专利名称：冬虫夏草细胞液的制备方法
技术领域：
本发明涉及冬虫夏草细胞液的制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
冬虫夏草是一种珍稀的名贵中药，对许多疾病具有医治作用，可提高人体的免疫功能和延缓衰老，得到国内外医疗、食品界的格外重视。目前，国内外对虫草药用及保健制品的研究开发工作正方兴未艾，特别是国内，在这方面的研究开发更是如火如荼，以虫草子实体及其菌丝体为原料生产的药用制剂和保健制剂已有几十种，并且还在不断推出。这些药用制剂，在治疗心血管疾病、肝脏疾病、肾脏疾病、呼吸系统疾病、血液病以及作为抗肿瘤治疗的辅助用药等方面均取得了令人满意的疗效。这些产品的开发，进一步拓宽了虫草制剂的临床应用范围，扩展了虫草的应用领域。上述制剂中最具代表性的是冬虫夏草口服液。但是，现有技术中公开的冬虫夏草口服液存在以下不足首先是其培养基配方不合理。由于冬虫夏草是以蝙蝠蛾二龄虫为虫草菌的寄主，而二龄虫又是复杂的有机物集合体，其所含的营养成分十分复杂、全面，至今无确切的成份报道，因此，用目前常规的培养基对冬虫夏草进行培养，无法达到冬虫夏草所需营养成份；其次，现有技术中公开使用的对发酵液的处理方法中要用化学试剂将菌细胞与培养物残基结合物一并沉淀，破坏了冬虫夏草应有的成分并使其改变性质，自然会给服用者带来不适应和不安全性，而且还失去了冬虫夏草质的天然性；再者，现有技术制备的冬虫夏草口服液不利于人体吸收，尤其对年老体弱或病人来说，疗效和保健功能不明显。上述缺陷的存在，影响了冬虫夏草药用和保健价值的正常发挥，制约了以冬虫夏草为主要原料的技术开发和产业发展。
发明内容
本发明的目的是提供一种冬虫夏草细胞液的制备方法，其产品近似冬虫夏草天然性，解决了有效成分的安全性以及含量的稳定性问题，并提高了虫草真菌的药效、保健作用和服用的安全性。
本发明的构思是这样的。为了保证冬虫夏草细胞液的营养成份，首先要满足虫草菌的培养条件，特别是培养基的营养成份应该与其寄主蝙蝠蛾二龄虫所含营养成份相近，这样才能使培养的菌种接近天然的冬虫夏草成份。经多次检测和试验，本发明确定选择蚕蛹粉或蚕蛹粉水提液做为添加剂，用以丰富培养基质的营养成分，并分别添加在固体菌种和液体菌种培养基中。
此外，为了提高产品的吸收效果，本发明摒弃了以往的超微粉碎观念使冬虫夏草细胞液成为破壁细胞液，因为超微技术适用于固体介质，而不适合于对活体菌液细胞壁的破解，特别是超微粉碎产生一定温度将在某种程度上破坏加工物的有效成分。鉴于此，本发明利用活体菌液自身产生的生物酶使其细胞破壁，具体描述即活体菌液在一定温度条件下，活体菌液中的培养基产生葡萄聚糖酶和壳多糖酶这两种生物酶则将细胞连键—氢键阻断，使细胞壁得以破解，由此得到破壁细胞液。
本发明的特征还在于对发酵液的处理不使用如醋酸锌等化学试剂，以保证虫草菌中的特殊化学成份如虫草素、D-甘露醇、虫草多糖、腺苷、尿苷、SOD等不受破坏和改性，保证了其药效和安全性。
具体地，本发明的方法包括如下步骤(1)冬虫夏草斜面菌种的培养取天然冬虫夏草进行组织分离，在斜面培养基上进行培养，制得斜面菌种；所用培养基中含有按质量百分数表示的0.1-1％的蚕蛹粉；培养条件为温度20-26℃，培养时间15-7天；(2)液体菌种的制备取固体菌种在盛有经灭菌处理的培养液的容器中进行培养7天后，制得液体菌种；所用的培养液中含有蚕蛹粉水提液；(3)深层发酵扩大培养将液体菌种在无菌条件下依次接入盛有经灭菌处理的培养液的一级、二级、三级深层发酵培养器中，经培养得到活体菌液；三级深层发酵液体菌种接入量分别为培养液量的10％，三级深层发酵培养液中均含有蚕蛹粉水提液；
(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.1-6.7后，升温至40-50℃，保持15-5小时，得到细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌上述细胞液原液经过滤机初滤、精滤、真空减压脱气、装瓶封盖、灭菌后得破壁细胞液成品。
在步骤(2)和步骤(3)中所用的液体菌种培养液是这样的每公斤培养液中含有用1-10克蚕蛹粉制得的水提液。
本发明取得的效果是利用本发明的方法培养出的菌丝体，超过国家药典标定含量的8.3倍；产品冬虫夏草细胞液原液超过国家药典标定成分含量的2.7～3.9倍；冬虫夏草细胞液既可根据需要稀释，还可根据需要浓缩，并可以根据需要添加其它液剂；本方法还可以方便提取其中某一专用成分或综合用其全草所含成分，加工十分方便。
需要指出的是，本发明的细胞破壁工艺技术同样适用于如猴头、灵芝等所有珍稀真菌的活体菌液的细胞破壁而制得其细胞液。
具体实施例方式
以下实施例用以说明本发明。
实施例1(1)冬虫夏草斜面菌种的培养培养基组成成分为葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蚕蛹粉0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％，其余为无菌水(可用灭菌的自来水)；培养条件为温度20℃，培养时间15天；取天然冬虫夏草进行组织分离，在培养基上进行培养，制得斜面菌种；(2)液体菌种的制备按培养液总质量1公斤计，其组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、1克蚕蛹粉的水提液，其余为无菌水(可用灭菌的自来水)；取上述培养基装三角瓶约1/4，121℃灭菌30分钟后冷却至25℃，将固体菌种1cm2若干块在无菌条件下接入，经7天左右则成菌悬液并显示菌丝片段和大量菌丝球充满发酵变清液，即为液体菌种
(3)深层发酵扩大培养将液体菌种在无菌条件下接入一级深层发酵培养器中，接入量为培养液的10％，培养液经灭菌后在无菌条件下接入。而后的二级、三级深层发酵培养依此类推，当培养液变清并有大量菌丝片段和菌丝球出现时中止再进行下一个程序；(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.1后，升温至40℃，保持15小时，得到破壁细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌将上述细胞液原液经过过滤机初滤、精滤、真空减压脱气、脱炭处理，即可装瓶灭菌得到可直接服用的冬虫夏草口服液原液。
该原液可添加红枣汁或酸枣汁等调节口感。
实施例2(1)冬虫夏草斜面菌种的培养培养基成分葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蚕蛹粉0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％，其余为无菌水(可用经灭菌的自来水)；培养条件为温度24℃，培养时间10天；取天然冬虫夏草进行组织分离，在培养基上进行培养，制得斜面菌种；(2)液体菌种的制备按培养液总质量1公斤计，组成为葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、5克蚕蛹粉水提液，其余为无菌水(可用灭菌的自来水)；取上述培养基装三角瓶约1/4，121℃灭菌30分钟后冷却至25℃，将固体菌种1cm2若干块在无菌条件下接入，经7天左右则成菌悬液并显示菌丝片段和大量菌丝球充满发酵变清液，即为液体菌种(3)深层发酵扩大培养将液体菌种在无菌条件下接入一级深层发酵培养器中，接入量为培养液的10％，培养液经灭菌后在无菌条件下接入。而后的二级、三级深层发酵培养依此类推，当培养液变清并有大量菌丝片段和菌丝球出现时中止再进行下一个程序；
(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.4后，升温至45℃，保持10小时，得到破壁细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌将上述细胞液原液经过过滤机初滤、精滤、真空减压脱气、脱炭处理，即可装瓶灭菌得到可直接服用的冬虫夏草口服液原液。
该原液可添加红枣汁或酸枣汁等调节口感。
实施例3(1)冬虫夏草斜面菌种的培养培养基成分为葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、蚕蛹粉0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、琼脂2％，其余为无菌水(可用灭菌的自来水)；培养条件为温度26℃，培养时间7天；取天然冬虫夏草进行组织分离，在培养基上进行培养，制得斜面菌种；(2)液体菌种的制备按培养液总质量1公斤计，组成分葡萄糖2％、蛋白胨0.1％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.05％、10克蚕蛹粉水提液，其余为无菌水(可用灭菌的自来水)；取上述培养基装三角瓶约1/4，121℃灭菌30分钟后冷却制25℃，将固体菌种1cm2若干块在无菌条件下接入，经7天左右则成菌悬液并显示菌丝片段和大量菌丝球充满发酵变清液，即为液体菌种(3)深层发酵扩大培养将液体菌种在无菌条件下接入一级深层发酵培养器中，接入量为培养液的10％，培养液经灭菌后在无菌条件下接入。而后的二级、三级深层发酵培养依此类推，当培养液变清并有大量菌丝片段和菌丝球出现时中止再进行下一个程序；(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.7后，升温至50℃，保持5小时，得到破壁细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌将上述细胞液原液经过过滤机初滤、精滤、真空减压脱气、脱炭处理，即可装瓶灭菌得到可直接服用的冬虫夏草口服液原液。
该原液可添加红枣汁或酸枣汁等调节口感。
权利要求
1.冬虫夏草细胞液的制备方法，其特征是包括以下步骤(1)冬虫夏草斜面菌种的培养取天然冬虫夏草进行组织分离，在斜面培养基上进行培养，制得斜面菌种；所用培养基中含有按质量百分数表示的0.1-1％的蚕蛹粉；培养条件为控制温度20-26℃，培养时间15-7天；(2)液体菌种的制备取固体菌种在盛有经灭菌处理的培养液的容器中进行培养7天，制得液体菌种；所用的培养液中含有蚕蛹粉水提液；(3)深层发酵扩大培养将液体菌种在无菌条件下依次接入盛有经灭菌处理的培养液的一级、二级、三级深层发酵培养器中，经培养得到活体菌液；三级深层发酵液体菌种接入量分别为培养液量的10％，三级深层发酵培养液中均含有蚕蛹粉水提液；(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.1-6.7后，升温至40-50℃，保持15-5小时，使活体菌液中自身产生葡聚糖酶和壳多糖酶使其细胞壁破解，得到破壁细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌上述细胞液原液经过滤机初滤、精滤、真空减压脱气、装瓶封盖、灭菌后得冬虫夏草细胞液成品。
2.按权利要求1所述的冬虫夏草细胞液的制备方法，其特征是在步骤(2)和步骤(3)中所用液体菌种培养液是这样的每公斤培养液中含有用1-10克蚕蛹粉的水提液。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草细胞液的制备方法，该方法包括以下步骤(1)冬虫夏草斜面菌种的培养所用培养基中含有按质量百分数表示的0.1－1％的蚕蛹粉；(2)液体菌种的制备；(3)深层发酵扩大培养三级深层发酵培养液中均含有蚕蛹粉水提液；(4)活体菌液细胞破壁将活体菌液pH值调至6.1－6.7后，升温至40－50℃，保持15－5小时，得到细胞液原液；(5)过滤、脱气、装瓶、灭菌得冬虫夏草细胞液成品。本发明的制备方法工艺简单，制备的冬虫夏草破壁细胞液有效成分接近天然冬虫夏草，其营养丰富，易于被人体吸收，服用安全。本发明易于工业化生产实施。
文档编号C12N1/14GK1739582SQ20051001283
公开日2006年3月1日 申请日期2005年9月19日 优先权日2005年9月19日
发明者王永年, 王敬敏 申请人:王永年