Ena矿物质生物活性溶液、其制造方法及其在预防骨质疏松症方面的应用的制作方法

专利名称：Ena矿物质生物活性溶液、其制造方法及其在预防骨质疏松症方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法以及通过该方法制造的用于预防和改善骨质疏松症的生物活性溶液。更具体地说，本发明涉及通过使用富含矿物质的鱿鱼骨和/或红海藻作为主要原料而制造的矿物质生物活性组合物以及使用这些组合物的保健食品。
背景技术：
随着工业社会的升级和专业化，以前吃慢食的饮食生活已经转向吃快食的饮食生活，由于生活环境的压力和污染因素，现代人必需的矿物质的供应已经出现不足，并且现代人必需的钙的供应还不顺畅。
尽管人体所需的矿物质在人体中以极少的量存在，但其承担了重要的角色，即帮助细胞生长和维持人体组织，并控制身体的活动。特别是，在人体新陈代谢中承担重要角色的钙是预防骨质疏松症不可缺少的，但要供应人类和哺乳动物所需的适量钙很难，并且还有这样的问题，即其摄取量增加了，但吸收率很低。
骨质疏松症是老年人、更年期后的女性或男性常患的骨骼疾病。实际上，其早期诊断和预防还不够。骨质疏松症主要是因为缺乏雌性激素、生长激素和雄性激素等激素而发生的，其次是在甲状腺疾病后发生的。骨质疏松症的病症是，随着破骨细胞的破骨量超过造骨细胞的造骨量，骨密度降低。它最初没有特别的症状，但即使是轻微的撞击，也很容易发生骨折。在更年期的女性中，骨密度的降低会很快发生，并且骨密度的降低在男性和女性中都会缓慢地发生。在这种骨质疏松症中，已显示，血清中的钙(Ca)和总碱性磷酸酶发生了变化，与骨生成有关的激素(例如，雌二醇、骨钙素等)以及与骨质溶解有关的激素(例如，甲状旁腺激素等)的浓度发生了变化。而且，尿中排出的吡啶啉(其是用作骨质溶解指标的胶原质交联剂)增加了。
在骨质疏松症的治疗中，服用雌性激素作为激素的补充治疗，并且据报告，激素的补充治疗应在围绝经期的晚期或更年期的早期就开始，以便获得最大的疗效(Stepan J.J.等5(2003)Endocr Regul 37(4)225-238；Chen L.等(2000)20(4)283-286)。而且，适合雌性激素投药禁忌的骨质疏松症治疗剂包括钙、双磷酸化合物、降血钙素、雷洛西芬、维生素D等。
同时，降血钙素是在甲状腺的C细胞中产生的激素。其在人体中的生理作用还不清楚，但目前认为其涉及对钙平衡进行短时间的轻微控制，并且医药剂量显示了对骨质溶解的抑制效果。特别是，据报告，降血钙素对高转换型骨质疏松症更有效。对骨质疏松症有疗效的治疗剂的例子包括市场上的“Fosamax”和“Evista”，其通过对破骨细胞的产生和活动的阻止作用来抑制破骨或减慢破骨的速度，以这种机制来显示其疗效，还有一种新的骨质疏松症治疗剂，称为“Porteo”，其通过加快造骨细胞的产生和活动来帮助形成新的骨头。尽管在新的化学药物中，雷洛西芬已经成为一种选择性雌性激素受体调节剂(SERM)以及一种在骨质心血管系统中用作雌性激素功效药的理想药物，但作为胸部和子宫的雌性激素对抗药，最近已经报告了该药物在其新陈代谢期间所显示的毒性(Hirsimaki P.等(2002)Breast J.8(2)92-96)。

发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种ENA矿物质A生物活性溶液以及该溶液的制造方法。本发明的另一个目的是提供新的矿物质生物活性溶液，其对预防和改善骨质疏松症有用。本发明涉及一种制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法以及对预防和改善骨质疏松症有用的应用了所述溶液的组合物。更具体地说，本发明涉及通过使用富含矿物质的鱿鱼骨和/或红海藻作为主要原料而制造的ENA矿物质A生物活性溶液组合物以及使用这些组合物的保健食品。
下面将详细说明本发明本发明用于制造一种碱性溶液，其通过精炼紫菜、琼脂、江蓠、海索面、红毛菜、蜈蚣藻、线形杉藻和三叉仙菜(其是可以食用的天然海藻)以及红海藻淀粉和鱿鱼骨(其是主要成分)来分布天然矿物质。
本发明的碱性水溶液是根据包括下列步骤的方法制造的清洗和压碎鱿鱼骨和红海藻；
通过燃烧压碎的材料来制造无机矿物质；将无机矿物质冷却到室温并将其制成微小的粉末；用水离子化微小的粉末；以及通过沉淀和过滤微小的粉末获得碱性水溶液。
以上红海藻指100％植物可食用海藻，其是红色或紫色的植物群，因为其除了叶绿素之外还含有红色的助色团。其植物体是多细胞的，大多数时间是丝状或叶状的，并且生长在海洋中。紫菜、琼脂、鹿角海萝等都属于这些红色的海藻。鱿鱼骨也叫乌贼骨，其是鱿鱼中部的干白骨。
对于本发明中使用上述红海藻和鱿鱼骨来制造无机矿物质的方法，优选地，将红海藻和鱿鱼骨清洗干净并彻底干燥，并且在1,000至2,000℃下将其加热和燃烧1小时。将细菌或杂质完全燃烧和除去之后，只留下了无机的矿物质。然后，将这些矿物质完全冷却到室温，并使用粉碎机压碎成微小的颗粒。
接着，通过使用燃烧后的鱿鱼骨或红海藻将压碎的矿物质溶解于水中。
在对溶解了以上燃烧后的矿物质的水进行离子化时，优选地，在80至100℃下，通过水泵，在高于10个大气压的压力下，利用高度差，将其压碎，持续时间在1小时以上。当水泵的压力至少大于10k时有效。因而沉淀和过滤离子化的溶液。通过让离子化溶液静止15至35小时来自然沉淀出矿物质淤泥之后，使用沉淀过滤器来过滤上层清液，以制造碱性的矿物质生物活性溶液。


结合附图阅读以下详细说明时，将更全面地了解本发明及其许多附带的优点，所附图形包括图1显示了用于溶液离子化步骤的设备；图2显示了对整个测试期间每个组的动物平均体重变化进行比较的曲线图；图3是说明动物尸体解剖期间测得的每个组中的动物平均体重变化的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；
图4显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对血清中的钙浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图5显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对血清中的磷浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图6显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对血清中的雌二醇浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图7显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对血清中的骨钙素浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图8显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对血清中的碱性磷酸酶浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图9显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对骨质溶解期间隔离到血清中的吡啶啉浓度变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图10显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对枝状骨组织的面积变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图11显示了通过Azan染色(其是一种针对胶原质的特定染色法)来观察枝状骨(其是骨胶原质的指标)的情况，时间是在切除卵巢后服用矿物质生物活性溶液(其是测试材料)之后的4、8和12周；图12显示了动物尸体解剖之后矿物质生物活性溶液对骨质溶解期间增加的破骨细胞数量变化的影响的曲线图，时间是在切除卵巢后服用测试材料之后的4、8和12周；图13显示了观察骨质溶解期间增加的破骨细胞活动程度的情况，时间是在切除卵巢后服用矿物质生物活性溶液(其是测试材料)之后的4周；图14显示了观察骨质溶解期间增加的破骨细胞活动程度的情况，时间是在切除卵巢后服用矿物质生物活性溶液(其是测试材料)之后的8周；图15显示了观察骨质溶解期间增加的破骨细胞活动程度的情况，时间是在切除卵巢后服用矿物质生物活性溶液(其是测试材料)之后的12周；图16显示了服用矿物质生物活性溶液对切除卵巢的动物的实质性器官的影响。
具体实施例方式
本发明的其他特点和优点将通过随后的描述进行阐释和部分体现，也可以通过实践本发明来加以了解。下文，除非另有说明，否则％表示重量百分比。
ENA矿物质A生物活性溶液的制造将清洗干净并干燥的鱿鱼骨和红海藻压碎成粉末并在1,100℃下燃烧1小时。将燃烧后的鱿鱼骨和海藻完全冷却到室温，并通过使用粉碎机制成微小的粉末。对于以上的红海藻，紫菜、琼脂、江蓠、海索面、红毛菜、蜈蚣藻、线形杉藻、三叉仙菜和红海藻淀粉均以相同的量混合和使用。
在500升水中，放入1.5kg燃烧后的鱿鱼骨的微小粉末和4kg燃烧后的红海藻的微小粉末，搅拌，并溶解。通过水泵，在10个大气压的压力下，利用高度差，将在上述溶液中的颗粒压碎，时间持续2小时，以制造离子化的溶液。让离子化的溶液静止24小时之后，使用沉淀过滤器对反应器中的上层清液进行过滤，以制造矿物质生物活性溶液。下表1中显示了如此制造的矿物质生物活性溶液的成分的分析结果表1.ENA矿物质A生物活性溶液的成分分析


如上表1所示，可以看出，根据本发明的离子化溶液是pH值为12.85的碱性溶液，特别是富含钙，并且含有大量的各种对人体有益的金属离子。
ENA矿物质A生物活性溶液的制造将鱿鱼骨清洗干净并干燥之后，按照与优选实施例1相同的方法来制造离子化的溶液。并且按照与优选实施例1相同的方法来制造矿物质生物活性溶液，但将5.5kg燃烧后的鱿鱼骨的微小粉末溶解于500升水中。下表2中显示了如此制造的矿物质生物活性溶液的成分的分析结果表2.ENA矿物质A生物活性溶液的成分分析


如上表2所示，可以看出，根据本发明的离子化溶液是pH值为12.2的碱性溶液，特别是富含钙，并且含有大量各种对人体有益的金属离子。
使用碱性矿物质生物活性溶液的动物实验通过使用在以上优选实施例1中制造的碱性矿物质生物活性溶液来执行动物实验。
对于实验用的动物，使用了由Orient Company提供的Wistar组中的无特定病原(SPF)老鼠。将五只Wistar老鼠都放在聚碳酸酯养殖箱(240宽×390长×175高mm)中，所述养殖箱配有自动调温调湿器，将温度设为22±3℃，相对湿度设为50±10％，并且照明时间为12小时(08:00打开，20:00关闭)，饲养并繁殖。对于饲料，通过辐射(13.2kGy)对用于实验动物的固体饲料(PMI NutritionInternational，地址505North 4thStreet，Richmond，IN 47374，USA)进行消毒，并随意取用。对于水，使用水瓶自由取用自来水。
作为饮用水以0.5％、5％和10％的浓度将优选实施例1中制造的24L矿物质生物活性溶液应用于骨质疏松症的实验性动物模型中，时间持续12周，同时保持其冷冻，然后，通过血清中的骨质疏松症诊断指标变化和大腿骨的组织病理学检验来执行骨质疏松症的预防效果实验。将一般的自来水用于对照实验。
在Wistar老鼠中，选择体重为200至230g的雌鼠，并且每一组都使用24只雌鼠。将每一组中的老鼠都放在聚碳酸酯养殖箱中。使用Rompun(0.04cc/100g)和克他命(0.14cc/100g)将老鼠麻醉之后，刮掉其腹部的毛并使用消毒剂彻底消毒，且切除老鼠的卵巢。通过使用手术刀切割腹部中线大约1cm、吸引韧带子宫并暴露两侧的卵巢来完全切除两侧的卵巢。缝合每一块肌肉和皮肤之后，通过对手术现场进行彻底消毒来防止感染，并且通过在手术第二天测量体重来执行品种分离。将老鼠分成四组之后，在整个测试期间，通过饮用来自由供应测试材料，并且在服用测试材料4、8和12周之后，处死动物。
表3.动物实验每一组的服药情况

a在整个测试期间通过饮用来自由供应。
bENA(矿物质生物活性溶液的名称)下面说明了动物实验的结果<老鼠体重变化观察>
在整个测试期间，通过每周测量一次体重来观察通过切除卵巢从雌鼠引入的骨质疏松症的动物模型的体重变化。图2和3显示了所观察到的动物一般症状。据观察，在切除卵巢之后，所有测试组的体重都增加。但与填料对照组相比，服用0.5％、5％和10％矿物质生物活性溶液(其是测试溶液)的组中未观察到任何统计上显著的体重变化，并且整个测试期间，在观察动物一般症状的过程中，未观察到任何异常的症状。
<观察对血清指标的影响>
对雌鼠进行卵巢切除实验之后引入的骨质疏松症的动物模型中，在定期处死的动物中观察雌二醇、骨钙素、钙、磷和碱性磷酸酶(其用作骨质疏松症中的血清指标)的浓度，以验证测试材料的功效。通过血液样本的离心分离(3,000g，15分钟)分离出血清之后，用放射性免疫测定方法(美国拜耳)测量雌二醇和骨钙素，用OCPC端点法(美国拜耳)测量钙，并且通过使用商业工具包(阿根廷布宜诺斯艾利斯Bio System S.A.)来形成磷钼酸盐复合物而根据分光光度测定法来测量磷的浓度。根据比色分析(德国拜耳)来测量血清总碱性磷酸酶的活性。图4至8中显示了各个成分。
1)钙如图4所示，在整个测试期间，与填料对照组相比，服用了0.5％、5％和10％矿物质生物活性溶液(其是测试材料)的组中没有观察到统计上显著的血清钙浓度变化。我们认为服用矿物质生物活性溶液对血液中的钙浓度没有影响。
2)磷如图5所示，在整个测试期间，与填料对照组相比，服用了0.5％、5％和10％矿物质生物活性溶液(其是测试材料)的组中没有观察到统计上显著的血清磷浓度变化。我们认为服用矿物质生物活性溶液对血液中的磷浓度没有影响。
3)雌二醇如图6所示，据观察，与填料对照组相比，服用5％和10％矿物质生物活性溶液的组在服用后12周出现了统计上显著(p＜0.05)的血清雌二醇浓度增加。我们确定血液中这种增加的雌二醇浓度是来自具有天然成分的测试材料。并且我们认为，在因为缺乏激素引起的骨质疏松症的动物模型中，可以通过切除卵巢来防止骨质溶解。
4)骨钙素如图7所示，据观察，与填料对照组相比，分别服用5％和10％矿物质生物活性溶液的组在服用后12周出现了统计上显著(p＜0.05和p＜0.001)的血清骨钙素浓度降低。还观察到，与填料对照组相比，服用矿物质生物活性溶液的组在服用后4和8周，血清骨钙素的浓度趋低。我们认为，尽管矿物质生物活性溶液对骨钙素(骨生成的指标)没有重大的影响，但长期服用测试材料可以通过降低骨钙素的浓度而将骨生成降低到原来的水平。
5)碱性磷酸酶如图8所示，在整个测试期间，与填料对照组相比，服用了0.5％、5％和10％矿物质生物活性溶液(其是测试材料)的组中没有观察到统计上显著的血清碱性磷酸酶浓度变化。
<观察对血清吡啶啉的影响>
骨质疏松症期间，由于骨头胶原质的减少，吡啶啉(PYD)(I型胶原质交联分子)被隔离到循环的血液和尿中。通过测量PYD(其是一种针对骨头的指标)可以观察到骨质疏松症的进展情况。在测量PYD的过程中，尽管使用传统HPLC或免疫测定来测量被隔离到尿中的PYD的方法存在缺点，即其灵敏度和特异度低，但它是早期诊断骨质疏松症的有用的血清指标，因为即使低40倍的PYD浓度也可以测量，而本实验中通过应用酶联免疫测定(ELISA)来测量尿中和血清中的PYD。图9显示了测量结果。
通过在骨质溶解期间观察矿物质活性溶液对隔离到血清中的吡啶啉(PYD)(其是一种I型胶原质交联分子)的影响，如表9所示，与填料对照组相比，服用10％测试材料的组在服用测试材料之后4和12周，观察到统计上显著(p＜0.01)的血清PYD浓度降低。服用测试材料之后8周，在服用5％和10％测试材料的组中观察到了显著(p＜0.05)的血清PYD浓度降低。
<观察对骨头和其他器官的影响>
为了在组织病理学上观察实验性骨质疏松症动物模型的大腿骨，从定期处死的每只动物中取出大腿骨，并且使用图像分析程序(Visus图像分析，美国加利福尼亚州Foresthill的Foresthill Products)，通过Azan染色(其是一种针对胶原质的特定染色法)来分析枝状骨的面积(其是骨质疏松症指标)，以便针对组织样本根据骨质疏松症的进展来观察大腿骨胶原质的变化，其中，这些组织样本是通过使用蚁酸的脱钙方法以及使用10％中性福尔马林的组织固定方法制造的。并且通过苏木精-伊红染色确认了破骨细胞(其是与骨质溶解有关的细胞)的数量。
同时，为了观察长期接触测试材料对每个器官的影响，处死动物时，将肺、心脏、肝、脾、胰腺、肾、甲状腺、肾上腺等实质性器官连同大腿骨一起取出，并且根据一般的组织处理方法，通过10％中性福尔马林固定方法，使用苏木精-伊红染色来进行观察。图10至16显示了观察结果。
1)枝状骨的面积通过Azan染色(其是一种针对组织中的胶原质的特定染色法)来检查切除卵巢之后矿物质生物活性溶液(其是测试材料)对骨头胶原质的影响。如图10和11所示，据观察，在填料对照组中，由于卵巢切除，产生了缺乏激素引起的骨质疏松症，并且枝状骨的面积随着测试期的过去逐渐缩小，因为骨头胶原质的数量减少了。尽管在切除卵巢之后的4周，服用测试材料未观察到任何统计上显著的变化，但观察到，与填料对照组相比，枝状骨面积(其是骨胶原质形成的指标)在服用0.5％、5％和10％测试材料的组中偏高。尽管在8周服药组的比较中观察到，与服药后4周相比，在服用测试材料后8周，所有测试组的骨胶原质都减少了，但与填料对照组相比，分别服用5％和10％测试材料的组中观察到了统计上显著(p＜0.05和p＜0.001)的枝状骨面积增加。同时，在12周服药组中，与4周和8周服药组相比，在填料对照组和服用0.5％测试材料的组中，骨胶原质的数量减少了。并且在12周服药组中，像8周服药组中一样，在服用5％和10％测试材料的两个组中都观察到了枝状骨面积的显著增加(p＜0.01)。
2)破骨细胞数量的变化通过观察破骨细胞(其是用于骨质溶解指标的细胞)的数量变化，如图12至15所示，在整个测试期间观察到了统计上显著的变化。在切除卵巢之后的4周，服用矿物质生物活性溶液(其是测试材料)之后观察大腿骨骨干部分中的破骨细胞数量变化。在服用10％测试材料的组中观察到了统计上显著(p＜0.01)的破骨细胞数量减少。并且与填料对照组相比，在服用8周各种浓度的测试材料的组中，观察到了破骨细胞数量的显著降低。同时，尽管在对照组的情况下，与8周服药组相比，12周服药组中显示了一样高的破骨细胞数量，但观察到，在服用测试材料的组的情况下，与填料对照组相比，服用各种浓度的测试材料的组中的破骨细胞数量显著(p＜0.01)减少。
3)观察对实质性器官的影响不仅观察了矿物质生物活性溶液(其是测试材料)对实质性器官的影响，而且观察了长期供应饮用水对实质性器官的影响。结果显示，其对肺、心脏、肝、脾、胰腺、肾、甲状腺和肾上腺没有影响。如图16所示。
对所获得的材料执行多重比较测试。对于平均值，执行Dunnett t检验(其是一种多重比较方法)，以便在Battlett测试中有同质性的情况下，检查填料对照组和服药组之间是否有差异。如果Battlett测试的结果未发现同质性，则执行Kruskal-Wallis H测试(其是一种使用有序数据的非参数法)，并且在p＜0.05的情况下，通过使用Dunnett检验来研究各个组之间的显著差异。通过使用GraphPadInStat(3.05版，GraphPad Software公司)(其是一种统计程序)来执行这种分析。将验证的危险率确定为5％和1％。
工业适用性长期服用根据本发明的矿物质生物活性溶液可以增加血清中的雌二醇浓度，而降低骨钙素的浓度；通过增加枝状骨的面积，而减少大腿骨的破骨细胞数量来防止骨质疏松症；但对其他器官未显示任何毒性。
虽然已经显示和说明本发明的某些优选实施例，但应清楚了解，本发明不限于此，而是可以在以下权利要求书的范围内以各种其他方式实施。
权利要求
1.一种制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其包括以下步骤清洗和压碎鱿鱼骨和红海藻；通过燃烧压碎的材料来制造无机矿物质；将所述无机矿物质冷却到室温并将所述无机矿物质制成微小的粉末；用水离子化所述微小的粉末；以及通过沉淀和过滤所述微小的粉末而获得碱性水溶液。
2.如权利要求1所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，制造所述无机矿物质的所述步骤是在1,000至2,000℃下燃烧所述压碎的材料。
3.如权利要求1所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，用水离子化所述微小的粉末的所述步骤是采用压碎方法在80至100℃的温度和10个大气压或更大的压力下利用高度差通过水泵完成的。
4.如权利要求3所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，用水离子化所述微小的粉末的所述步骤持续1小时或更长。
5.如权利要求1所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，所述沉淀步骤的完成时间是15至35小时。
6.一种根据权利要求1至5中任何一项制造的ENA矿物质A生物活性溶液。
7.如权利要求6所述的ENA矿物质A生物活性溶液，其特征在于，所述ENA矿物质A生物活性溶液对预防骨质疏松症有效。
8.一种制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其包括以下步骤清洗和压碎鱿鱼骨和红海藻；通过在1,000至2,000℃下燃烧压碎的材料来制造无机矿物质；将所述无机矿物质冷却到室温并将所述无机矿物质制成微小的粉末；采用压碎方法在80至100℃的水中和10个大气压或更大的压力下利用高度差通过水泵离子化所述微小的粉末；以及通过沉淀和过滤所述微小的粉末获得碱性水溶液。
9.如权利要求8所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，用80至100℃水离子化所述微小的粉末的所述步骤持续1小时或更长。
10.如权利要求9所述的制造ENA矿物质A生物活性溶液的方法，其特征在于，所述沉淀步骤的完成时间是15至35小时。
11.一种根据权利要求8至10中任何一项制造的ENA矿物质A生物活性溶液，其特征在于，所述ENA矿物质A生物活性溶液对预防骨质疏松症有效。
全文摘要
本发明涉及一种制造碱性矿物质生物活性溶液的方法，所述溶液的原材料是在高温下燃烧的鱿鱼骨以及压碎的红海藻粉末，并且涉及对预防骨质疏松症有功效的组合物和保健食品。可将本发明的富含矿物质的碱性水溶液用于对预防和改善包括人类在内的哺乳动物中的骨质溶解和骨质疏松症等骨疾病有功效的生物活性溶液。
文档编号A23L2/38GK1968612SQ200580019967
公开日2007年5月23日 申请日期2005年4月15日 优先权日2004年7月30日
发明者化成龙, 郑圭植, 都先姬, 郑元一, 郑多喜, 李起喜, 赵恩美, 池勋 申请人:化成龙