转基因农产品dna检测芯片及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：转基因农产品dna检测芯片及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种转基因农产品DNA检测芯片及其制备方法和应用。
背景技术：
采用现代生物技术，培育出区别于传统育种的转基因作物(genetically modifiedorganism简记为GMO)，为农业研究方面开创了一个崭新的时代，为人类提高食物数量和质量打开了一扇前所未有的机遇之门。现代生物技术又称DNA重组技术，它在改善食物的营养质量，提高作物产量和抗病、抗虫能力、减少农药用量以及人类传染性疾病疫苗接种方面颇具潜力。近年来转基因农作物成为各国竞相研究开发的热点。近年来，转基因植物在全球种植面积和销售额增长迅速。种植转基因作物的国家由1992年的1个增加到目前的17个。国际农业生物技术应用机构(ISAAA)公布的一份报告显示，2004年全球转基因玉米、大豆、棉花和其它作物播种面积达到了2亿英亩，比2003年的1.67亿英亩增长了20％。2004年全球转基因作物种植面积占其总种植面积的百分比大豆56％、棉花28％、油菜19％、玉米14％。美国是种植转基因作物最多的国家，其转基因大豆产量已占大豆总产量的一半以上。我国政府十分重视生物技术的研究，正在研究的转基因生物有130多种，涉及的基因种类超过100种。特别是在转基因抗虫棉、转基因水稻、基因工程疫苗等领域的研究成果已居世界前列，2002年，我国转基因作物种植面积突破210万公顷，成为继美国、加拿大、巴西、阿根廷之后的转基因作物种植大国。自1997年至2003年9月，经过安全评价，农业部批准水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、马铃薯等10多种转基因植物进入田间环境释放，批准转基因棉花、番茄、甜椒等植物和兽用微生物基因工程疫苗进入商业化生产。
伴随着转基因农产品的不断开发和推广利用，转基因食品的安全问题尚未定论，各国政府、学术界和消费者关于转基因食品安全的争议不断。人们担心这种对生物进行“任意修改”而创造出来的新型遗传基因和生物可能会有害于人类，对生态环境造成新的污染，即所谓的转基因污染，而这种新的污染源又是很难消除的。另外，目前转基因技术的手段还是不完善的，新基因的插入是随机的，远未达到定向插入的程度。面对众多消费者对GMO的疑虑和反GMO组织的强大压力，食品制造商和各国政府已经做出反应。在欧洲，1998年6月，欧共体(EU)规定要对农作物标示其是否含有GMO。2000年EU又提出GMO的混入上限须在0.9％以下。我国已经加入WTO，不可避免会面临转基因食品的贸易纠纷。国外的转基因农产品通过贸易在没有标识和申明的情况下大量进入我国市场，对我国的农业生产、经济利益、人民身体健康和生态环境带来了很大的潜在风险。针对当前我国加强食品安全管理的形势，建立我国食品安全急需的检测方法，便于管理部门对转基因食品进行追踪管理，进而保护消费者的健康和权益。尽快研究制定标准对其进行准确、快速检测显得十分迫切。2001年国家制定了《农业转基因生物安全管理条例》。为保障《条例》的实施，农业部于2002年发布了《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》三个配套规章。自2002.3.20日起施行。要求对大豆、玉米、油菜类转基因食品进行标识。
对食品中的GMOs进行检测，目前欧盟推荐的官方方法有两种。一是基于DNA的检测即PCR(聚合酶链反应)，二基于蛋白的检测即LISA(酶联免疫反应)。蛋白检测灵敏、快速。但是在加工食品中蛋白易发生变性，另外，有些蛋白只在作物的某一特定组织中表达。相对于蛋白质，DNA较稳定。即使在深加工产品中如色拉油都能检测出DNA的存在。PCR十分灵敏，但一次反应只能检测一种转基因成分。随着世界范围新的转基因作物不断涌现，已有的检测技术已不能满足大量的不同品系的转基因食品检测的需要。迫切需要有新的技术和设备满足高通量和日益增加的各种基因修饰物的低成本检测。
DNA芯片技术是转基因食品检测的最有前途的领域之一。DNA芯片技术又叫Microarray技术，是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术，其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法，将大量DNA探针片段有序地固化于支持物的表面，然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交，再对杂交信号进行检测分析，能在短时间内快速、准确地获取大量信息。DNA芯片技术具有PCR方法的同样的优点。可以精确地进行基因修饰物的定性检测。不同之处在于可以在固体表面固定上千个特定的探针。能够在一次单独的分析中筛查、定性样品中的大量的不同种类的基因修饰物。此外，DNA芯片技术非常灵活，当有新的基因修饰物出现时可以在阵列中增加布点，将新的基因序列包括在筛查程序中。
英文期刊《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》于2004年11月发表了一篇关于用肽核酸做探针检测转基因大豆的芯片技术文章。但只是针对转基因大豆的管家基因和外源基因设计了五个寡肽核酸探针建立了一个芯片模型进行验证，不足以用于实际应用。
中国发明专利CN1584049A公开了用于转基因农产品检测的寡核苷酸芯片技术。但是该技术所设计的检测探针均为长度在20个碱基左右的寡核苷酸探针。而所要检测的转基因农产品的外源基因一般都在几百个碱基以上，有的在1000个碱基以上。针对一个外源基因仅用一个寡核苷酸探针去检测，不足以保证检测结果的特异性。此外，为减少芯片固相杂交时的空间位阻，该技术在寡核苷酸的5′端连了一段连接臂。为了将寡核苷酸探针固定在玻片上，还对寡核苷酸的5′端进行了化学基团的修饰。这使得芯片无法摆脱昂贵的成本费用。《AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》于2005年初发表的一篇应用DNA芯片平台技术检测5种转基因农产品的一篇文章，同样存在上述问题。

发明内容
针对现有技术的中存在的问题，本发明的一个目的是提供一种转基因农产品DNA检测芯片。
本发明的另一个目的是提供一种本发明的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法。
本发明的另一个目的是提供本发明的转基因农产品DNA检测芯片在检测转基因农产品中的应用。
本发明的另一目的是提供一种转基因农产品DNA检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种检测转基因农产品的方法。
本发明在使用官方认可的通用引物和特异性引物的同时，根据从相关数据库收集和多种途径获取的序列资料自行设计转基因大豆Round-upready、转基因玉米MON810、转基因玉米GA21、转基因玉米NK603、转基因油菜籽MS1RF1、转基因油菜籽T45和转基因大米SCK四种转基因作物的7个品系的外源基因的通用引物和特异引物进行退火温度一致性和特异性的筛选，通过大量的筛选工作建立了稳定的PCR体系。通过DNA重组技术构建含有外源基因片段的质粒，并以质粒做模板进行PCR扩增，产物经纯化制备成特异性较高的双链DNA固定探针，对各项指标进行优化后，将固定探针布点在氨基化的玻片上，制备成应用于转基因农产品检测DNA芯片。芯片与多重PCR体系扩增的Cy5标记的待测样品杂交，12个小时后通过芯片扫描仪进行扫描分析，根据杂交信号直观地判读该样品中所含有的外源目标基因情况。
因此，根据本发明的一个方面，提供一种转基因农产品DNA检测芯片，该芯片包括片基和位于片基上的核酸探针，该芯片包括片基和位于片基上的核酸探针，该核酸探针包括以下一系列检测目标基因的目标检测探针检测hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一个，检测nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一个，检测pnos的NOs10～13中的至少一个，检测nos的SEQ ID NOsl4～16中的至少一个，检测camv35s的SEQ ID NOs17～19中的至少一个，检测mdb484-mdb501的SEQ ID NO20，检测barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一个，检测barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一个，检测cpti的SEQID NOs27～30中的至少一个，检测mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一个，检测cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一个，检测cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一个，检测rbcl的SEQ ID NO41，检测lectin的SEQ ID NOs42～44中的至少一个，检测zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一个，检测napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一个。检测探针序列见表1。
表1

如SEQ ID NOs.1～50所述，本发明使用的探针多为200个核苷酸以上的长序列，这种长序列，与现有技术中只有20个核苷酸的寡核苷酸探针相比，保证了杂交的特异性，结果更为可靠。
另外，为了监控杂交反应结果，设有严格的质控。50％的DMSO(二甲基亚砜)点样液做阴性对照，非点样区做空白对照。若杂交后阴性对照点和空白对照点检测无信号，表明正常；若有信号，表明杂交失败。
为了监控杂交反应中假阴性的出现，特设立阳性对照，该阳性对照探针为一段与目标检测基因无关的核苷酸片段(例如，鼠伤寒沙门氏菌spvc基因片段，例如SEQ ID NO.51)，且与所有的固定探针的杂交条件一致，可以和其他探针一同固定在芯片上。在每次杂交检测时，将标记有Cy5的鼠伤寒沙门氏菌spvc基因片段掺比到待测目标基因中同芯片进行杂交，若杂交后检测有信号，表明正常；若无信号，表明杂交失败。
其中的管家基因(lectin、zein、napin和rbcl)检测探针可作为另一阳性对照，不仅可以监控杂交体系出现的假阴性，还可以监控杂交之前，样品经多重PCR标记体系出现的假阴性。同时还可以解释待测样品中所检出的外源基因的准确来源。因为许多农作物产品会被土壤中的细菌污染，而大多数转基因农产品中所插入的启动子和终止子是来自土壤中的细菌的，所以管家基因的信号可以准确地辨别出外源基因特别是启动子和终止子的来源。避免了假阳性结果。
为了监控杂交反应中非特异信号出现，芯片上各矩阵中的不同探针可以互为对照。经已知的样品进行验证表明杂交信号显示的检测结果准确。所述探针在芯片上的布阵没有特别的限制，可以是任意进行布阵，为了有利于检测的方便，可以将探针按检测的外源基因的不同功能进行矩阵排布，例如将检测具有相同检测功能的探针分为一个矩阵，如实施例7所述，可以将探针分为有筛选作用的A矩阵；有定性作用的B矩阵，检测管家基因的C矩阵等；当然，也可以将所述探针按照所检测的农产品的不同进行矩阵排布，例如将用于检测和鉴定同一农产品的探针放在一个矩阵中，如实施例6所示，例如可以将检测大豆的探针作为一个矩阵，将检测玉米的所有探针作为一个矩阵，当然，也可以将检测油菜的探针作为一个矩阵。
为了监控杂交结果的可靠性，每个探针在芯片上至少重复2个点，例如至少重复3个点，至少4个点，至少5个点，至少6个点，同时兼顾到经济因素和操作方便，优选重复3、4或5个点。在杂交后同一探针的所有点若信号一致，表明正常；若有的有信号，有的无信号则结果不可信，需要重新进行实验来进一步验证。
本发明的农产品包括农产品原材料及其加工食品，所述农产品原材料包括大豆、玉米、大米或油菜，以及其他含有或可能含有相关检测目标基因的农产品，包括但不限于新鲜或干燥的根、茎、叶、花、果实、种子等；所述农产品加工食品包括进行简单的机械加工获得的产品，例如由种子获得的面粉、大米、脱壳的大豆、油菜籽等，也包括进行深加工所获得的产品，例如大豆油、玉米油、菜籽油等，也包括由农产品原材料制成的食品，例如糕点、香肠等。
本发明的检测范围涵盖目前常见的转基因作物的外源目标基因camv35vs启动子、nos启动子、nos终止子、标记基因hpt、nptII、外源目标基因cp4epsps、cryIA(b)、mcp4epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作为内源参照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
另一方面，本发明提供一种转基因农产品DNA检测芯片的制备方法，该方法包括(1)根据转基因农产品的目标基因序列设计并合成聚合酶链式反应引物，这些聚合酶链式反应引物的解链温度大致相同；(2)利用(1)所述的聚合酶链式反应引物从转基因农产品的DNA中扩增目标检测探针；(3)将所述探针固定在片基上。
本发明在对芯片探针引物的设计上的独特之处在于对于筛选检测中常见的基因如启动子、终止子、抗生素抗性基因和标记基因要尽量设计通用引物，而在定性检测时所设计的引物要有很好的特异性且要尽量在目标基因的编码区内，以避免和其他探针具有同源性，从而减少检测结果的假阳性。但为了增加检测的信息量，为判断转基因作物种类或品系提供进一步的支持，可以设计连接区的一些引物，制得连接区的探针布点在芯片上，根据组合的情况对芯片的结果进行判读。另外，所有引物必须保证基本上在同一退火温度，PCR产物的长度要求比较一致，且扩增效率良好。这样对于样品的混合PCR放大、标记过程以及芯片的杂交过程中温度及其他条件的控制极为有利，同时对引物间的相互影响及扩增效率的影响降到最低。
针对以上原则，本研究在尽量使用官方认可的通用引物和特异性引物(详见表2)的同时，也根据实验需要按获取的序列资料自行设计通用引物和特异性引物(详见表3)，这些引物对尚未建立的检测目标基因是个重要的补充。在设计出的170对引物中筛选出16个基因的50对引物作为制备探针及多重PCR标记的引物。在今后芯片的实际应用中，这50对引物所表达的信息量可以基本满足目前所研究的转基因食品的检测标准。检测范围涵盖了以下目前常见的转基因作物的外源目标基因camv35S启动子、nos启动子、nos终止子、标记基因hpt、nptII、外源目标基因cp4epsps、cryIA(b)、mcp4epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作为内源参照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
经过发明人大量的实验和研究，本发明最终确定了适用于本发明的引物序列，并列表如下参考文献的引物表2


自行设计的引物表3



在本发明的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法中，优选利用聚合酶链式反应从转基因农产品的DNA中扩增目标检测探针，聚合酶链式反应的条件是本领域技术人员已知的。在本发明中提供一种优选的聚合酶链式反应，其条件为94～95℃预变性3～5min；94℃变性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；进行40个循环；72℃延伸5～10min。
将所述探针固定在片基上的方法可以采用本领域常用的点样方法。点样的方式分两种，其一为接触式点样，即点样针直接与固相支持物表面接触，将DNA样品留在固相支持物上；其二为非接触式点样，即喷点，它是以压电原理将DNA样品通过毛细管直接喷至固相支持物表面。现在已经有比较成型的点样装置出售，例如美国Biodot公司的“喷印”仪，以及Cartesian Technologies公司的Pix-Sys NQ/PA系列“打印”仪。在本发明中，优选接触式点样。为了本发明的目的，片基可以使用本领域已知的片基，优选使用氨基化的片基。
另一方面，本发明提供一种转基因农产品DNA检测芯片在检测转基因农产品中的应用。本发明的转基因农产品DNA检测芯片可以用于进行品种的检测(参见实施例4)，可以用于进行外源目标基因的检测(参见实施例5)，可以用于进行品系鉴定(参见实施例6)，并且可以用于其中的一种或一种以上的组合检测或鉴定，更为重要的是本发明提供了一种可对转基因农产品进行初步筛选、品种检测、品系鉴定一体化的DNA芯片，这对于简化程序，快速、高通量地进行转基因农产品的检测和鉴定具有重要意义。
在本发明的一个实施方式中，所述应用可以具体包括以下步骤(1)提取待测农产品的DNA；(2)利用本发明的引物对待测农产品的DNA进行PCR扩增并标记；(3)将经标记的扩增产物与本发明的转基因农产品DNA检测芯片杂交；(4)确定所述待测农产品是否为转基因农产品。在上述步骤中，可以如实施例7所述，将所述引物分成至少两个组，然后再用每个组分别进行PCR扩增并标记，这样可以减少多对引物间的干扰。对这两组引物分别标记、纯化后再混合杂交，这样既没有损失检测信息，且仍可以体现芯片的高通量的特点。此外，上述步骤中对样品进行标记的方法可以采用荧光标记方法。荧光标记方法基本分为2种，一种是使用荧光标记的引物，一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。目前常使用的荧光物质有荧光素、罗丹明、HEX、TMR、FAM、Cy3、Cy5等。根据标记的方法不同，扩增产物分离的方法也不同进行单引物标记的，其扩增产物通常由聚丙烯酰胺凝胶电泳分离；对一个引物用生物素标记，另一个引物用荧光素标记的，一般用亲合素偶联的磁珠捕捉其扩增产物，通过变性处理使荧光标记的产物解链。此外，也有用生物素残基标记引物，将生物素标记的扩增产物与芯片杂交，洗涤后加入亲合素连接的荧光物，通过生物素与亲合素的结合及靶序列与探针的结合产生荧光信号，然后利用荧光检测系统对荧光信号进行检测。在本发明的实施例中使用Cy5-dUTP进行标记，使用目前已知的荧光检测技术进行检测。本领域技术人员已知，如何根据杂交检测结果，确定是否为转基因农产品。具体可以参见实施例3、4、5、6、7。
此外，本发明还提供一种转基因农产品DNA检测试剂盒，该转基因农产品DNA检测试剂盒除了包含本发明的转基因农产品DNA检测芯片外，还可以包含如SEQ ID NOs.52～153所示的引物中的部分或全部。这些引物可以装在一个容器内，也可以分成几组，分别装在不同的容器内，或也可以均装在单独容器内。此外，该试剂盒中还可以包含用于检测或扩增的一种或多种组分。按照具体检测方法及扩增方法的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。
此外，本发明还提供一种检测转基因农产品的方法，该方法包括1)提取待测农产品的DNA；2)利用本发明的目标检测探针检测所述待测产品的DNA；3)根据所述探针与所述转基因农产品DNA的结合情况判断该待测农产品是否为转基因农产品。
提取待测农产品的DNA方法可以是一类适合本检测所需的任何提取方法，本领域的技术人员可以根据农产品的类型选择合适的提取方法。在该方法中可以将所述目标检测探针固定在片基上，制成本发明的转基因农产品DNA检测芯片，然后再进行检测；也可以不固定在片基上，直接进行检测。
本发明的优点和效果转基因农产品检测DNA芯片是以DNA芯片为平台建立起的用以检测转产品中外源插入基因的新技术。区别于普通PCR一次只能检测一个基因，DNA芯片能够在高通量地检测样品中的大量的不同种类的基因修饰物。和多重PCR相比DNA芯片的杂交检测更灵敏，结果判读更准确。
更为重要的是，本发明使用的探针多为200个核苷酸以上的长序列，这种长序列，与只有20个核苷酸的寡核苷酸探针相比，保证了杂交的特异性，结果更为可靠。且本发明是通过重组DNA技术构建质粒做模板和PCR扩增技术制备的检测探针，由于不存在寡核苷酸探针与玻片间的空间位阻的问题，所以不用对探针再做任何化学修饰，降低了芯片制备的成本，有利于未来的产业化发展。
DNA芯片的探针对引物的要求较高，即除了要遵循引物设计的一般原则外，还要使引物退火温度尽量保持一致，扩增片段的长度尽量一致，各引物间减少互补序列，这增加了引物设计和筛选的难度。本发明通过大量的实验，筛选出的50对高特异性引物PCR扩增效率较高、扩增的探针同源性较低，用此50对引物进行PCR扩增来制备本芯片的探针可以满足检测转基因食品的初步筛查、品种检测、品系鉴定不同层次的要求。例如camv35s启动子、nos终止子、nos启动子、hpt探针、nptII位置处出现阳性信号可以提示检测的食品可疑为转基因食品。管家基因lectin，zein和napin以及rbcl探针的信号可以帮助我们知道该转基因食品是否是来自大豆、玉米、油菜籽、大米或是其它含有或可能含有相关检测目标基因的农产品。从外源结构基因cp4epsps，cryIA(b)，mcp4epsps，cpti，barstar和barnase，mdb484-mdb501探针的信号可以知道该转基因食品具有抗除草剂、抗虫或雄性不育等特性的哪种品性。综合芯片上所有提供的多种信息可以进一步鉴别转基因食品的品系，知道该转基因食品是哪个公司市售的，含有哪些外源插入基因，便于管理部门对其示踪管理。
另外，由于本发明的探针固定在同一片基上，可以通过一次的杂交反应同时获取多种信息。对比目前的PCR技术进行的初筛、定性等分步检测，具有高通量，快速的优势。
应用结果显示本发明转基因食品DNA检测芯片可以对上述7种转基因作物的多个目标基因进行识别检测，具有较高的特异性和较好的重复性。严格的质控点保证了芯片结果判读的准确，也是本发明的一大优点。
SCK水稻是中国科学院遗传与生物发育研究所研制的拥有自主知识产权的转基因抗虫水稻。插入了表达豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI)、潮霉素磷酸转移酶(HPT)等的外源基因。本研究以SCK水稻加工后产品SCK大米的S86品系为研究对象，首次建立了S86的芯片检测方法，经过验证，检测结果具有很好的准确性、特异性和重复性。为具有我国特色并有产业化前景的转基因水稻提供了安全性研究的基础资料并建立了cpti和hpt的基因标识方法。


图1为本发明的芯片制作流程图；图2和图3为本发明的芯片对品种检测的结果。图2为玉米；图3为油菜籽；图中符号1.rbcl，2.zein，3.lectin，4.napin；图中四个角的阳性信号是定位的marker；图4-图7为本发明芯片对外源目标基因进行检测的结果，其中，图4为转基因大米S86；图5为转基因大米S86阴性对照样品；图6为转基因Ms1Rf1油菜籽；图7为转基因油菜籽阴性对照样品；图中符号1.barnase，2.mdb484-mdb501，3.cryIA(b)，4.mcp4epsps，5.cp4epsps，6.cpti；图中四个角的阳性信号是定位的marker；图8-图11为本发明的芯片进行品系鉴定检测结果，其中，图8为转基因大豆RRS40-3-2品系，图8中符号1.lectin，2.camv35s，3.nos，4.cp4epsps；图9为转基因玉米GA21；图10为转基因大米S86；图9、图10中符号1.zein，2.camv35s，3.nos，4.mcp4epsps，5.rbcl，6.cpti，7.hpt；图11为转基因玉米MON810，图11中符号1.zein，2.camv35s，3.nos，4.mcp4epsps，5.cryIA(b)，6.cp4epsps，7.lectin；图12-图15为本发明一体化DNA检测芯片的示意图和检测结果，其中图12为转基因大豆RRS40-3-2的检测结果示意图；图13为转基因大豆RRS40-3-2的检测结果扫描图；图14为油菜籽MS1RF1的检测结果示意图；图15为油菜籽MS1RF1的检测结果扫描图。图12～图15中符号1.Hpt，2.nptII，3.pnos，4.nos，5.35s1，6.35s2，7.mdb501-484，8.barstar，9.barnase，10.cpti，11.mcp4epsps，12.cryIA(b)，13.cp4epsps，14.50％DMSO(阴性对照)，15.spvc(阳性对照)，16.rbcl，17.napin，18.zein，19.lectin。
具体实施例方式
实施例1、转基因农产品检测芯片的制备1、转基因农产品基因组DNA的提取(CTAB法和硅胶柱纯化法)转基因农产品样品和来源转基因大豆40-3-2、转基因玉米MON810、GA21、NK603的阳性和阴性样品由Monsanto公司提供。转基因油菜籽Ms1Rf1和T45的阳性和阴性样品由Bayer公司提供。转基因大米SCK的S86阳性和阴性样品由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。
十六烷基三甲基铵硝酸盐(CTAB)抽提缓冲液配制方法20g/l CTAB，4.0g；4M NaCl，16.4g；0.1M Tris-HCl，3.15g；20mM乙二胺四乙酸钠(Na2EDTA)，1.5g；加100ml无菌去离子水，用1M NaOH调PH至8.0，最后定容到200ml高压灭菌4℃保存6个月。
CTAB沉淀缓冲液配制方法5g/l CTAB，1g；0.04M NaCl，0.5g；加100ml无菌去离子水，用1M NaOH调PH至8.0，最后定容到200ml高压灭菌4℃保存6个月。
操作步骤(1)把样品在陶瓷研钵中轻轻研碎，加入液氮继续研磨成细粉。
(2)用药匙舀取约100mg研磨好的样品粉末转入灭菌的1.5ml离心管中，加入500～800μlCTAB提取缓冲液混匀。加入20μl蛋白酶K(Promega，20mg/ml)混匀，65℃水浴30～90min。每隔10min搅拌1次。
(3)加入20μl/RNA酶(10mg/mL)混匀，65℃水浴5～10min。
(4)16,000rpm离心10min。离心后将上清转移至1.5ml离心管中。
(5)向管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，轻轻混匀后16000rpm离心10min。离心后将上清转移至1.5ml离心管中。
(6)向管中加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀后16000rpm离心5min。离心后将上清转移至1.5ml离心管中。
(7)重复步骤(6)一次。
(8)加2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，轻轻混匀后，室温静置60min。
(9)16,000rpm离心5min，弃上清。加入350μl 1.2M NaCl溶液溶解。
(10)加入350μl氯仿，轻轻混匀30秒，16000rpm离心10min。
离心后将上清转移至1.5ml离心管中。
(11)向离心管中加入1/10体积的NaAc(3M)混匀，再加入2倍体积的冰无水乙醇，-20℃放置30min。
(12)16000rpm离心5min，弃上清。加入300ml 70％乙醇16000rpm离心5min，弃上清。
(13)干燥离心管，向管中加入100μl无菌去离子水溶解DNA。
(14)用细胞基因组clean-up试剂盒(Promega公司)纯化(操作步骤见试剂盒使用说明书)。
(15)纯化过的DNA样品置于-20℃或更低温度环境保存备用。
取2μl制备的DNA在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，检测提取基因组DNA的质量和含量。
2.检测探针的制备将上述实施例1的转基因农产品基因组DNA作为模板，采用表2和表3的相应引物(由北京赛百盛基因技术有限公司、上海生工生物工程有限公司和北京奥科生物技术有限责任公司合成)进行PCR扩增(TaqDNA聚合酶，购于北京博大泰克生物基因技术有限责任公司)，将获得的产物切胶回收后重组到PMD-18T(Takara宝生物工程(大连)有限公司)载体上，转化到大肠杆菌DH5α中。提取大肠杆菌的质粒，再以稀释的质粒做模板进行PCR扩增，得到产物纯化后做为固定探针布点在芯片上。
操作步骤(1)、PCR反应扩增外源目标基因片段PCR反应体系20μlPCR缓冲液，2.0μl；引物(上、下游各5μM)，1.6～2.0μl；dNTP(10mM)，0.4μl；模板DNA(上述某一种转基因农产品基因组DNA)，1.0～2.0μl；Taq(5U/μl)，0.1～0.2μl；去离子水补齐至20μl。
PCR反应条件94～95℃预变性3～5min；94℃变性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；进行40个循环；72℃延伸5～10min。
PCR产物的检测扩增完毕后，取2.0μl反应液与0.4μl6×溴酚蓝缓冲液混合，在2％琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)中电泳，用读胶仪观察结果并照相。
对所要目的片段进行切胶回收(切胶回收试剂盒购于QIAGEN公司)纯化。
(2)、CaCl2法制备感受态大肠杆菌。操作步骤见《分子克隆实验指南》(第三版)。
(3)、构建含有该DNA序列的重组质粒。操作步骤见《分子克隆实验指南》(第三版)。
(4)、抽提质粒。操作步骤见《分子克隆实验指南》(第三版)。
(5)、将所抽提质粒稀释1000倍后用做模板进行PCR反应制备固定探针。
PCR反应体系20μlPCR缓冲液，2.0μl；引物(上下游引物各5μM)，1.6～2.0μl；dNTP(10mM)，0.4μl；模板DNA(质粒)，0.4～1.0μl；Taq(5U/μl)，0.1～0.2μl；去离子，补齐至20μl。
PCR反应条件同步骤(1)。
(6)、检测探针的纯化和定量乙醇沉淀法纯化检测探针，具体操作如下(a)取200μl PCR反应液，加400μl无水乙醇及20μl乙酸钠(终浓度为0.3mol/L)，-20℃1小时。
(b)4℃12,000rpm离心10min，弃上清。
(c)70％乙醇，4℃12,000rpm离心2min，弃上清。
(d)37℃干燥后，溶于10μl无菌去离子水中。
(e)取1μl溶液2％琼脂糖凝胶电泳，检验探针质量。
(f)取2μl溶液稀释到50μl在紫外分光光度计下测定探针浓度。
(g)用无菌去离子水将探针浓度稀释到500～1000ng/μl。
(h)加入等体积的100％DMSO溶液(100％DMSO为点样液)混匀后-20℃保存备用。
3.检测探针在氨基化玻片上的固定操作步骤(1)将固定探针放入384孔板中，每孔5μl，浓度为250～500ng/μl。
(2)将384孔板及硅烷化好的玻片(氨基化玻璃片(购于上海百奥公司))放在指定位置。
(3)设置点样程序用点样仪(Perkin Elmer公司，美国)点样。
(4)点样后处理湿化50～60℃蒸汽湿化30～50s；干烤80℃1小时；紫外交联将玻片上打印有DNA的面朝上，紫外释放能量为250mJ，将DNA固定在玻片上；2％十六烷基磺酸钠(SDS)洗2～10min。超纯水(Ω≥17兆欧)冲洗2～10min；变性90℃水中煮1～5min，立即浸入冰无水乙醇中3min；晾干待杂交。
(5)矩阵排列在湿化的过程中可以显现，由此可通过肉眼判断芯片是否有漏点的情况。将芯片和标准参考物质或已知转基因成分的样品杂交后，可通过阳性参照、阴性参照和空白参照等质控的结果及检测结果判断，如果结果符合预期则表明芯片已制备成功。
实施例2、待测样品的制备1、待测样品基因组DNA提取方法方法参见实施例1中“转基因农产品基因组DNA的提取方法”。
2、待测样品的标记(多重PCR荧光素标记)25μl体积PCR缓冲液，2.5μl；Primer(混合引物)表2和3所列的混合引物浓度和混合比例见下面具体实施例)；dNTP(10mM，无dTTP)，0.5μl；Cy5-dUTP(1mM)(Pharmacia公司)，0.5μl；dTTP(1mM)，2.0μl；模板DNA(上述待测样品的基因组DNA)，1.0～2.0μl；Taq(5U/μl)，0.3～0.5μl；dH2O，补齐至25μl。
PCR反应条件同实施例1。
实施例3、待测产品的检测1、玻片的杂交和洗涤操作步骤(1)将玻片放置在杂交仓内。
(2)将装有标记探针的微离心管加热变性100℃沸水煮3min。
(3)向管中加入100μl高效杂交液(鼎国公司)，吹打混匀后注入杂交仓。42℃杂交12～18小时。
(4)12～18小时后将玻片取出，放入洗膜I液(2×SSC、0.1％SDS)中洗涤2min。
(5)洗膜II液(0.1×SSC、0.1％SDS)洗涤2min。
(6)无菌高纯水洗涤2min，晾干待扫描。
2、扫描仪下观察杂交结果检测结果根据扫描仪(Perkin Elmer公司，美国)读取的信号进行判断。在扣除背景信号的基础上阳性信号判定为阳性，阴性信号判定为阴性。
实施例4、管家基因DNA检测芯片方法按照实施例1、2、3的方法制备转基因检测芯片、制备待测样品以及进行检测。其中以转基因大豆特异性管家基因lectin的414bp基因片段(SEQ ID NO.42)、转基因玉米特异性管家基因zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)、转基因油菜籽特异性管家基因napin的325bp基因片段(SEQ ID NO.50)，真核植物特异性管家基因rbcl的433bp基因片段(SEQ ID NO.41)为探针(浓度为250～500ng/μl)制备芯片。所述探针的排布如下表4所示表4、管家基因检测矩阵探针排布

①rbcl②zein③lectin④napin⑤marker
多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(体系参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；其中引物为混合引物12.5μM用于检测rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，各0.1μl；用于检测lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各0.1μl；用于检测zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各0.1μl；用于检测napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，各0.1μl。模板DNA为待测农产品DNA；扩增条件等同样见实施例1。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
利用该芯片检测转基因玉米NK603，检测结果表明转基因玉米NK603的管家基因zein和rbcl的杂交信号为阳性而转基因大豆和转基因油菜籽的管家基因信号为阴性；与预期结果一致，见图2。对转基因油菜籽T45的检测结果表明转基因油菜籽的管家基因napin和rbcl的杂交信号为阳性而转基因大豆和转基因玉米的管家信号为阴性；与预期结果一致，见图3。管家基因通常在转基因食品检测时起内源参照作用。用以检测样品DNA的抽提质量及作为芯片系统的杂交体系的阳性对照。特别是当检测芯片在实际应用中检测混合样品或不知作物来源的样品时尤为重要，其可对样品的种类进行鉴定。
实施例5、外源目标基因DNA检测芯片方法按照实施例1、2、3的方法制备外源目标基因DNA检测芯片、制备待测样品以及进行检测。其中通过筛选出转基因油菜籽Ms1Rf1的barnase基因的213bp基因片段(SEQID NO.25)，转基因油菜籽T45的mdb484-mdb501基因的220bp基因片段(SEQ ID NO.20)，转基因玉米MON810的cryIA(b)基因的354bp基因片段(SEQ ID NO.37)，转基因玉米GA21的mcp4epsps基因的236bp基因片段(SEQ ID NO.32)，转基因玉米NK603和转基因大豆共有的cp4epsps基因的294bp基因片段(SEQ ID NO.38)，转基因大米S86的cpti基因的209bp基因片段为探针(SEQ ID NO.29)(浓度为250～500ng/μl)制备芯片。所述探针的排布如下所示表5、外源目标基因检测芯片矩阵探针排布

①barnase②mdb484-mdb501③crylA(b)④mcp4epsps⑤cp4epsps⑥cpti⑦marker多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(请参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；其中的引物为混合引物12.5μM用于扩增barnase的引物(SEQ ID NO.136和137)，各0.1μl；用于扩增mdb484-mdb501的引物(SEQ ID NO.64和65)，各0.1μl；用于扩增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，各0.1μl；用于扩增mcp4epsps的引物(SEQID NO.114和115)，各0.1μl；用于扩增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各0.1μl；用于扩增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，各0.1μl。模板DNA为待测农产品DNA；扩增条件等同样见实施例1。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
结果本芯片对转基因大米S86的检测结果表明只有转基因大米S86外源结构基因cpti的杂交信号为阳性而其他作物的外源结构基因的杂交信号为阴性，见图4。同时对转基因大米S86阴性对照样品的检测显示外源结构基因cpti未检出，见图5。本芯片转基因油菜籽Ms1Rf1的外源结构基因的检测结果表明只有外源基因barnase的杂交信号阳性而其他作物的外源结构基因的杂交信号为阴性，见图6。同时对转基因油菜籽Ms1Rf1阴性对照样品的检测显示外源结构基因barnase未检出，见图7。在转基因食品定性检测中最重要的检测目标基因是外源结构基因，即引入某一转基因作物中编码蛋白使转基因作物具有抗除草剂或抗虫等新的性状的基因。
实施例6、品系鉴定芯片1)转基因大豆RRS40-3-2品系方法按照实施例1、2、3的方法制备转基因检测芯片、制备待测样品以及进行检测。其中通过筛选出的camv35s启动子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos终止子的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，cp4epsps的294bp基因片段(SEQ ID NO.38)为探针(浓度为250～500ng/μl)对转基因大豆40-3-2进行检测。同时以大豆管家基因lectin的414bp基因片段(SEQ ID NO.42)为内源参照。排布如下表6所示表6、转基因大豆RRS品系

①lectin②camv35s③nos④cp4epsps多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(请参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；其中的引物为混合引物2μM用于扩增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各1.0μl；用于扩增camv35s①(SEQ ID NO.58和59)的引物，各1.0μl；用于扩增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，各1.0μl；用于扩增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各1.0μl。模板DNA为待测农产品DNA；扩增条件等同样见实施例1。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
结果表明，本芯片可以从Roundup Ready转基因大豆40-3-2(RRS)中检测到camv35s启动子、nos终止子、cp4epsps和大豆管家基因lectin。与预期结果一致。杂交结果见图8。
2)转基因玉米GA21检测芯片矩阵A和转基因大米S86检测芯片矩阵B探针排布方法按照实施例1、2、3的方法制备转基因检测芯片、制备待测样品以及进行检测。其中，通过筛选出的camv35s启动子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，外源结构基因mcp4epsps的引物mcp4epsps扩增的236bp基因片段(SEQ ID NO.32)为探针(浓度为250～500ng/μl)对转基因玉米GA21进行检测；同时以玉米管家zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)为内源参照。在本芯片中，也将检测转基因大米S86的探针(250～500ng/μl)同时在此一并研究即将外源结构基因cpti的209bp基因片段(SEQ ID NO.29)，抗生素标记基因hpt的215bp基因片段(SEQ ID NO.2)及管家基因rbcl的433bp基因片段(SEQ ID NO.41)也布点在芯片上，和检测GA21玉米的探针互为参照，相互验证探针的特异性。所述探针的排布如下表7所示表7

①点样液50％DMSO②zein③camv35s④nos⑤mcp4epsps⑥rbcl⑦cpti⑧hpt⑨marker多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(请参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；引物为混合引物2μM用于扩增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各1.0μl；用于扩增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，各1.0μl；用于扩增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，各1.0μl；用于扩增mcp4epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，各1.0μl。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
结果本芯片可以从转基因玉米GA21中检测到nos终止子、mcp4epsps和玉米管家基因zein，这与转基因玉米GA21的预期结果一致；而互为对照的SCK的探针的杂交信号则为阴性，说明检测GA21的探针具有很好的特异性。见图9。
多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(请参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；其中的引物为混合引物2μM用于扩增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，1.0μl；用于扩增rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，1.0μl；用于扩增hpt的引物(SEQ ID NO.92和93)，1.0μl。模板DNA为待测农产品DNA；扩增条件等同样见实施例1。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
从转基因大米S86中可以检测到cpti、hpf和管家基因rbcl，这与转基因大米S86的预期结果一致；而互为对照的GA21的探针的杂交信号则为阴性，说明检测S86的探针具有很好的特异性。见图10。
3)转基因玉米MON810检测芯片矩阵探针排布方法按照实施例1、2、3的方法制备转基因检测芯片、制备待测样品以及进行检测。其中，通过筛选出的camv35x启动子的195bp基因片段(SEQ ID NO.18)，nos终止子的213bp基因片段(SEQ ID NO.14)，外源结构基因cryIA(b)的引物cryIA(b)的354bp基因片段(SEQ ID NO.37)为探针(浓度为250～500ng/μl)，对转基因玉米MON810进行检测；同时以玉米管家zein的引物zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46)为内源参照。与此同时，将检测转基因玉米GA21探针(同上)，转基因玉米NK603探针(包括camv35s启动子的195bp基因片段、nos终止子的213bp基因片段，外源结构基因cp4epsps的294bp基因片段(SE9 ID NO.38)和玉米管家zein的引物zein的277bp基因片段(SEQ ID NO.46))和转基因大豆40-3-2的探针(同上)布点在芯片上，和检测MON810玉米的探针互为参照，相互验证探针的特异性。所述探针的排布见表8。
表8A矩阵GA21玉米 B矩阵MON810玉米


C矩阵NK603玉米 D矩阵40-3-2大豆


①点样液50％DMSO②zein③camv35s④nos⑤mcp4epsps⑥marker⑦cryIA(b)⑧cp4epsps⑨lectin
多重PCR荧光素标记样品PCR反应体系25μl(参见实施例2中的“待测样品的标记”部分)；其中引物为混合引物2μM用于扩增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，各1.0μl；用于扩增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，各1.0μl；用于扩增nos的引物(SEQID NO.52和53)，各1.0μl；用于扩增m cp4epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，各1.0μl；用于扩增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，1.0μl；用于扩增cp4epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，各1.0μl；用于扩增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，各1.0μl。模板DNA为待测农产品DNA；扩增条件等同样见实施例1。
样品经多重PCR扩增标记、纯化后与芯片杂交。
结果表明，本芯片可以从转基因玉米MON810中检测到camv35s启动子、nos终止子、cryIA(b)和玉米管家基因zein。而互为对照的矩阵中的相同探针杂交信号阳性，不同探针的杂交信号阴性，说明各检测探针有很好的特异性。见图11。
实施例7、一体化DNA检测芯片方法按照实施例1、2、3的方法制备转基因检测芯片、制备待测样品以及进行检测。芯片上的所布探针序列见表1。探针是按外源基因的不同功能进行矩阵排布。见表9。有筛选作用的A矩阵，主要是检测转基因农产品的启动子、终止子和标志基因。有定性作用的B矩阵，来确定该作物的主要性征。C矩阵主要是些管家基因用来区分物种的种属，可以确定外源基因的来源。同时还有严格的质控矩阵。50％的DMSO点样液做阴性对照，鼠伤寒沙门氏菌spvc做阳性对照，非点样区做空白对照。各矩阵中的不同探针可以互为对照。检测范围含盖了以下目前常见的转基因农产品的外源目标基因camv35S启动子、nos启动子、nos终止子、标记基因hpt、nptII、外源目标基因cp4 epsps、crylA(b)、mcp4 epsps、cpti、barnase、barstar、mdb484-mdb501和作为内源参照基因的管家基因lectin、zein、napin和rbcl。
表9、转基因农产品DNA检测芯片矩阵设计
1)转基因大豆Roundup Ready 40-3-2的检测多重PCR荧光素标记体系中上、下游混合引物对比例、体系见实施例2。
引物1(各引物浓度均为2μM)用于扩增camv35s(SEQ ID NO.58和59)的引物，1.5μl；用于扩增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，1.0μl；用于扩增cp4 epsps的引物(SEQ IDNO.106和107)，1.5μl；用与扩增rbcl的引物(SEQ ID NO.66和67)，0.5μl；用于扩增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，0.5μl。
引物2(各引物浓度均为5μM)用于扩增pnos的引物(SEQ ID NO.98和99)，0.5μl；用于扩增camv35s(SEQ ID NO.60和61)的引物，0.5μl；用于扩增hpt的引物(SEQ IDNO.92和93)，0.5μl；用于扩增nptII的引物(SEQ ID NO.82和83)，0.5μl；用于扩增barstar的引物(SEQ ID NO.142和143)，0.5μl；用于扩增barnase(SEQ ID NO.136和137)的引物，0.5μl；用于扩增mcp4 epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，0.5μl；用于扩增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，0.5μl；用于扩增mdb501-mdb484的引物(SEQ ID NO.64和65)，0.5μl；用于扩增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，0.5μl；用于扩增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，0.5μl；用于扩增napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，0.5μl。
阳性对照spvcPCR扩增荧光素标记25μl体系PCR buffer，2.5μl；用于扩增spvc的引物(SEQ ID NO.152和153)(上、下游混合引物5μM)，2.5μl；dNTP(10mM，无dTTP)，0.5μl；Cy5-dUTP(1mM)，0.5μl；dTTP(1mM)，2.0μl；模板DNA(鼠伤寒沙门氏菌STM)，0.5μl；Taq(5U/μl)，0.5μl；dH2O，16μl。
引物1和引物2为17对引物拆分成两组的引物对混合体系。目的是减少多对引物间的干扰。本发明是对这两组引物分别标记、纯化后再混合杂交，这样既没有损失检测信息，且仍可以体现芯片的高通量的特点。同理spvc阳性参照探针是单引物对荧光素标记、纯化后以1/5的比例掺混到已标记好的待测样品中起阳性对照作用。实施例7的步骤2)也是相同方法。
结果显示A2矩阵中有camv35s①、camv35s②和nos 3个检测探针出现阳性信号，表明有camv35s启动子基因和nos终止子基因的存在。可以初步判断待测样品是转基因样品。B2矩阵中只有cp4 epsps 1个检探针出现阳性信号，表明此转基因样品是具有抗草苷磷除草剂性状的转基因样品。C2矩阵中只有rbcl和lectin 2个探针出现阳性信号，由此可以判断外源基因片段来自真核植物大豆，而非其它物种。C1矩阵的阳性对照探针出现阳性信号，阴性对照探针显示的是阴性信号。空白处均无信号。说明多重PCR体系，杂交体系结果可靠。综合所有矩阵的结果可以判断待测样品是转基因大豆Roundup Ready 40-3-2。结果示意图，见图12。结果扫描图，见图13。
2)MS1RF1油菜籽的检测多重PCR荧光素标记体系中上、下游混合引物对比例、体系见实施例2。
引物1(各引物浓度均为5μM)用于扩增camv35s的引物(SEQ ID NO.58和59)，0.4μl；用于扩增nos的引物(SEQ ID NO.52和53)，0.4μl；用于扩增pnos的引物(SEQ ID NO.98和99)，0.5μl；用于扩增nptII的引物(SEQ ID NO.82和83)，0.4μl；用于扩增barstar的引物SEQ ID NO.142和143)，0.5μl；用于扩增barnase的引物SEQ ID NO.136和137)，0.5μl；用于扩增napin的引物(SEQ ID NO.146和147)，0.2μl；用于扩增rbcl的引物(SEQID NO.66和67)，0.2μl。
引物2(各引物浓度均为5μM)用于扩增camv35s②的引物(SEQ ID NO.60和61)，0.5μl；用于扩增hpt的引物(SEQ ID NO.92和93)，0.5μl；用于扩增cp4 epsps的引物(SEQ ID NO.106和107)，0.5μl；用于扩增mcp4 epsps的引物(SEQ ID NO.114和115)，0.5μl；用于扩增cryIA(b)的引物(SEQ ID NO.124和125)，0.5μl；用于扩增mdb501-mdb484的引物SEQ ID NO.64和65)，0.5μl；用于扩增cpti的引物(SEQ ID NO.130和131)，0.5μl；用于扩增zein的引物(SEQ ID NO.76和77)，0.5μl；用于扩增lectin的引物(SEQ ID NO.68和69)，0.5μl。
方法和操作步骤见实施例1、2、3和7的步骤1。
结果显示A2矩阵中有camv35s①、camv35s②、nos和pnos 4个检测探针出现阳性信号，表明有camv35s启动子基因、nos终止子基因和nos启动子的存在。可以初步判断待测样品是转基因样品。B1矩阵中只有barstar 1个检探针出现阳性信号，表明此转基因样品是具有育性恢复性状的转基因样品。C2矩阵中只有rbcl和napin 2个探针出现阳性信号，由此可以判断外源基因片段来自真核植物油菜，而非其它物种。C1矩阵的阳性对照探针出现阳性信号，阴性对照探针显示的是阴性信号。空白处均无信号。说明多重PCR体系，杂交体系结果可靠。综合所有矩阵的结果可以判断待测样品是转基因油菜籽MS1RF1。结果示意图，见图14。结果扫描图，见图15。
序列表<110>中国疾病预防控制中心营养与食品安全所<120>转基因农产品DNA检测芯片及其制备方法和应用<130>GBI05CN0369<160>153<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>283<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>1tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca 60ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga agtgcttgac attggggagt ttagcgagag 120cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac 180cgaactgccc gctgttctac aaccggtcgc ggaggctatg gatgcgatcg ctgcggccga 240tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt cggaccgcaa gga283<210>2<211>215<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>2cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 60ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 120tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 180atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacat 215<210>3<211>488<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>3cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 60ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 120caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat 180gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 240atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 300cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 360ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 420tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 480atgttcgg 488
<210>4<211>441<212>DNA<213>未知<220>
<223>潮霉素抗性基因<400>4acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg 60actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg 120acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat 180acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc 240gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc acgactccgg gcgtatatgc 300tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag 360cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta 420cacaaatcgc ccgcagaagc g441<210>5<211>486<212>DNA<213>大肠杆菌E.coli<400>5ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 60cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 120aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 180acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 240gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 300gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 360agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 420tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 480tcagtg 486<210>6<211>364<212>DNA<213>大肠杆菌E.coli<400>6ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 60cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 120ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 180tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 240cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 300gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 360cacc 364<210>7<211>489<212>DNA<213>大肠杆菌E.coli<400>7ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 60cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 120
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<213>花椰菜花叶病毒<400>17ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 60ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 120acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat at 162<210>18<211>195<212>DNA<213>花椰菜花叶病毒<400>18gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cattcaagat ctctctgccg 60acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc 120caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgacatctc cactgacgta agggatgacg 180cacaatccca ctatc 195<210>19<211>239<212>DNA<213>花椰菜花叶病毒<400>19ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa aaggaaggtg gcacctacaa 60atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat gcctctgccg acagtggtcc 120caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc caaccacgtc 180ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg cacaatccc 239<210>20<211>220<212>DNA<213>油菜籽<400>20gtggatatac aacacgtgac tgtattccat atgagtaaac tatatgtaaa accaagcttg 60aattcgagct cggtacccct ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag 120tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac 180cctataagaa ccctaattcc cttatctggg aactactcac220<210>21<211>224<212>DNA<213>淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamylolique faciens)<400>21tcagcgacct ccaccagaca ttgaaaaagg agcttgccct tccggaatac tacggtgaaa 60acctggacgc tttatgggat tgtctgaccg gatgggtgga gtacccgctc gttttggaat 120ggaggcagtt tgaacaaagc aagcagctga ctgaaaatgg cgccgagagt gtgcttcagg 180ttttccgtga agcgaaagcg gaaggctgcg acatcaccat cata 224<210>22<211>216<212>DNA<213>淀粉液化芽孢杆菌<400>22
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<210>32<211>236<212>DNA<213>玉米<400>32acgacttctc cacccttccc agcaacggtg gaagagttca atgtatgcag gtgtggccgg 60cctacggcaa caagaagttc gagacgctgt cgtacctgcc gccgctgtct atggcgccca 120ccgtgatgat ggcctcgtcg gccaccgccg tcgctccgtt ccaggggctc aagtccaccg 180ccagcctccc cgtcgcccgc cgctcctcca gaagcctcgg caacgtcagc aacggc 236<210>33<211>335<212>DNA<213>玉米<400>33cttggtagtt tgggtgggcg agaggcggct tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg 60ggcgggatct cgcggctggg gctctcgccg gcgtggatcc ggcccggatc tcgcggggaa 120tggggctctc ggatgtagat ctgcgatccg ccgttgttgg gggagatgat ggggggttta 180aaatttccgc catgctaaac aagatcagga agaggggaaa agggcactat ggtttatatt 240tttatatatt tctgctgctt cgtcaggctt agatgtgcta gatctttctt tcttcttttt 300gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatc 335<210>34<211>378<212>DNA<213>玉米<400>34cttggtagtt tgggtgggcg agaggcggct tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg 60ggcgggatct cgcggctggg gctctcgccg gcgtggatcc ggcccggatc tcgcggggaa 120tggggctctc ggatgtagat ctgcgatccg ccgttgttgg gggagatgat ggggggttta 180aaatttccgc catgctaaac aagatcagga agaggggaaa agggcactat ggtttatatt 240tttatatatt tctgctgctt cgtcaggctt agatgtgcta gatctttctt tcttcttttt 300gtgggtagaa tttgaatccc tcagcattgt tcatcggtag tttttctttt catgatttgt 360gacaaatgca gcctcgtg378<210>35<211>488<212>DNA<213>苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)<400>35tcgtccgtga gcatcatcag agctcctatg ttctcctgga ttcatcgcag cgcggagttc 60aacaatatca ttccgtcctc ccaaatcacc caaatccccc tcaccaagtc caccaacctg 120ggcagcggca cctccgtggt gaagggccca ggcttcacgg gcggcgacat cctgcgcagg 180acctccccgg gccagatcag caccctccgc gtcaacatca ccgctcccct gtcccagagg 240taccgcgtca ggattcgcta cgctagcacc accaacctgc aattccacac ctccatcgac 300ggcaggccga tcaatcaggg taacttctcc gccaccatgt ccagcggcag caacctccaa 360tccggcagct tccgcaccgt gggtttcacc acccccttca acttctccaa cggctccagc 420gttttcaccc tgagcgccca cgtgttcaat tccggcaatg aggtgtacat tgaccgcatt 480gagttcgt 488<210>36<211>473
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tacaactcaa taaggttgac gaaaacggca ccccaaaacc ctcgtctctt ggtcgcgccc 120tctactccac ccccatccac atttgggaca aagaaaccgg tagcgttgcc agcttcgccg 180cttccttcaa cttcaccttc tatgcccctg acacaaaaag gcttgcagat gggcttgcct 240tctttctcgc accaattgac actaagccac aaacacatgc aggttatctt ggtcttttca 300acgaaaacga gtctggtgat caagtcgtcg ctgttgagtt tgacactt 348<210>45<211>485<212>DNA<213>玉米<400>45gcttgcattg ttcgctctcc tagctctttg tgcaagcgcc actagtgcga cccatattcc 60agggcacttg ccaccagtca tgccattggg taccatgaac ccatgcatgc agtactgcat 120gatgcaacag gggcttgcca gcttgatggc gtgtccgtcc ctgatgctgc agcaactgtt 180ggccttaccg cttcagacga tgccagtgat gatgccacag atgatgacgc ctaacatgat 240gtcaccattg atgatgccga gcatgatgtc accaatggtc ttgccgagca tgatgtcgca 300aataatgatg ccacaatgtc actgcgacgc cgtctcgcag attatgctgc aacagcagtt 360accattcatg ttcaacccaa tggccatgac gattccaccc atgttcttac agcaaccctt 420tgttggtgct gcattctaga tagaaatatt tgtgttgtat cgaataatga gttgacatgc 480catcg 485<210>46<211>277<212>DNA<213>玉米<400>46agtgcgaccc atattccagg gcacttgcca ccagtcatgc cattgggtac catgaaccca 60tgcatgcagt actgcatgat gcaacagggg cttgccagct tgatggcgtg tccgtccctg 120atgctgcagc aactgttggc cttaccgctt cagacgatgc cagtgatgat gccacagatg 180atgacgccta acatgatgtc accattgatg atgccgagca tgatgtcacc aatggtcttg 240ccgagcatga tgtcgcaaat aatgatgcca caatgtc 277<210>47<211>329<212>DNA<213>玉米<400>47tgcttgcatt gttcgctctc ctagctcttt gtgcaagcgc cactagtgcg acccatattc 60cagggcactt gccaccagtc atgccattgg gtaccatgaa cccatgcatg cagtactgca 120tgatgcaaca ggggcttgcc agcttgatgg cgtgtccgtc cctgatgctg cagcaactgt 180tggccttacc gcttcagacg atgccagtga tgatgccaca gatgatgacg cctaacatga 240tgtcaccatt gatgatgccg agcatgatgt caccaatggt cttgccgagc atgatgtcgc 300aaataatgat gccacaatgt cactgcgac329<210>48<211>369<212>DNA<213>油菜<400>48ctcgccttgt tcttccttct caccaatgcc tccgtctaca ggacggttgt ggaagtcgac 60gaagacgatg ccacaaatcc agccggccca tttaggattc caaaatgtag aaaggagttt 120cagcaagcac aacacctaag agcttgccaa caatggctcc acaagcaggc aatgcagccc 180ggtggtggta gtggtccaag ctggactctc gacggtgagt ttgattttga agacgacgtg 240
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权利要求
1. 一种转基因农产品DNA检测芯片，该芯片包括片基和位于片基上的核酸探针，该核酸探针包括以下一系列检测目标基因的目标检测探针检测hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一个，检测nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一个，检测pnos的NOs10～13中的至少一个，检测nos的SEQ ID NOs14～16中的至少一个，检测camv35s的SEQID NOs17～19中的至少一个，检测mdb484-mdb501的SEQ ID NO20，检测barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一个，检测barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一个，检测cpti的SEQ ID NOs27～30中的至少一个，检测mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一个，检测cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一个，检测cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一个，检测rbcl的SEQ ID NO41，检测lectin的SEQID NOs42～44中的至少一个，检测zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一个，检测napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一个。
2.如权利要求1所述的转基因农产品DNA检测芯片，该芯片还包括阴性对照和阳性对照，该阳性对照为如SEQ ID NO.51所示的序列。
3.如权利要求1或2任一项所述的转基因农产品DNA检测芯片，其中所述的转基因农产品为大豆、玉米、水稻或油菜，以及其他含有或可能含有相关检测目标基因的农产品。
4.如权利要求3所述的转基因农产品DNA检测芯片，其中所述的水稻为SCK水稻。
5.一种如权利要求1～4任一项所述的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法，该方法包括(1)根据转基因农产品的目标基因序列设计并合成聚合酶链式反应引物，这些聚合酶链式反应引物的解链温度大致相同；(2)利用(1)所述的聚合酶链式反应引物从转基因农产品的DNA中扩增目标检测探针；和(3)将所述探针固定在片基上。
6.如权利要求5所述的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法，其中所述的聚合酶链式反应引物包括用于扩增hpt的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于扩增nptII的以下引物对中的至少一对SEQ IDNO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ ID NO83、SEQ ID NO84和SEQ IDNO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于扩增pnos的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO98和SEQ ID NO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ ID NO103、SEQ ID NO104和SEQ ID NO105；用于扩增nos的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于扩增camv35s的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO58和SEQ ID NO59、SEQ ID NO60和SEQ IDNO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于扩增mdb484-mdb501的以下引物对SEQ IDNO64和SEQ ID NO65；用于扩增barstar的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ ID NO144和SEQ IDNO145；用于扩增barnase的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于扩增cpti的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO126和SEQ ID NO127、SEQ ID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ ID NO132和SEQ IDNO133；用于扩增mcp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO112和SEQ ID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ IDNO118和SEQ ID NO119；用于扩增cryIA(b)的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ IDNO125；用于扩增cp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO106和SEQ ID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于扩增rbcl的以下引物对SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于扩增lectin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于扩增zein的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于扩增napin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQ ID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151。
7.如权利要求5所述的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法，该方法还包括根据阳性对照spvc设计并合成聚合酶链式反应引物，并利用该聚合酶链式反应引物扩增spvc检测探针，所述引物为以下引物对SEQ ID NO152和SEQ ID NO153。
8.如权利要求5所述的转基因农产品DNA检测芯片的制备方法，其中步骤(2)包括利用聚合酶链式反应从转基因农产品的DNA中扩增目标检测探针，聚合酶链式反应的条件为94～95℃预变性3～5min；94℃变性40s；58～60℃退火40s；72℃延伸60s；进行40个循环；72℃延伸5～10min。
9.权利要求1～4任一项所述的转基因农产品DNA检测芯片在检测转基因农产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其中包括以下步骤(1)提取待测农产品的DNA；(2)用如下引物对待测农产品的DNA进行PCR扩增并标记，所述引物包括用于扩增hpt的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于扩增nptII的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ ID NO83、SEQ ID NO84和SEQ ID NO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于扩增pnos的以下引物对中的至少一对SEQ IDNO98和SEQ ID NO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ IDNO103、SEQ ID NO104和SEQ ID NO105；用于扩增nos的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQ ID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于扩增camv35s的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO58和SEQ IDNO59、SEQ ID NO60和SEQ ID NO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于扩增mdb484-mdb501的以下引物对SEQ ID NO64和SEQ ID NO65；用于扩增barstar的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ ID NO144和SEQ ID NO145；用于扩增barnase的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于扩增cpti的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO126和SEQ IDNO127、SEQ ID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ IDNO132和SEQ ID NO.133；用于扩增mcp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO112和SEQ ID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ ID NO118和SEQ ID NO119；用于扩增cryIA(b)的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ ID NO125；用于扩增cp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO106和SEQ ID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于扩增rbcl的以下引物对SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于扩增lectin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于扩增zein的以下引物对中的至少一对SEQ IDNO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于扩增napin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151；(3)将经标记的扩增产物与权利要求1～4任一项的转基因农产品DNA检测芯片杂交；和(4)确定所述待测农产品是否为转基因农产品。
11.如权利要求10所述的应用，其中将所述引物分成至少两个组，然后再用每个组分别进行PCR扩增并标记。
12.一种转基因农产品DNA检测试剂盒，该试剂盒含有如权利要求1～4任一项所述的转基因农产品DNA检测芯片；和用于PCR扩增的引物，该引物包括用于扩增hpt的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO90和SEQ ID NO91、SEQ ID NO92和SEQ ID NO93、SEQ ID NO94和SEQ ID NO95、SEQ ID NO96和SEQ ID NO97；用于扩增nptII的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO80和SEQ ID NO81、SEQ ID NO82和SEQ IDNO83、SEQ ID NO84和SEQ ID NO85、SEQ ID NO86和SEQ ID NO87、SEQ ID NO88和SEQ ID NO89；用于扩增pnos的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO98和SEQ IDNO99、SEQ ID NO100和SEQ ID NO101、SEQ ID NO102和SEQ ID NO103、SEQ IDNO104和SEQ ID NO105；用于扩增nos的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO52和SEQ ID NO53、SEQ ID NO54和SEQ ID NO55、SEQ ID NO56和SEQ ID NO57；用于扩增camv35s的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO58和SEQ ID NO59、SEQ IDNO60和SEQ ID NO61、SEQ ID NO62和SEQ ID NO63；用于扩增mdb484-mdb501的以下引物对SEQ ID NO64和SEQ ID NO65；用于扩增barstar的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO140和SEQ ID NO141、SEQ ID NO142和SEQ ID NO143、SEQ IDNO144和SEQ ID NO145；用于扩增barnase的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO134和SEQ ID NO135、SEQ ID NO136和SEQ ID NO137、SEQ ID NO138和SEQ ID NO139；用于扩增cpti的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO126和SEQ ID NO127、SEQID NO128和SEQ ID NO129、SEQ ID NO130和SEQ ID NO131、SEQ ID NO132和SEQ ID NO133；用于扩增mcp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO112和SEQID NO113、SEQ ID NO114和SEQ ID NO115、SEQ ID NO116和SEQ ID NO117、SEQ ID NO118和SEQ ID NO119；用于扩增cryIA(b)的以下引物对中的至少一对SEQID NO120和SEQ ID NO121、SEQ ID NO122和SEQ ID NO123、SEQ ID NO124和SEQ ID NO125；用于扩增cp4epsps的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO106和SEQID NO107、SEQ ID NO108和SEQ ID NO109、SEQ ID NO110和SEQ ID NO111；用于扩增rbcl的以下引物对SEQ ID NO66和SEQ ID NO67；用于扩增lectin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO68和SEQ ID NO69、SEQ ID NO70和SEQ ID NO71、SEQ ID NO72和SEQ ID NO73；用于扩增zein的以下引物对中的至少一对SEQ IDNO74和SEQ ID NO75、SEQ ID NO76和SEQ ID NO77、SEQ ID NO78和SEQ ID NO79；用于扩增napin的以下引物对中的至少一对SEQ ID NO146和SEQ ID NO147、SEQID NO148和SEQ ID NO149、SEQ ID NO150和SEQ ID NO151。
13.一种检测转基因农产品的方法，该方法包括(1)提取待测农产品的DNA，所述农产品包括农产品原材料和/或农产品加工产品；(2)利用以下目标检测探针检测所述待测产品的DNA，所述目标检测探针包括检测hpt的SEQ ID NOs1～4中的至少一个，检测nptII的SEQ ID NOs5～9中的至少一个，检测pnos的NOs10～13中的至少一个，检测nos的SEQ ID NOs14～16中的至少一个，检测camv35s的SEQ ID NOs17～19中的至少一个，检测mdb484-mdb501的SEQ IDNO20，检测barstar的SEQ ID NOs21～23中的至少一个，检测barnase的SEQ ID NOs24～26中的至少一个，检测cpti的SEQ ID NOs27～30中的至少一个，检测mcp4epsps的SEQ ID NOs31～34中的至少一个，检测cryIA(b)的SEQ ID NOs35～37中的至少一个，检测cp4epsps的SEQ ID NOs38～40中的至少一个，检测rbcl的SEQ ID NO41，检测lectin的SEQ ID NOs42～44中的至少一个，检测zein的SEQ ID NOs45～47中的至少一个，检测napin的SEQ ID NOs48～50中的至少一个；和(3)根据所述探针与所述转基因农产品DNA的结合情况判断该待测农产品是否为转基因农产品。
全文摘要
本发明涉及一种转基因农产品DNA检测芯片，该芯片包括片基和位于片基上的核酸探针，该核酸探针包含用于检测目标基因的目标检测探针，该目标检测探针是一系列如SEQ ID NOs.1～50所示的核苷酸序列。本发明还涉及所述转基因农产品DNA检测芯片的制备方法。本发明还提供转基因农产品DNA检测芯片在检测转基因农产品中的应用。本发明还提供一种转基因农产品DNA检测试剂盒。此外，本发明提供一种检测转基因农产品的方法。
文档编号C12Q1/68GK1786195SQ20051010254
公开日2006年6月14日 申请日期2005年9月8日 优先权日2005年9月8日
发明者吴永宁, 张建中, 周萍萍 申请人:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所