋白质。核苷酸及其相应的氨基酸序列分析表明，该蛋白质由244个氨基酸组成，由N-端的胶原结构域和发挥生物学活性的C-端的球状结构域组成，与小鼠的ACRP30高度同源，由于其生理学的主要作用是促进游离脂肪酸氧化，因此称为人游离脂肪酸氧化蛋白。同曲美、赛尼可作用机理显著不同的是，人游离脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域是通过氧化燃烧血液中游离脂肪酸而达到减轻体重目的，对中枢神经系统和脂肪酶无抑制作用，因此该制品的作用明确，毒副作用小。
解决本发明技术问题所采用的技术方案是该重组人脂肪酸氧化蛋白，由244个氨基酸组成，由N-端的胶原结构域和发挥生物学活性的C-端的球状结构域组成，与小鼠的ACRP30高度同源，含有如附
图1所示编码的人脂肪氧化蛋白的核苷酸序列。重组人脂肪酸氧化蛋白的C-端球状结构域含有如附图2所示的cDNA序列。所述的核苷酸序列，包括该核苷酸序列的互补链。本发明利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从人脂肪组织cDNA文库中筛选到大片段长735bp，编码全长人脂肪酸氧化蛋白的cDNA序列，在此基础上获得小片段长438bp，编码其C-端球状结构域的cDNA序列，并利用真核和原核表达系统研究了其产物的理化性质和生物学活性。本发明以人脂肪组织cDNA文库为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(Retro-polymerase chainreaction，RT-PCR)技术获得全长735bp的人脂肪酸氧化蛋白的编码序列(见附图1)，在以该编码的DNA序列为模板通过聚合酶链式反应(PCR)技术获得人脂肪酸氧化蛋白的C-端球状结构域的编码序列(见附图2)，推导出相应的氨基酸序列见附图3、附图4，即所述的核苷酸序列能编码具有附图3所示的氨基酸序列的蛋白质，其分子量为30KD，所述的核苷酸序列能编码如附图4所示的氨基酸序列的蛋白质，其分子量为16KD。将这两段DNA序列分别克隆到原核和真核表达载体上，通过转化导入原核和真核细胞中构成工程细胞，工程细胞经培养及诱导产生表达产物。表达产物通过离心、超滤及柱层析获得具有生物学活性的重组人游离脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域的制品。体外、体内的生物学实验表明重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域能加速游离脂肪酸的氧化，降低血糖，参与糖和脂类代谢平衡的调节，因而可应用于肥胖、糖代谢紊乱等疾病的预防和治疗。
本发明一种生产重组人脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域的方法，包括基因克隆、重组蛋白质的表达和分离纯化。表达产物的生物学活性测定，重组蛋白质的表达和分离纯化包括工程细胞的发酵、发酵产物的超滤、浓缩、沉淀、蛋白质柱层析纯化，其特征在于将以上所述的如附图1所示编码的人脂肪酸氧化蛋白的DNA序列和C-端球状结构域含有如附图2所示的cDNA序列插入适当的表达载体后，导入原核和真核细胞，构成工程细胞，在合适的条件下培养工程细胞，并将细胞表达产物经过分离。纯化得到重组人脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域。合适的载体为原核表达载体和真核表达载体，可在细菌、细胞及(转基因)动植物个体器官或组织中表达。原核细胞可为大肠杆菌，其表达产物通过离心得到不溶性的包涵体沉淀，该包涵体沉淀需复性才能具有生物学活性。
总之，本发明不仅公开了一种人脂肪酸及其C-端球状结构域的核甘酸及相应氨基酸的序列，并提供了生产方法，包括工程细胞的建立及诱导表达方法，蛋白质的分离和纯化等一系列适合生产的工艺路线。通过该方法获得的重组人脂肪酸氧化蛋白质及其C-端结构域纯品，纯度可达95％以上，其N-端氨基酸序列(如附图5，附图6)同依据核甘酸序列推导的氨基酸序列一致。该制品在体内、体外能促进游离脂肪酸加速氧化，降低血糖，调节机体糖和脂类代谢平衡，因而提示该重组分子能应用于临床上治疗肥胖、糖代谢紊乱等病症。
以下结合实施例附图对本发明作进一步的描述。
图1全长人脂肪酸氧化蛋白的cDNA序列图2人脂肪酸氧化蛋白C-端结构域的cDNA序列图3人脂肪酸氧化蛋白的氨基酸序列图4人脂肪酸氧化蛋白C-端结构域的氨基酸序列图5重组人脂肪酸氧化蛋白N-末端序列图6重组人脂肪酸氧化蛋白C-端结构域的N-末序列图7重组人脂肪酸氧化蛋白及其C-端结构域的原核细胞生产工艺图8重组人脂肪酸氧化蛋白及其C-端结构域的真核细胞生产工艺
1.全长人脂肪酸氧化蛋白是通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从人脂肪组织cDNA文库中获得，其上、下游引物分别为5′ATG CTG TTG CTG GGA GCT GTT CTA5′TCA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA2.cDNA的第一条链的合成取人脂肪组织cDNA文库0.5μg，加入下游引物，于65℃保温10分钟，迅速加入Boehringer第一链cDNA合成体系中混匀，室温放置10分钟后于42℃保温10分钟，进行逆转录反应，完毕后于96℃10分钟灭活。
3.聚合酶链式反应(PCR)取上述反应产物2μl为模板，加入上游引物后进行聚合酶链式反应(PCR)，聚合酶链式反应条件为96℃1分钟、58℃1分钟和72℃1分钟30秒，共计30个循环得到735bp人全长脂肪酸氧化蛋白基因片段(基因片段的核苷酸序列见附图1)。
4.以全长脂肪酸氧化蛋白的基因片段为模板，通过聚合酶链式反应方法，获得其球状结构域的基因片段，其上、下游引物分别为上游引物5′ATG AAA GGA GAA CCT GGA GAA GGT下游引物5′TGA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA聚合酶链式反应反应条件94℃1分钟、56℃1分钟、72℃1分钟，共进行32个循环。产物克隆于T载体后进行全自动序列测定，其测定的核苷酸序列见附图2。
二、重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构功能域的原核表达及生产1.原核表达载体的构建以已获得的全长人脂肪氧化蛋白为模板，通过聚合酶链式反应方法获得不含信号肽序列的人脂肪酸氧化蛋白的基因片段，其上、下游引物分别是上游引物5′ATG GTC CTT TGG TGC TGA GTT CCC GG下游引物5′TGA GTT GGT TGT CAT GGT AGA GAA聚合酶链式反应条件为94℃1分钟、58℃130秒、72℃1分钟30秒，将产物克隆于T载体上进行全序列测定。
2.将该基因片段和已获得的人脂肪酸氧化蛋白的C-端结构域分别克隆于二类原核表达载体上经热诱导的pBV220系统和经IPTG诱导的pET表达载体上，分别转化大肠杆菌DH52和BL21，并筛选取获得稳定的高表达的工程细胞。
3、从4℃保存的工程菌平皿中挑取单菌落接种于5ml LB培养液式管中(含氨苄青霉素100μg/ml)，30℃、250转/分振荡培养12小时后，按5％比例接种于摇瓶中(含氨苄青霉素100μg/ml)30℃、200转/分振荡培养12小时后可作为种子液。
4、表达(热诱导)以1％浓度将种子液接种于25升LB改良培养液中(含氨苄青霉素100μg/ml，pH7.2)，30℃、300转/分振荡培养3-5小时。待其菌密度达到OD600＝0.3-0.4时，迅速升高温度至42℃诱导表达5小时。离心收集细菌、电泳鉴定目的蛋白表达含量。
5、表达(IPTG诱导)以1％浓度将种子液接种于25升LB改良培养液中(含氨苄青霉素100μg/ml，pH7.2)，37℃、300转/分振荡培养3-5小时。待其菌密度达到OD600＝0.3-0.4时，迅速加入IPTG至终浓度0.4-0.6mmol/L诱导表达4小时。离心收集细菌、电泳鉴定目的蛋白表达含量。
6、细菌细胞裂解4℃7,000g离心30分钟，弃去上清。称量细菌湿重量，按10g菌体/100ml的浓度加裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml溶菌酶)，25℃作用30分钟。然后冰浴超声30-45秒，间歇2分钟，共超声三次。超声完毕，4℃7,000g离心30分钟，弃去上清，收集包涵体沉淀。以20mmol/L Tris-HCl 1mmol/LEDTA pH8.0洗涤一次。
7.包涵体洗涤和纯化(1)以0.1％Triton X-100(20mmol/L Tris-HCl 1mmol/LEDTA pH8.0配制)重悬沉淀(20g/100ml)，室温搅拌30分钟。15,000g离心20分钟，弃去上清。沉淀用20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH8.0洗涤一次。(2)以2.5mol/L尿素(20mmol/L Tris-HCl 1mmol/L EDTApH8.0配制)重悬步骤(1)沉淀(20g/100ml)，室温搅拌30分钟，15,000g离心30分钟，弃上清。沉淀用20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH8.0洗涤一次，称重。
8、包涵体裂解采用6-8mol/L尿素溶解液或6-7mol/L盐酸胍溶解液溶解已纯化的包涵体。上述溶解液由0.5-1％巯基乙醇、20mmol/LTris-HCl 1mmol/L EDTA pH6-9配制。将已纯化的包涵体重悬(20-30g/100ml)，室温搅拌30分钟至12小时，18,000g离心30分钟，留上清。
9、包涵体沉淀的复性可通过下列两种方法之一完成(1)稀释复性方法其复性液组分为0.1～1000mmol/L尿素、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L还原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、pH3～10；将变性溶解的包涵体蛋白液逐加入复性溶液中；复性浓度应控制在0.1-0.6mg/ml；充分复性后，经Millipore公司的M-12超滤浓缩(分子量截留5000)，再经10～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、1～10mmol/LEDTA pH6～9缓冲液充分透析。
(2)分子筛层析复性其复性液组分为0.1～1000mmol/L盐酸胍、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L还原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、pH3～10。Sephacryl S-300快速柱(802.6cm)。经6-8mol/L尿素溶解液或6-7mol/L盐酸胍溶解液变性的包涵体样品直接上样于经2-4mol/L尿素(20mM Tris-HCl 2mM EDTA pH6-9)平衡后的Sephacryl S-300柱。280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域在主峰。
10.复性蛋白的柱层析纯化(1)强阳离子交换层析结合分子筛层析法选用瑞典Pharmacia公司的SP-Sepharose Fast Flow，用pH3～6 50mmol/L乙酸钠缓冲液平衡SP-FF柱(2.6×20cm)。包涵体复性液在乙酸钠缓冲液中充分透析后上样。用乙酸钠缓冲液洗脱未结合蛋白，用0～2mol/L NaCl梯度洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域在第2峰。将以上述第2峰样品上样于50mmol/L Tris-HCl pH8.0平衡的Sephacryl S-100快速柱脱盐，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况。重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域在主峰中。
(2)阴离子交换层析结合分子筛层析法选用瑞典Pharmacia公司的DEAE-Sepharose FF阴离子交换柱。柱先用50mmol/L Tris-HCl pH6～9流洗平衡。包涵体复性液直接上样，上样浓度1mg/ml，用50mmol/LTris-HCl pH6～9缓冲液洗脱未结合相。用0～1mol/L NaCl梯度洗脱，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况，重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域在主峰。将以上主峰样品上于已平衡的Sephacryl S-100快速柱，280nm检测洗脱蛋白峰，SDS-PAGE鉴定各峰蛋白分布情况。重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域在主峰。
三、重组人脂肪酸的氧化蛋白及其结构功能域的真核表达及生产1.真核表达载体的构建和工程细胞的建立将已获得的全长人脂肪酸氧化蛋白的基因片段克隆于真核表达载体pSVL上，经脂质体法导入真核细胞CHO-K细胞上，并经氨甲蝶呤加压筛选获得高表达的工程细胞。
2.工程细胞的培养和表达产物的收集工程细胞经多孔微载体无血清灌注培养，连续收集细胞培养上清，并对上清进行生物学活性测定。
3.表达产物的分离、纯化将细胞培养上清进行膜澄清，上清通过5000-1万分子量的膜进行超滤浓缩，浓缩产物加入饱和硫酸胺溶液，最终硫酸胺浓度达到26～38％，离心去除沉淀的杂蛋白，收集离心上清，随后采用下列柱层析进行进一步分离(a)疏水层析Phenyl Sepharose 6 Fast Flow，洗脱条件为100％-0％硫酸胺梯度，目标蛋白在峰2中；(b)将峰2收集的目标蛋白进行离子交换层析QSepharose Fast Flow，洗脱条件为0-1M NaCl梯度洗脱，目标蛋白在主峰上；(c)将收集的目标蛋白进行脱盐，柱层析介质为GH-25四、重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域的生物学活性测定1.体内活性测定将10周龄C57BL/6J小鼠18只，采用高脂肪、高糖的饲料连续喂养30天，然后随机合成分成三组，每组6只，并记录体重。A组注射生理盐水；B组注射10微克/天的全长人脂肪酸氧化蛋白；C组注射10微克/天的全长人脂肪酸氧化蛋白的球状结构域。同时小鼠持续进行高脂肪、高糖的饲养喂养10天，每天测定小鼠血液中的游离脂肪酸、葡萄糖和三油酸脂(Triglyceride，TG)。结果表明A组体重无明显变化，B组体重减轻2.8％(P＝0.025)；C组体重减轻11％(P＝0.001)。同时B组、C组小鼠血液中的游离脂肪酸、葡萄糖和TG水平显著降低(P＝0.01)。2.体外活性测定培养的C2C12骨骼肌细胞在DMEM25％胎牛血液培养七天，实验前1小时移取培养基，加入1ml的下列混合液(3mM葡萄糖、0.25mMHepes、0.25mMoleate 1％FFA-Free BSA，并加入[14C]标记的oleicaeid，细胞在分别加入5ug/ml全长人脂肪酸氧化蛋白和其结构域孵育90分钟，分析14CO2。结果表明人脂肪酸氧化蛋白结构域显著增加油酸的氧化(p＝0.001)，人脂肪酸氧化蛋白能增加油酸的氧化(p＝0.05)。
序列表<110>湖南盈程生命科学研究所有限公司<120>重组人脂肪酸氧化蛋白及其生产方法和用途<160>6<210>1<211>735<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(735)<400>1atgctgttgc tgggagctgt tctactgcta ttagctctgc ccggtcatga ccaggaaacc 60acgactcaag ggcccggagt cctgcttccc ctgcccaagg gggcctgcac aggttggatg 120gcgggcatcc cagggcatcc gggccataat ggggccccag gccgtgatgg cagagatggc 180acccctggtg agaagggtga gaaaggagat ccaggtctta ttggtcctaa gggagacatc 240ggtgaaaccg gagtacccgg ggctgaaggt ccccgaggct ttccgggaat ccaaggcagg 300aaaggagaac ctggagaagg tgcctatgta taccgctcag cattcagtgt gggattggag 360acttacgtta ctatccccaa catgcccatt cgctttacca agatcttcta caatcagcaa 420aaccactatg atggctccac tggtaaattc cactgcaaca ttcctgggct gtactacttt 480gcctaccaca tcacagtcta tatgaaggat gtgaaggtca gcctcttcaa gaaggacaag 540gctatgctct tcacctatga tcagtaccag gaaaataatg tggaccaggc ctccggctct 600gtgctcctgc atctggaggt gggcgaccaa gtctggctcc aggtgtatgg ggaaggagag 660cgtaatggac tctatgctga taatgacaat gactccacct tcacaggctt tcttctctac 720catgacacca actga 735<210>2<211>438<212>DNA<213>人类(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(1)...(438)<400>2atgaaaggag aacctggaga aggtgcctat gtataccgct cagcattcag tgtgggattg 60gagacttacg ttactatccc caacatgccc attcgcttta ccaagatctt ctacaatcag 120caaaaccact atgatggctc cactggtaaa ttccactgca acattcctgg gctgtactac 180tttgcctacc acatcacagt ctatatgaag gatgtgaagg tcagcctctt caagaaggac 240aaggctatgc tcttcaccta tgatcagtac caggaaaata atgtggacca ggcctccggc 300tctgtgctcc tgcatctgga ggtgggcgac caagtctggc tccaggtgta tggggaagga 360gagcgtaatg gactctatgc tgataatgac aatgactcca ccttcacagg ctttcttctc 420taccatgaca ccaac tga 438<210>3<211>244<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>3Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Gly1 5 10 15His Asp Gln Glu Thr Thr Thr Gln Gly Pro Gly Val Leu Leu Pro20 25 30Leu Pro Lys Gly Ala Cys Thr Gly Trp Met Ala Gly Ile Pro Gly35 40 45His Pro Gly Hi s Asn Gly Ala Pro Gly Arg Asp Gly Arg Asp Gly50 55 60Thr Pro Gly Glu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Pro Gly Leu Ile Gly65 70 75Pro Lys Gly Asp Ile Gly Glu Thr Gly Val Pro Gly Ala Glu Gly80 85 90Pro Arg Gly Phe Pro Gly Ile Gln Gly Arg Lys Gly Glu Pro Gly95 100 105Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala Phe Ser Val Gly Leu Glu110 115 120Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys Ile125 130 135Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe140 145 150His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr155 160 165Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser Leu Phe Lys Lys Asp Lys170 175 180Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn Asn Val Asp185 190 195Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu Hi s Leu Glu Val Gly Asp Gln200 205 210Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr2l5 220 225Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr230 235 240His Asp Thr Asn244<210>4<211>10<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<220><221>ACETYLATION<400>4Met Leu Leu Leu Gly Ala Val Leu Leu Leu1 5 10<210>5<211>145<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>5Met Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala1 5 10 15Phe Ser Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro20 25 30Ile Arg Phe Thr Lys Ile Phe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp35 40 45Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn Ile Pro Gly Leu Tyr Tyr50 55 60Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val Ser65 70 75Leu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr80 85 90Gln Glu Asn Asn Val Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His95 100 105Leu Glu Val Gly Asp Gln Val Trp Leu Gln Val Tyr Gly Glu Gly110 115 120Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn Asp Ser Thr Phe125 130 135Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn140 145<210>6<211>10<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<220><221>ACETYLATION<400>6Met Lys Gly Glu Pro Gly Glu Gly Ala Tyr1 5 10
权利要求
1.一种重组人脂肪酸氧化蛋白，由244个氨基酸组成，由N-端的胶原结构域和发挥生物学活性的C-端的球状结构域组成，与小鼠的ACRP30高度同源，含有如附图1所示编码的人脂肪氧化蛋白的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于C-端球状结构域含有如附图2所示的cDNA序列。
3.根据权利要求1所述的重组人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列，包括该核苷酸序列的互补链。
4.根据权利要求1或2所述的重组人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列能编码具有附图3所示的氨基酸序列的蛋白质，其分子量为30KD。
5.根据权利要求1或2所述的重组人脂肪酸氧化蛋白，其特征在于所述的核苷酸序列能编码如附图4所示的氨基酸序列的蛋白质，其分子量为16KD。
6.一种生产重组人游离脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域的方法，包括基因克隆、重组蛋白质的表达和分离纯化。表达产物的生物学活性测定，重组蛋白质的表达和分离纯化包括工程细胞的发酵、发酵产物的超滤、浓缩、沉淀、蛋白质柱层析纯化，其特征在于将权利要求1或2所述的DNA序列插入适当的表达载体后，导入原核和真核细胞，构成工程细胞，在合适的条件下培养工程细胞，并将细胞表达产物经过分离。纯化得到重组人游离脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于合适的载体为原核表达载体和真核表达载体，可在细菌、细胞及(转基因)动植物个体器官或组织中表达。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于原核细胞为大肠杆菌，其表达产物通过离心得到不溶性的包涵体沉淀，该包涵体沉淀需复性才能具有生物学活性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于包涵体沉淀的复性可通过下列两种方法之一完成(a)稀释复性，其复性液组分为0.1～1000mmol/L尿素、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L还原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的缓冲液、pH3～10；(b)分子筛层析复性，其复性液组分为0.1～1000mmol/L盐酸胍、0.1～0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽、1～5mmol/L还原型谷胱甘肽、10～100mmol/L的缓冲液、pH3～10。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于细胞表达产物的纯化是采用柱层析纯化复性蛋白，柱层析介质采用阴离子交换介质，洗脱采用0～2mol/L的盐梯度洗脱，目标蛋白在主峰中。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于细胞表达产物的纯化是采用柱层析纯化复性蛋白，柱层析介质采用阳离子交换介质，洗脱采用0～2mol/L的盐梯度结合pH值梯度(pH3-10)洗脱，目标蛋白在第2峰中。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于真核细胞为CHO-细胞，培养采用多孔微载体无血清灌注培养。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于采用5000～1万分子量的膜对收集的上清进行浓缩，浓缩后上清经20～65％硫酸胺沉淀除去大部分非目标蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于采用如下柱层析纯化重组蛋白(a)采用疏水层析介质纯化经硫酸胺沉淀而分离的蛋白质样品，采用盐梯度洗脱(0～2mol/L硫酸胺)，目标蛋白在第2个峰中；(b)将上述采用疏水层析分析的目标蛋白样品，通过阴离子交换层析进行下一步的精制，采用0～2mol/L盐梯度洗脱，目标蛋白在主峰；(c)将上述经阴离子交换收集的目标蛋白样品经分子筛GH-25脱盐。
15.权利要求1或2或3或4或5所述的重组人游离脂肪酸氧化蛋白及其C-端球状结构域制品，其特征在于可作为功能性食品或药品用于治疗和预防肥胖、糖代谢紊乱。
全文摘要
本发明涉及一种重组人脂肪酸氧化蛋白及其生产方法和用途。该重组人脂肪酸氧化蛋白，由244个氨基酸组成，由N－端的胶原结构域和发挥生物学活性的C－端的球状结构域组成，含有编码人脂肪酸氧化蛋白的核苷酸序列，C－端球状结构域含有cDNA序列。其生产方法是(a)通过PCR方法筛选到两种基因片段大片段长735碱基对，编码全长人脂肪酸氧化蛋白；小片段长438碱基对，编码人脂肪酸氧化蛋白球状结构域；(b)将上述两种基因片段分别克隆，并获得表达；(c)建立工程细胞培养、诱导表达、超滤、柱层析一整套表达产物分离、纯化工艺，获得重组人脂肪酸氧化蛋白及其球状结构域纯品。该产品能用于预防和治疗肥胖、糖代谢紊乱等疾病。
文档编号C12P21/02GK1477113SQ0211435
公开日2004年2月25日 申请日期2002年8月21日 优先权日2002年8月21日
发明者宁云山, 肖灿鹏, 隋杰, 卢捷, 龚平, 杨浩 申请人:湖南盈程生命科学研究所有限公司