反射辅助检测-一种快速、有效和高度准确地鉴别具有感染、疾病或其它病症的受试者的方法

专利名称：：反射辅助检测-一种快速、有效和高度准确地鉴别具有感染、疾病或其它病症的受试者的方法反射辅助检测-一种快速、有效和高度准确地鉴别具有感染、疾病或其它病症的受试者的方法相关申请本申请根据35U.S.C.S119(e)要求2004年12月3日提交的题为"用于牛分支杆菌的反射辅助测试一一种快速分离和鉴别感染动物的方法"的美国临时专利申请序号60/633,217的权益，以及2005年1月20日提交的题为"用于牛分支杆菌感染的快速诊断测试"的美国临时专利申请序号60/645,428的权益。本申请还要求2005年3月1曰提交的美国专利申请序号11/069,351的优先权。每个申请的完整内容均通过引用结合到本文中。发明领域本发明涉及检测生物样品中病原体和/或标记分子的存在情况的方法。在一个具体实施方案中，所述方法包括针对病原体和/或标记分子的存在使用高灵敏度和选择性的测试。因为可选择为100%或接近100%的灵敏度，所以阴性结果被看作是没有病原体或标记的指示。在一个更具体的实施方案中，4吏用灵敏度定为或接近100%的相同测定对表现出阳性结果的样品进行反射辅助检测(reflexsupplementaltesting)。笫二次的阳性结果可用作第三轮检测的指示。随着每轮反射检测的进行，假阳性结果数量降低。根据测试的受试者数目、所使用测定的灵敏度和特异性，选择合适数量的重复反射测试，由此可将存在的假阳性消除或降低至任何期望的水平。对阳性样品使用选定轮数的反射测试可导致假阳性有效消除。发明背景牛结核病是一种牛中的感染性和高度传染性疾病，由牛分支杆菌(M少co6a"en'MW6ov/力感染引起。其可通过与分支杆菌(Myco6a"enwm)气雾接触或通过摄入污染物传播。该病往往发展成在早期相对无症状的慢性炎症。晚期病例以非特有症状如虛弱、食欲不振、淋巴结胂胀、咳嗽不止和呼吸窘迫为特征，可被误认为其它类型的呼吸疾病。尽管所述细菌优先感染牛，但已报告了向人和其它哺乳动物的传播。标准检测方法目前包括结核菌素皮试。但是，标准皮试的假阴性或假阳性结果并非罕见。因为阳性测试可能导致推定感染动物以及已直接接触该动物的其它畜群动物的毁灭，所以需要更灵敏和准确的结核病检测方法。此方法还应对测试人受试者的结核病和其它疾病有益。病，例如丙型肝炎病毒感染、人免疫缺陷病毒(HIV)感染和乙肝感染(例如MorbidityandMortalityWeeklyReport,Dept.HealthandHumanServices,CentersforDiseaseControlandPrevention,2003年2月7日,52(RR-3):1-13)。但是，先前的此反射测试使用与用于产生初始阳性结果的测定不同类型的测定进^f亍。例如，疾病控制和预防中心(CDC)。推荐，针对抗丙型肝炎抗体存在的初始阳性测试结果后续使用更特异血清学测试的反射测试，所述测试例如为重组免疫印迹测定或核酸筛选测定(出处同上)。因为这种测试经常更昂贵、耗时和需要较高程度的技术专长，所以使用更灵敏的不同测定的反射测试可相当程度地增加费用、延时或获得可靠测试结果的难度。先前的反射测试实例集中在使用较低准确度但较高速度、经济性或便利性的初始测试，接着使用较高准确度、通常具有较低速度、较高费用和更复杂的测试步骤的反射测试。这种测试方案尤其受困于假阴性的存在，产生可传播该疾病的感染受试者的残留群体。需要可重复地利用相同类型测定来降低或消除假阳性和假阴性结果的反射测试方法。技术人员会认识到，本文公开的并要求保护的反射检测方法不限于牛或人中的结核病，而是可适用于针对广泛范围的病原体和/或标记分子的存在情况的检测。针对各种病原体和/或标记分子的众多不同检测是本领域已知的，并是商品化的。例如通过改变诸如温度、pH、漂洗步骤的次数和/或严格性、物质(例如变性剂、离液剂(例如甲酰胺、尿素、胍盐、异硫氰酸盐)、鳌合剂(例如EGTA、EDTA)、降低抗体或其它检测部分的非特异性结合的化合物(例如牛血清白蛋白》的有、无或浓度、盐浓度、二价阳离子浓度的参数，以及通过本领域已知的其它技术，改变用于实施这种检测的条件，以提供更高或更低水平的严格性，这属于本领域技术范围。使用这些技术，可调整给定测试的相对灵敏度和/或特异性。在许多情况下，灵敏度和特异性相反地改变。即，随着测定灵敏度增加，特异性降低，原因是与其它相似病原体或分子非特异性结合或交叉反应。在使用本文公开的并要求保护的反射检测方法的优选实施方案中，可选择测定条件，以提供为100%或接近100%的灵敏度和相应降低的特异性。可选择这种条件，以消除假阴性结果的存在，使得在进一步的测试中消除产生阴性测试结果的样品。假阳性可通过仅重复测试在先前测试轮次中产生阳性测试结果的样品来降低或消除。本文公开并要求保护的测试方法提供了在经济性、速度、效率、测试简便性以及假阳性和假阴性的降低和消除方面超越先有技术测试方法的显著优势。附图筒述以下附图构成了本说明书的一部分，纳入这些附图是为了进一步阐述本发明的某些实施方案。参考一个或多个这些附图连同本文提供的具体实施方案的详述可更好地理解实施方案。图l是CMOS图像传感器的图解说明。图2是Bayer滤色器镶嵌矩阵的图解说明。图3是图像传感器的可能滤色器排列的图解说明。图4是图像传感器中微透镜操作的图解说明。图5是代表性图像传感器的量子效率的曲线图。图6是图解说明用于图像传感器优化的校准实施方案的流程图。图7是图解说明图像传感器优化的实施方案的流程图。图8是光散射检测的图解说明。图9显示了1996-2004年在英国证实感染牛TB的新牛。数据取自2005年2月23日的英国国际统计局环境、食品和农村事务部，(statistics.defra.gov.uk/esg/statnot/tbpn.pdi)。图10图解了代表性的反射辅助检测流程，假定感染牛和未感染牛正常分布。图11显示了在测试牛TB时特异性和流行率对RST值的作用。图12图解说明了全光学测定装置(TOADTM)的说明性实例。图13是一幅示意图，图解说吸了代表性TOADtm装置的元件。图14显示了TOADTM装置上表面的示意图，外罩1410被移开，以显示镜台1420。图15显示了11个样品和阴性对照参比的代表性样品池(cribset)，使用铁氧体CP10-ESAT6融合蛋白缀合物与阳性和阴性牛血清样品。样品如实施例1所公开的进行分析。图16显示了代表性ROC曲线。图17显示了对阳性牛分支杆菌感染的牛进行的自动阈值标准化相对发光度筛选和RST测试的4戈表性测定结果。图18显示了CaudalFold、Bovigam和当前公开的反射辅助检测方法的PPV(阳性预测值)的代表性对比。图19图解说明了反射蜂窝盒的代表性聚碳酸酯底部(透明)覆层。底部覆层是7mil的透明聚酯，贴到具有圆角的2.64"x2.64"蜂窝盒上(标准Avery5096标签大小)。在贴到蜂窝之前穿出3/16"和1/16"的锁孔。图20显示了在一个蜂窝实施方案中单元的代表性编号分配，在该实例中蜂窝中有55个单元。角落中的指示标记与3/16"孔锁销位于同一側。图21图解说明了代表性铝蜂窝切割图案，显示了水平行和垂直行切割。图22显示了铝蜂窝图案的代表性详细切割。图23显示了光学检测器孔径上方的中心单元的盒细节。图24显示了盒的代表性加样板。图25图解说明了TB检测的代表性方案，使用铁氧体抗原缀合物浓缩并分离抗分支杆菌抗体。图26提供了MPB83缀合物的ROC图的代表性牛测试结果的总结。说明性实施方案的描述阐述本发明的代表性实施方案的其余细节公开于2003年4月29曰提交的美国专利申请序号10/425，222、2003年2月24日提交的美国专利申请序号10/373,546、2003年2月24曰提交的美国专利申请序号10/373,408以及2004年2月17日提交的PCT专利申请PCT/US2004/04675，这些专利申请每一个的内容都通过引用结合到本文中。定义本文不另外定义的术语按照其平常和原始的含义使用。本文使用的"一个"或"一种"可指一个或一个以上的对象。本文使用的"捕获分子"或"探针"指对一种或多种病原体、病原体结合分子和/或标记分子具有结合亲和性的分子或聚集体。在本发明范围内，实际上对某些目标病原体和/或标记分子具有结合亲和性的任何分子或聚集体都可为"探针"。"探针"包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、FAb片段、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、亲和体、寡核苷酸、多核苷酸、核酸、适体、结合蛋白、受体蛋白、生物素、链霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和可结合至少一种病原体和/或病原体结合分子的任何其它已知配体。本文使用的"标记"分子指其在样品中的存在、不存在和/或浓度指示疾病、病原生物或其它病症的存在或不存在的分子或分子聚集体。例如，不同标记分子(例如前列腺特异性抗原(PSA)、CA125、突变形式的ras或Her2-neu蛋白、CEA(癌胚抗原)和其它分子)的存在或浓度提升可指示受试者中存在特定类型的癌症。同样，Alzheimer病可由淀粉样(3肽、淀粉样前体蛋白(APP)或其它已知标记的存在或水平提升来指示。不同疾病或病症的众多此类标记分子或分子复合物是本领域已知的，对于使用要求保护的方法来说，任何此类已知标记都可被测定。本文使用的"病原体"是本领域已知与感染性疾病相关的任何病毒、细菌、微生物、分子或分子聚集体。病原体的非限制性实例列于表l。本文使用的"量子效率"指被利用的或有助于成像装置的电流或信号输出的光或光子通量的比率。本文使用的"图像传感器"、"成像装置"或"成像器"指捕获图像的装置。该术语包括但不限于CMOS(互补金属氧化物半导体)图像传感器和CCD(电荷耦合器件)成像器。本文使用的"光子通量"指撞击包括图像传感器表面在内的表面的光子能量。撞击表面的能量可以瓦特/cn^检测，与给定时间段内撞击单位面积的光子数相关。牛结核病的检测在一个代表性实施方案中，公开的反射检测方法可用于检测在牛和人受试者中引起结核病的细菌的存在情况。结核病是重大的国际人类和动物健康问题，人类疾病每年引起约3百万例死亡(世界卫生纟且织、"Tuberculosiscontrolandresearchstrategiesforthe1990s.MemorandumfromaW.H.O.meeting,"BulletinW.H.O.70:17-21,1992)。牛结核病是造成经济损失的主要原因和动物传染病感染的显著原因(Daborn,C丄和Grange,J.M.,fflV/AIDSanditsimplicationforthecontrolofanimaltuberculosis.1993.Br.Vet.J.149:405-417)。在牛中，结核病(TB)由与人病原体结核分支杆菌(M密切相关的细菌牛分支杆菌的感染引起。在这些菌抹表达的抗原中仅发现了非常有限的差异，两种菌抹都包括在定义的"结核菌复合群"中，而抗原表达的明显差异区分这些致病因子和非致病菌抹。(Pollock,J.M.和P.Andersen,"PredominantrecognitionoftheESAT-6proteininthefirstphaseofinterferonwithMycobacteriumbovisincattle,"InfectImmun,1997,65:2587-92;Andersen,A.B.等，"Structureandfiinctionofa40,000MWproteinantigenofMycobacteriumTuberculosis,"Infect.Immun.,1992.60:2317-2323;Harboe,M.T.等，"EvidenceforoccurrenceoftheESAT-6proteininMycobacteriumtuberculosisandvirulentMycobacteriumbovisandforitsabsenceinMycobacteriumbovisBCG,"1996,Infect.Immun.64:16-22)。牛结核病也可感染人、其它家畜和一些野生动物(包括麋鹿和白尾鹿)。牛结核病根除计划目前在美国和许多其它国家实施。流行性追踪在1917年开始，与根除计划相关的流行性下降产生的利益随着时间累积每年都能感受到。2004年的估计利益为每年1.9亿美元(ReportoftheCommitteeonTuberculosis-2004,usaha.org/committees/reports/report-tb-2004)。尽管3口jJ:匕，<乃频繁发玉见牛结核病感染。在2003财政年度，检测到10个感染的牛群，在2004年又多检出6个牛群。感染的乳用小母牛/阉牛的来源可能与美国牛奶场中未被检测的TB有关，并混有感染的育肥牛或由TB感染区域的违规迁移。不充分的动物识别也可能干扰鉴别感染源的研究成果。2004财政年度的屠宰监视披露了35例结核病，相比之下在2003财政年度发现了39例。在墨西哥，2004年进口的牛的感染率为0.22/10,000，相比之下在2003财政年度的牛感染率为0.34/10,000。图9显示了由1996年至2004年1月在英国对不受限畜群进行测试产生经证实的新的牛感染事件的百分率，强调了对更好的检测和根除方法的需求。到2004年10月，在测试的372,284头动物中证实了1311头感染动物(0.4%流行率)。目前的近似流行率在美国为0.2%，在墨西哥为0.4%,在英国为0.4%。人如下感染牛结核病l)在感染动物或感染的人于附近咳嗽或打喷*后吸入细菌污染的空气；2)饮用感染母牛的未经高温消毒的奶或吃感染动物的生肉或未煮熟肉；或3)在疏刷和加工动物尸体时处理了感染的肉，尤其是在食用食物之前手没有仔细清洗的情况下。但是，已知悉的是，结核病致死的人不比任何其它疾病多。依据世界卫生组织(WHO)报告，在2003年有超过2百万人由于结核病死亡。目前的估计是，世界上每3个个体中有1个具有潜伏的结核病，意味着有接近30亿感染个体。结核病是高度传染性的，类似于感冒一样快速传播，除非在全世界得到控制，否则在美国不能被根除。牛结核病在人中的症状一^:与传4番方法有关，类似于在结核病(MA)感染中观察到的症状。这些症状包括咳嗽、发烧、盗汗、疲劳和体重下降。感染A^ov或Af^的患者通常使用结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)皮试来鉴别，在任一种情况下都用相同的处方药来治疗。用于治疗TB的药物决不是无害的，促升发病率和死亡率，因为患者需要忍受适当疗法疗程长期的治疗。结核病在全世界是首要感染性致死病，因为其不易被充分治疗。药物抗性TB的流行正快速出现，目前已超过3%。使用目前可用的最好检测证实个体感染需耗时数周到数月。没有易于鉴别感染个体和传播该疾病的个体的快速诊断测试，因为该生物体难以分离、生长緩慢和不可预见地传播。皮试需要高超的技术来解释，不能可靠地用于鉴别可能被该生物体感染或携带该生物体的BCG接种患者，确实被感染的个体有30-40%不能被鉴别出来。快速(l-4小时)和简单的血液测试对于发现已被感染的个体并治疗它们以根除和或控制TB应具有极大价值。结核病的控制和根除提出了严峻挑战，因为难以鉴别受感染的受试者。在大多数疾病中，人和动物容易出现响应于外来蛋白的可检测水平的抗体，其给出了特定病原体感染的可靠指示。实际上，现代疾病诊断和监视一般基于针对感染物的抗体检测，而不是基于感染因子自身。但是，TB病原体是一组更隐匿的疾病因子中的一种，在这些疾病因子中，通过常规方法几乎观测不到可检测的抗体，直至感染后期病原体已充分建群并且临床病征已经明显时方可^r测到。已经表明，大部分牛分支杆菌感染的牛建立了有效的细胞介导免疫(CMI)应答，具有低抗体应答，包含长期的局限化病灶内感染(Theon,C.O.和Morris,J.A.,TheimmunespectrumofMycobacteriumbovisinfectionsinsomemammalianspecies:areview.1983,Vet.Bull,Weybridge,53:543-550)。由于该缘故，已经证实，检测响应于TB感染出现的特异性抗体的诊断测试的灵敏度低于结核菌素PPD皮试(在人和牛中均是如此)，因为它们产生很多假阴性或漏掉的TB病例。这些血清学检测通常还已被证实具有低特异性，即它们常常检测到机体响应于其它相对无害的分支杆菌而产生的抗体，产生假阳性。在乎f的,辨才法目前在牛中诊断TB的优选方法是单皮内结核菌素测试(SIDT)，是一种检测响应于牛分支杆菌感染的细胞介导免疫(CMI)应答的现场检测。具体地说，其在牛结合菌素PPD皮内接种后检测CM应答的一个组成部分一延迟型过萄文反应。结果在72小时后评定。(Wood，P.R和Jones,S丄.BovigamTManInternationallyAccreditedDiagnostictestforBovineTuberculosis.USAHAProceedings,1998，l國9)。业已才艮导该测试在广泛感染的畜群中具有高达96-99%的特异性。(Monaghan,M.等，Thetuberculintest.1994,Vet.Micro.40:111-124)。但是，该测试的中等灵敏度(72%)在TB根除计划中是有疑问的，因为28。/。的感染动物被不正确i也鉴别为未感染的。除非它们明显患病，否则它们被放回到畜群中，并将感染传播给其它未感染牛。另外，在某些地理区域，由于与非典型分支杆菌的显著交叉反应性，特异性甚至还下降。未在根除计划中的其它感染动物包括白尾鹿、麋鹿、獾等，也可以再感染先前已放行的牛，由此加剧或增加了与根除相关的问题。灵敏度和特异性对根除该疾病均具有重要影响。随着流行率衰减，相对于真阳性动物，检测的假阳性动物数量升高，原因是特异性低于100%。阳性预测值与流行率成正比下降，导致在低流行率时大部分动物被不正确地鉴别为感染的。灭除被不正确地鉴别为感染的动物在经济上是不可接受的。不过，尽管有这些缺点，但在过去的100年中，皮试已成为唯一可用于筛选大群体(人或动物)的实用测试。大部分患有结核病的牛没有表现出临床征兆。但是，它们对其它牲畜和人不形成严重威胁。一般认为在美国和目前正在进行根除计划的许多其它国家中结核病流行率低，但计划持续性弱。在许多国家使用组合两种不够理想的测试形式的标准"串联"测试。(M.Thrusfield,VeterinaryEpidemiology:第2版，BlackwellScience,Maiden,MA,USA.1995)。第一个测试是叫做尾褶检测(CaudalFoldTest)(CFT)的PPD皮试，其设计用于鉴别疑似的(反应者)或阳性的。然后用短间隔比较结核菌素测试(SICTT)(有时也叫做比较颈测试)对测试为阳性或反应者的所有动物复测。CFT的灵敏度范围为68-95%,特异性为96-98.8%。SICTT具有77-95%的灵敏度，特异性超过99%(Francis,J.等,"ThesensitivityandspecificityofvarioustuberculintestsusipgbovinePPDandothertuberculins,"VeterinaryRecord,1978103:420-425;Monaghan,ML等，"Thetuberculintest,"VeterinaryMicrobiology,1994,40:111-124)。如果该测试是阳性的，则动物被屠宰，收集组织进行培养并进;f于组织病理学检查。通过组合两种不够理想的测试，整体的灵敏度降低至约70%，但特异性接近100%，使不正确鉴别的动物免于被屠宰。但是，降低的灵敏度产生一些假阴性结果，相应存在的隐藏感染动物导致持续低水平的感染率。串联诊断测试的串联测试统计结果的一个良好实例论述于prevmed.vet.ohio-state.edu/ext一62bhtm。对有毒力的牛分支杆菌和减毒的疫苗抹牛分支杆菌BCG之间的遗传差异进行分子分析。使用扣除基因组杂交鉴别出3个差异区域，称为RD-l至RD-3。RD-l在结核分支杆菌和牛分支杆菌的所有菌抹中都检测到，但在所有BCG次代株中都没有。(Maheiras,G.G.等，1996,"MolecularanalysisofgeneticdifferencesbetweenMyco6acfen.訓6ov/sBCGandvirulentA/,/)ov,y，J.Bacteriol178:1274-1282)。编码早期分泌抗原乾6kD蛋白的ESAT-6基因存在于RD-l中。ESAT-6是已由结核分支杆菌短期培养浸润物纯化的主要T细胞抗原。(Sorensen,A丄.等，1995,"PurificationandcharacterizationofalowmolecularmassT画cellantigensecretedbyMft/Z)ercw/owV，Infect.Immun.63:1710-1717;Harboe,M.等,1996,"EvidenceforoccurrenceoftheESAT-6proteininJVfycoZ)acfen力mf"6ercw/o57'sandvirulentA^vco6acfen'M淤6ov/sandforitsabsencein脚co6acfe〃'謂6ovz》BCG,"Infect.Immun.64:16-22)。至今还没有归属于ESAT-6的功能，但其在性质上是强抗原性的，刺激小鼠记忆免疫T淋巴细胞产生rf扰素，并可有助于出现抗结核病免疫性。(Andersen等，1995,"Recalloflong-livedimmunitytoA^co^Cer/wm励ercw/c^infectioninmice,"J.Immunol.154:3359-3372)。已鉴别出一种与ESAT-6共转录的新基因，称为//p。在//2p/ky加-6操作子中，已进一步鉴别出共13个潜在基因(或可读框，ORF),界定了一个新基因家族。结核分支杆菌//^基因产物已被确定为CFP-10,是一种10kD低分子量的培养浸润蛋白，还存在于短期培养浸润物中。(Berthet,F腸X.,1998,"AAfycoZ>acfen'w/tuberculosisoperonencodingESAT國6andanovellow-molecular-massculturefiltrateprotein(CFP-IO),"Microbiology144:3195-3203)。因此，CFP画IO和ESAT-6这二者在结核分支杆菌或牛分支杆菌中早期一起转录，均编码小输出蛋白。因为两种基因在任一个基因组中都彼此之间邻接出现，所以将由两种全长蛋白组成的融合蛋白重组抗原指定为我们测定的捕获探针。5ovz'gam资y试目前正在评价一组新的测试，其中在用这些生物体的特异性细菌表位刺激的情况下，评价接触结核分支杆菌或牛分支杆菌后由免疫系统活化的杀伤性T细胞产生y干扰素(IFN-力的情况。对牛应用的该测试叫做Bovigam,灵长类动物应用为Primagam,人类应用为QuantiferonTM。在这些测定中，取患者全血，与结核菌素(由结核分支杆菌或牛分支杆菌提取的蛋白)过夜温育。如果患者(人或动物)先前已接触了TB，则血液中的T细胞将产生以简单实验室测定可检测的IFN-y。此测试的优势在于测试血样的提取不干扰受试者的免疫状态，所以如果有需要可重复测试(皮试需要在复测前最少间隔60天)，并可用于检测早期感染病例。这些测试还能可靠地用于HIV感染个体和其它免疫缺陷个体，而皮试不能。全世界超过300，000头牛的实验表明，BovigamTM具有77-93.6%的灵敏度，相比之下皮试为65.6-84.4%。如果BovigamTM和皮试一起使用，则可实现甚至更高的灵敏度。^w朋映row都试迄今为止，已在涉及超过3,000名个体的临床实验中检验了QuantiferonTM。在QuantiferonTM的改进形式QuantiFERON-TBGOLD测试中，使用结核分支杆菌抗原ESAT-6或CFP-10(在A/A或Af6ov活动性感染早期表达的基因产物)替代结核菌素PPD。业已表明，ESAT-6序列由患结核病的非人灵长类动物(Kanaujia,G.V.等，"RecognitionofESAT-6SequencesbyAntibodiesinSeraofTuberculousNonhumanPrimates,"Clin.和Diag.Lab.Immunol,2004,11(1):222國226)和牛(Buddie,B.M.等，UseofESAT-6intheinterferon-gammatestfordiagnosisofbovinetuberculosisfollowingskintesting.VetMicrobiol,2001.80:37-46;Buddie,B.M.等，Useofmycobacterialpeptidesandrecombinantproteinsforthediagnosisofbovinetuberculosisinskintestpositivecattle.TheVeterinaryRecord,2003.615-620;Vordermeier，H.M.等,Useofsyntheticpeptidesderivedfromtheantigensesat-6andc&國10fordifferentialdiagnosisofbovinetuberculosisincattle.ClinDiagnLabImmunol,2001.8:571-8)以及人(Arend,S.M.等，AntigenicequivalenceofhumanT國cellresponsestoMycobacteriumtuberculosis-specificRDl-encodedproteinantigensESAT-6andculture-filtrateprotein10andtomixturesofsyntheticpeptides.InfectImmun,2000.68:3314-21;Arend,S.M.等，DetectionofactivetuberculosisinfectionbyTcellresponsestoearlysecretedantigenictarget6-kDaproteinandculturefiltrateprotein10.JInfectDis,2000.181:1850-4;Berthet,F.X.等，AMycobacteriumtuberculosisoperonencodingESAT-6andanovellowmolecular-massculturefiltrateprotein(CFP-10).Microbiology,1998.144:3195-203;Brock,L等，PerformanceofwholebloodIFN國gammatestfortuberculosisdiagnosisbasedonPPDorthespecificantigensESAT-6andCFP-10.IntJTubercLungDis,2001.5:462-7)的血清中的抗体识别。众多公开的临床研究已证实了检测针对ESAT-6和/或CFP-10的IFN-y应答(使用非BovigamTM或QuantiferonTM的方法)对检测TB感染的用途。(Dillon，D.C.等，MolecularandimmunologicalcharacterizationofMycobacteriumtuberculosisCFP-10,animmunodiagnosticantigenmissinginMycobacteriumbovisBCG.JClinMicrobiol,2000.38:3285-90;PathanA.A.等，Directexvivoanalysisofantigen-specificIFN个secretingCD4TcellsinMycobacteriumtuberculosis-infectedindividuals:Associationswithclinicaldiseasestateandeffectoftreatment.JImmunol,2001.167:5217-25;ShamsH.等，ContributionofCD8+Tcellstogammainterferonproductioninhumantuberculosis.InfectImmun,2001.69:3497-501;Smith,S.M.等，HumanCD8(+)TcellsspecificforMycobacteriumtuberculosissecretedantigensintuberculosispatientsandhealthyBCG-vaccinatedcontrolsinTheGambia.InfectImmun,2000.68:7144-8;VekemansJ.等，TuberculosiscontactsbutnotpatientshavehighergammainterferonresponsestoESAT隱6thandocommunitycontrolsinTheGambia.InfectImmun,2000.69:6554-7)。但是，这些研究一般使用实施复杂且不适于常规诊断用途的测试系统(例如纯化的淋巴细胞培养物、ELISPOT)。澳大利亚的实验已发现，QuantiferonTM测试的灵敏度和特异性分别接近的％和98%。相比之下，检测人TB感柒的皮试具有的灵敏度约为70%。i濕恭讨发试尽管BovigamTM、PrimagamTM和QuantiferonTM仅需要一次采血，迄今为止远比皮试和TB抗体4企测实验准确，但它们运行明显更昂贵，由于不能自动化而实施緩慢，结果要直到活化的T细胞淋巴细胞与牛分支杆菌或结核分支杆菌特异性抗原温育后24小时才能获得。而且，每次测试都要求新鲜血样，必须在采集的24小时之内测定。因此，这些测试对广泛筛选用途是不切实际的，最好用作较简单初始筛选方法测试阳性样品的证实测定。在英国，皮内比较颈结核菌素测试(SICCT/皮试)是唯一用于在牛中诊断TB的测试。因为一般认为Bovigam测试比SICCT测试的灵敏度高但特异性低，所以研究使用Bovigam根除感染畜群的可能性。常规PPD抗原和新近合成抗原都用于费用效果研究，以确定IFN测试是否有用。(defra.gov.uk/animalh/tb/forum/papers/tbf71.pdf)。已观察到血液检测在皮试变成阳性之前就得到检测结果，但整体经济利益可能不合理，原因是该测试的复杂性和每一动物的总成本。血液测试超越皮试的相关优势包括*减少了畜群处于移动限制中的时间长度*解除了皮试所需的要去牧场两次的需要.通过减少测试花费的时间降低了兽医和实验室费用.由于测试灵敏度增加而减少了清除感染所需的测试轮数*在感染的较早期检测牛感染能够在非常短的间隔内复测而不受阻碍，这在皮试中是一个问题(60天最短间隔)*高灵敏度，理论上在感染快速传播时适于查出更多疾病*辨别BCG接种的牛和牛分支杆菌感染的牛*结果分析更精确，而不是由受过培训的兽医主观判断皮肤反应皮试(SICCT或CFT)需要召集动物以给予测试，再在2-3天后读取结果。高度推荐由受过培训的兽医进行此工作，因为对于不熟练的技术人员该测试的灵敏度可j氐至20%。使用熟练并受过培训的兽医给予和读取测试所耗费的时间和金钱远比血清型测试多。尽管长期并持续地研究可才佥测针对牛分支杆菌的循环抗体的血清学测定，但迄今为止没有一个表现出能使它们适用作常规用诊断测试的足够灵敏度或特异性。(Wood,P.R.和Rothel,J.S.Invitroimmunodiagnosticassaysforbovinetuberculosis.1994,Vet.Micro,40:125-135)。反射辅助检测一一种快速、有效和高度准确地鉴别TB感染受试者的方法针对牛分支杆菌(MM;)感染的PriTest快速诊断测试提供了一种用于在牛中广泛筛选TB感染的理想血清学方法。其在许多方面优于皮试，需要少量的血清样品(单次采血的少至0.1ml的血清将为多轮测试提供绰绰有余的材料)。该测试在不足1.5小时的初始筛选中产生高度准确的结果，不需要高水平的技术知识。单次血样就满足所有需要，然后在实验室处理结果，在实验室中，结果可通过设备或软件自动化解读。所述测试对用于筛选大量牛是经济的，主要是因为测试设计中固有的高准确性使不得不复测的动物数最少。用反射辅助测试(RST)获得最终结果，、不必依靠以Bovigam为代表的更昂贵和复杂的测试。再者，血样可在任何时刻复测，不存在精确Bovigam测试所需的时间依赖性要求(15小时)。在PriTest快速诊断测试中免疫反应性不受影响，因为没有注射结核菌素，结果于1天内在实验室获得(包括初始筛选和对阳性样品的2次证实性反射辅助测试)。同BovigamTM—样，PriTest快速筛选测试对牛分支杆菌是特异性的，在牛分支杆菌和其它分支杆菌如副结核分支杆菌(M.;7ara&6e7rw/owX)感染之间提供了差示诊断。两种测试均不与BCG接种动物阳性反应。BovigamTM需要新鲜血样，具有必须在15小时内测试的特殊处理要求。PriTest的快速诊断测试仅需要血清用于测试，不需要特殊处理，以至于可收集样品乃至冷冻，以在之后的日子测试。典型测试包括使用MACFP-10/ESAT-6的重组融合蛋白捕获探针，其已缀合至用羧基丙烯酸聚合物包被的铁氧体颗粒。将限定量的珠分散在以l:50稀释在稀释緩冲液中的测试血清样品中，稀释緩沖液由10mMPBS、0.1%BSA和0.050/。ProClin组成。稀释的血清和珠于室温(RT)温育15分钟。然后使用钕磁铁将珠附着于样品容器的壁，再分散在清洗緩沖液中并收集两次。在优选实施方案中，可将一对球形磁铁排列在塑料块中，在样品容器支架(例如微离心管支架)的两側各有一个。已发现球形磁铁提供更强的局部磁场，用于更有效地由溶液中收集铁氧体磁珠。生物素化抗牛二抗用于标记已被铁氧体磁珠上的重组抗原捕获的牛TB抗体。在IO分钟RT温育后，再用磁铁将珠附着于容器如1.5mlEppendorf微离心管的侧壁上，再两次分散于清洗緩冲液中并重收集。然后将具有附着于牛抗体的生物素化抗体的珠与辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白(HRP-SA)温育5分钟，然后两次分散和清洗珠。然后将珠悬浮在1:1鲁米诺过氧化物溶液中，用光学成像仪如PriTestTOAD(参见例如2004年1月29日提交的美国临时专利申请60/540,720，其通过引用结合到本文中)检测化学发光。例如，图像可在全黑室中持续10分钟获得，以准确检测对应于结合至珠的抗体水平的光子图像。可使用软件包(例如Slider3.6版，参见2003年2月24日提交的美国专利申请序号10/373,408)在一次过程中处理达12个样品。基于参比阴性对照血清计算阳性或阴性的指定值。目前每个样品池除具有阴性对照之外还具有多达11个测试样品。将以数值给出的观测信号输入到自动化程序中，该自动化程序通过将观测到的样品值减去样品池背景计算各个样品的相对发光度(RL)。然后通过将各个样品的RL减去阴性对照(由具有TB测试阴性的约10个牛血清的合并样品组成)的RL，计算各个样品的相对发光度增量(ARL),并进行统计学调整以设定样品必定读为阳性的阈值标准。指定样品为牛分支杆菌抗体阴性或阳性的阈值或截断值由程序中包含的预置算法确定。在第一轮筛选中测试阳性的样品在第二轮中复测(反射测试#1)。在此第二轮中测试阳性的样品再在确证轮次中复测(反射#2)。在反射研究中的任何点处测试阴性的任何样品都被确认为阴性。在反射#2后测试为阳性的样品在分配中被确认为阳性。单次测试不会永远一致地产生100%确定的有效分离感染动物所需的灵敏度和特异性水平。反射辅助检测包括有意以其中预期假阳性(即为100%或接近100%灵敏度)的阈值测试，因为检测阳性的阈值已被设定得低到足以捕获100%阳性感染动物。然后通过再使用相同测定在第二批中测试所有测试为感染阳性的动物，笫二批未感染的动物安全获释。反射辅助检测过程在步骤上是连续的，在每个周期只复测测试阳性的动物，直至只有真阳性隔离动物被证实为止。该测试方法快速集中于感染动物，同时使测试为假阳性的动物复测为阴性，如果它们实际上未被感染。其在准确证实感染动物方面比单次筛逸测试更有效。需要多少反射辅助检测来有把握地终止复测？太多的测试是无价值的，因为耗费了时间、金钱和资源。该数量可容易地计算。血清阳性和血清阴性动物具有的测试值均可在实验中容易地测定。可以确定感染(阳性)和未感染(阴性)动物这二者的值的正常分布曲线(参见图10)。分布曲线不必是对称的(如所示)，实际上如图10所示有重叠。如果阳性和阴性两条曲线不重叠，则曲线间阈值容易以100%特异性和灵敏度区分开感染牛和未感染牛这两种群。但是即使曲线重叠，如牛中TB的情况，也可选择处于所有测试的感染(阳性)动物左侧(值较低)的阈值。在该阈值分配下，所有真阳性动物100%被准确检测(即假阴性为零)，虽然一些未感染牛将被假性鉴别为阳性，这可通过检验图10观察到(即一部分"阴性血清"曲线位于阈值右側)。但是，可以看到的是，随着反射检测的每轮往复，假阳性结果数快速下降。射辅助检测而属于图10所示两条曲线中的一条，并可根据测定中使用的阈值而被指定为阳性或阴性结果。预期该值将处于适宜曲线(感染的或未感染的)下的任何位置，不一定非常精确地重现先前检测值。预测方差，其由分布曲线形状确定。最佳的RST数(N等于重复测试的轮次数)取决于3个因素一处理样品的总数(X)、测试样品数中确实感染的牛的数量(流行率)以及低到足以将所有确实感染的牛准确指定为"阳性，，值的阈值的特异性。随着每轮测试进行，一定百分率的实际未感染样品由即将测试的样品组中去除。反射辅助检测导致每一轮都增进了准备进行随后测试的阳性相对于阴性的百分率。该方法等同于增加流行率，使检测的阳性预测值随着过程中的每轮复测变得更好，图10显示了由筛选至反射#1、反射#2等的相对分布的变化。群体中阳性相对于群体中阴性的比率随着每轮测试增加。优化的RST使假阴性测试相对于阳性测试总数最小。用于优化的测试总数作为一个和来计算测试总数(筛选+RST)=X{1+F+F2+F3+...FN}其中F是取决于特异性的假阳性因子F=1-特异性假阳性数=F{(X-真阳性数)}X=总样品处理数N=优化的RST数假如流行率为在待测试的样品总数中有1头感染动物，则我们可以通过设定最小标准以消除1个假阳性动物，以合理的特异性优化。(假定特异性明显大于50%,本文公开的代表性方案就是这样)。这等同于将最后一轮总和设定为值1,使得可以根据样品总数(X)和特异性计算N。XFN=1N={Log1-LogX}/LogF筛选中初始测试的特异性、流行率和数量将决定对于100%灵敏度的给定测定而言有把握地将牛指定为感染或未感染所需要的反射辅助检测总数。如图11所示，对于100-500,000头牛的样品中有1头真阳性动物来说，表2计算了相对于0.70、0.74(代表性研究)、0.90和0.99特异性的RST数。显然，特异性越高，需要的总测试就越少，然而，RST方法在3-4轮内就在一个IOO头动物的畜群中快速鉴别出确实感染的动物。优化RST数揭示出在血清阴性(未感染)牛的平均值之上约1.6个标准偏差的阈值将在当前的PriTest快速Mbv牛测定中产生100%灵壽文度、74%特异性。在单次筛选和3次反射辅助检测中，对于一个1000头牛的畜群，阳性感染动物应^皮鉴别4个动物中的1个，其可通过另外4次测试进行阳性鉴别。在这些条件下，对一个1000头动物的畜群，阳性鉴别单个感染动物的测试总数为1348。因此，可以看出，即使采用多轮反复的反射检测，需要的测试总数相比于畜群大小也是相对较低的。用于病原体或标记检测的装置本发明的某些实施方案涉及用于病原体和/或标记分子检测实验的装置。阐述本发明的代表性实施方案的其余细节公开于2001年10月10曰提交的美国专利申请序号09/974,089、2002年10月9曰提交的美国专利申请序号10/035,367、2003年4月29日提交的美国专利申请序号10/425,222、2003年2月24日提交的美国专利申请序号10/373,546、2003年2月24日提交的美国专利申请序号10/373,408以及2004年1月29日提交的美国临时专利申请序号60/540,720，各个专利的内容全文通过引用结合到本文中。全义夢縱袭f(T04D)图12阐述了全光学测定装置(TOADTM)的非限制性实施方案。在该实施例中，TOADTM包含具有铰链盖1220的不透光外罩1210。当关闭盖1220时，外罩1210阻断外部光进入TOADtm内部，使得可对待分析样品的生物发光或其它发射光进行高度灵敏的检测。打开盖1220,露出镜台1230。要成像的装置，包括但不限于GRABBER载玻片(参见下文)或^:量滴定孔装置，可定位在镜台1230的顶部。镜台下面是单聚焦透镜(未显示)，其安放在CCD(电荷耦合器件)芯片或其它光传感器(未显示)的顶部。可通过将载玻片或孩i量滴定孔对准镜台1230顶部上相应成型的凹槽将它们定位在镜台1230上。外罩1210可包含凹槽、把手或其它有利于移动TOADtm的部件。图13图解说明了TOAD，代表性实施方案的示意图，外罩1310的主体被移开，露出内部元件。盖1320覆盖镜台1330,镜台1330用于将载玻片、孩t量滴定孔或其它装置定位在CCD芯片之上，CCD芯片位于成像装置1350顶部。在一个非限制性实例中，成像装置1350是QICAM10-位单色冷却CCD照相机(QimagingTM,Burnaby,B.C.,Canada,目录号弁QIC-M-10-C)。但是，TOAD顶不限于代表性实施方案，设想可使用其它已知类型的成像装置1350。单聚焦透镜(未显示)插入CCD芯片和镜台1330之间，可连接至成像装置1350顶部，例如4吏用C-mount才妄座。在代表性的实施方案中，成像装置1350除了包含CCD芯片以外，还包含围绕着CCD芯片的Pelletier热交换元件。成像装置1350的余下部分包含用于处理CCD芯片检测的信号的电子元件，连同供电连接、软件界面和外部数据口，例如6-针火线接口。Pelletier热交换器除去CCD照相机1350中的热量，将热量释放到外罩1310内部。为了防止TOADTM过热，将独立风扇驱动冷却装置1340定位在邻接成像装置1350顶部。冷却装置1340驱动热空气通过外罩1310背部(未显示)的不透光通风孔离开外罩，通过外罩1310内部循环冷空气。在标准操作中，冷却装置1340足够有效地运行，使得CCD照相机1350可在没有过热的情况下连续操作。CCD照相机1350过热导致背景噪音显著增加，在整个CCD芯片光场中产生随机突发的表观光检测。成像装置1350安放在基座1360顶部，基座1360将成像装置1350保持在相对于镜台1330的适当位置。基座1360的底部敞开，以允许达到成像装置1350底部的通断开关和供电接口(例如110伏AC电线)、火线以及任何其它外部接口。图14是一幅示意图，显示了TOADTM代表性实施方案的顶示图，外罩1410被移开，露出镜台1420的上表面。凹槽l430、1440显示在镜台1420顶部，排列得允许载玻片、微量滴定孔或其它装置定位在CCD芯片之上。镜台1420中心的孔1460允许光通过载玻片、微量滴定孔或其它装置传播，并通过下面的CCD芯片1450检测。对技术人员显而易见的是，使用如在下文更详细论述的透明或半透明装置有利于TOADTM仪器的应用，一个光学检测器位于该装置下方，以通过光学方法读数。以上讨论的代表性实施方案设计用于光学检测自发发射光的样品，例如使用任何已知的化学发光或生物发光检测系统，例如以下公开的鲁米诺系统。在此情况下，不需要外部激发光源检测结合的分析物。技术人员将认识到，可利用替代系统，例如结合靶分析物的荧光标记检测分子。逸种系统在本领域众所周知。荧光检测系统的使用应需要额外组件，例如激发光源(例如激光、光电二极管阵列等)、筛选激发光的光电检测器的截止滤光片以及其它此类已知用于荧光检测系统的组件。上文讨论的说明性实施方案具有建造和使用简单、低成本和靶分析物检测灵敏以及背景噪音最小的优势。栽玻片在某些实施方案中，光学冲全测可与作为病原体和/或标记分子抬r测用结合表面的芯片、基质阵列和/或载玻片(例如显孩"竟载玻片)组合使用。各种载玻片基质是已知的，如下文所述。传鍵^遽效戎破^玻璃或塑料显微镜载玻片通常用作^(鼓阵列分析的固体基质支持体。使用交联化合物将探针分子连接至玻璃或塑料表面。(参见例如Schena,MicroarrayAnalysis:J.Wiley&Sons,NewYork,NY,648页，2002)。探针可以2D斑点阵列印刷。许多不同种类的交联剂是已知的，取决于探针分子上可用反应部分的类型(例如巯基、氨基、羧基、苯基、羟基、醛等)，所述反应部分可交联至表面，而不影响探针官能度(例如靶分子结合)。先前探针连接方法的问题是连接能力有限。随着探针大小增力口，针对预期靶分子的可能结合位点数一般下降。如果探针的结合位点在低于检测阈值的水平被饱和，则观察不到信号，即便探针和靶分子已发生结合。已尝试使用抗生物素蛋白包被载玻片和缀合生物素的探针分子将探针连接至玻璃表面。另一方面，将硅烷如氨基硅烷或3-缩水甘油醚氧基丙基三曱氧基硅烷包被到玻璃表面上，硅烷部分连接至玻璃，反应部分交联至探针分子。其它方案使用用具有官能性醛、羧基、环氧或胺基的反应性底物包被的载玻片，所述基团可与探针分子形成共价键，将探针分子永久附着于玻璃表面。尽管这些方法对于小探针分子实施得相当适度，但它们对较大探针分子(例如抗体)往往实施得较差，在较大探针分子中官能性(结合)可能取决于探针方向、灵活性和交联程度。共价连接方法往往还将极少量物质结合至基质表面。因此，探针浓度低，信号检测难。因为在2D阵列表面上可用的4笨针相对少，这种系统对探针和耙之间的阳性结合反应显示出低信噪比。经常使用抗体作为捕获分子检测蛋白或肽靶分子。用于临床诊断或蛋白质组学的二维阵列经常使用抗体作为蛋白或肽靶分子的探针。尽管抗体对其靶抗原往往是高度特异性的，但它们不易用交联剂和标准方法连接到玻璃或塑料表面。这是因为可用已知化学物质将有限量的物质附着至基质，导致在靶结合时产生弱信号。另一个被保持。因此，抗体偶合固体基质阵列的长期稳定性往往是有限的，获得由阵列使用期限而定的不一致结果。已尝试通过建立稳定蛋白并保存其功能性探针特征的环境来解决此问题。例如，Prolinxlnc.(Bothell,WA)已使用具有固定于其表面的聚合物刷形式的标准玻璃载玻片开发出一种化学亲和性系统。该系统依赖于形成稳定复合体的两种合成小分子苯基二硼酸(PDBA)和水杨羟將酸(SHA)之间的相互作用。(例如Stolowitz等，BioconjugateChem.12:229-239,2001)。PDBA首先与蛋白探针缀合。然后将缀合探针与连接至聚合物刷的SHA缀合，以形成3D功能阵列。该方法受可结合至表面的抗体量限制。更重要的是，靶抗原必须足够小，以通过刷边界扩散，以便与固定至基质的抗体反应。此方法不适于鉴别和/或定量较大靶，例如全细胞或细菌。^^邊效裁放^高度需要稳定或增加连接至基质阵列的探针量的方法。这种方法一般产生不透明载玻片，因为用于增加探针结合和保持稳定性的基质材料通常包括不透明凝胶、水凝胶、琼脂和包被在玻璃表面上的其它材料。连接至此不透明基质材料的蛋白在三维阵列中通过疏水和静电作用稳定。当前用于基因组和蛋白质组学微阵列的大部分扫描仪由与结合探针和乾分子相同的一侧读取使用不透明基质阵列的载玻片。用于生产孩么阵列的不透明基质包被材料包括尼龙、PVDF(聚偏二氟乙烯)和硝酸纤维素。硝酸纤维素是一种应用超过50年的传统聚合物基质，是一种对微阵列应用具有非常吸引人的特性的基质。(例如Tonkinson和Stillman,Fra油'era说oycz'ewce7:cl画12,2002》不透明硝酸纤维素已广泛用于固定用于生物分子分析的蛋白和核酸。硝酸纤维素以接近定量方式固定目标分子，允许短期和长期储存。硝酸纤维素还允许溶液相靶物质有效结合固定的捕获分子。使用ELISA方法的诊断装置使用硝酸纤维素膜，以側向流方法将捕荻试剂结合至膜(Jones,/TOrec/mo/ogy,5(2):32，1999)。传统不透明膜材料具有大量引人关注的特征。它们建造廉价，结合的蛋白量是包被连接物的玻璃载玻片可结合蛋白量的100倍以上，一般易于操作。对具有长期使用史的不透明硝酸纤维素膜来说尤其如此。硝酸纤维素膜一般以-欽孔形式生产，该形式可应用于玻璃载玻片表面，以形成不透明表面。然后可使用标准硝酸纤维素结合方法将探针连接至微阵列中的不透明硝酸纤维素膜。这种栽玻片已用于放射性、荧光和化学发光检测系统(例如Brush，TheScientist14[9]:21，2000)。在没有支持结构或基础的情况下，传统硝酸纤维素膜也是非常脆弱的，导致经常裂化或碎化。为此，已经以结合塑料片的微孔形式使用不透明硝酸纤维素。这种片由于微孔形式而经常是不透明的，需要支持结构(例如乙酸酯或纤维素)来避免处理过程中的损伤。羊邊银裙凝卑举;^4'破,本文公开的方法和组合物可用于生产胶状硝酸纤维素的半透明表面涂层，其保留了不透明硝酸纤维素膜的有利结合特征，同时允许使用排列在载玻片底侧(非结合侧)上的检测器。可直接观察半透明硝酸纤维素固体基质上探针和靶分子的结合。在某些实施方案中，可使用半透明硝酸纤维素基质阵列。在这种实施方案中，半透明硝酸纤维素基质可附着至玻璃或塑料载玻片(例如尼龙)的一侧。探针可连接至硝酸纤维素，用传感器或照相机通过载玻片观察探针和靶分子之间的相互作用。如果按照公开的方法形成，则硝酸纤维素材料是完全透明的(即透光的)。因此，光信号可在没有不透明材料分散或千扰的情况下观察。相比于不透明-徵孔硝酸纤维素基质阵列，这允许更大的信噪比和易于检测靶分子。这种不透明基质阵列可使輩巴分子结合时产生的部分光或反应指示剂物质(例如生物发光化合物)变暗。电子显微镜技术人员已使用处于乙酸戊酯溶剂中的胶体形式硝酸纤维素制备标本铸件。胶质硝酸纤维素通过在水面上铸成超薄膜形成。所述膜随后可挑起在透射电子显微镜(TEM)格栅上，用作TEM标本的支持膜。因为该膜必须非常干净和均一，所以其生产要非常小心地操作。胶质硝酸纤维素容易溶解在乙酸戊酯中。乙酸戊酯是水溶性的，均匀挥发以形成均一膜。以非常纯的硝酸纤维素的1%溶液提供。高纯度硝酸纤维素的EM级乙酸戊酯溶液(Collodion)可由商业来源购买。乙酸戊酯通过经氧化钩回流去除所有水分来纯化。可溶性和悬浮的材料通过緩慢蒸馏去除。去除溶剂中的所有痕量水分允许形成实际上没有孔的非常强的"交质硝酸纤维素膜。在一个代表性实施方案中，由ErnestFFullam,Inc.(Latham,NY)获得散装Collodion,用于生产高质量半透明硝酸纤维素基质阵列。将等份的2001%Collodion溶液用滴管吸取到刚清洁过的标准25x75mm玻璃载玻片上。在无尘区中均匀地将Collodion涂布在玻璃栽玻片表面的边缘。于室温干燥2小时后，将载玻片于约60'C再加热l小时或以上。标记干燥的载玻片，储存用于生产^:阵列。当使用玻璃阵列表面时，每块载玻片的边缘都用漆(例如指曱油)或其它胶粘剂密封，以在接触水性溶液时防止超薄硝酸纤维素基质与玻璃分离。当将胶质硝酸纤维素应用于尼龙载玻片、乙酸酯膜或其它塑料表面时，其不需要胶粘剂而紧密结合。载玻片可由几乎任何的半透明材料组成，只要乙酸戊酯不与表面反应而使其脱色或改变其特性。某些类型的塑料在接触乙酸戊酯时变成不透明的，不适于和该溶剂系统一起使用。在替代实施方案中，胶质硝酸纤维素可悬浮在非乙酸戊酯的其它挥发性有机溶剂中，之后应用到尼龙、玻璃或其它半透明载玻片。半透明硝酸纤维素表面的优势在于可透过载玻片的半透明下表面查看来检验探针结合反应的进展。这允许发生更有效的探针结合。探针-耙结合反应的进展也可透过栽玻片下侧实时监测。某些实施方案可涉及使用半透明包被载玻片的装置和方法，例如如上文所公开的内容制备的GRABBER载玻片。提供溶液中的一种或多种目标靶的方法。可提供用固定捕获探针(例如抗体)预打点的载玻片，准备用于即时测试。或者，想制备其自身2D-点阵列的用户可在1小时内制备用于测试的人工阵列。在某些优选实施方案中，4全测方法利用一抗捕获抗原靶，以与生物素标记或其它方法标记的二抗形成免疫复合物。一抗探针附着至半透明硝酸纤维素包被的载玻片(GRABBER),并在整个程序当中保持附着在载玻片表面上。如果形成免疫复合物，则可使用众所周知的酶活化生物发光方法检测。例如，辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化物分解，如果在分解过程中将鲁米诺加入到溶液中则产生强光。鲁米诺形成不稳定自由基中间体，其在430nm产生光子释放。通过缀合HRP至链霉抗生物素蛋白(SA),可用合适和壽文感的光子检测器检测免疫复合物。生物素和链霉抗生物素蛋白快速组合，形成此发光的复合物。典型蛋白(例如抗体)探针可以0.05-0.2mg/ml浓度、1-5nl流体/点打点。在一抗连接至载玻片、基质阵列或其它表面时，标记二抗如生物素化抗体可在稀释緩沖液中提供，并以针对靶检测优化的浓度与预打点载玻片预混合。优化浓度可由用户根据经验确定。二抗可在稀释緩沖液中稀释至通常5-30|Lig/ml的浓度范围。TOAD(全光学测定装置)可配有软件，以为用户提供读取、解释和记录载玻片表面信号的工具。图像文件和报告可保存或印刷，用于随后的分析和比较。GRABBERtm栽玻片可用半透明硝酸纤维素基质包被(参见2003年2月24日提交的美国专利申请序号10/373,546),该基质紧密和即时地结合蛋白、糖和/或寡核苷酸，使它们强烈附着于包被表面，同时保留结合分子的官能度和3D结构。不需要其它化学过程将探针附着至载玻片表面，使2D阵列方法简单而快速。具有良好接触角的疏水表面非常适用于紧凑的机器人印刷阵列。生物发光反应持久，信号可在延长时段内获得，允许非凡的检测灵敏度。可同时鉴别单个样品中的多个靶。合适的探针一抗和生物素化二抗应与靶强相互作用，用于适合的检测。对提供的预印刷载玻片和试剂进行优化，以产生高质量检测。技术人员会认识到，半透明包被载玻片仅仅是检测靶结合的一个优选替代者，对于光学检测系统可使用其它替代者，如下述磁珠。在某些实施方案中，可重构微阵列可通过使用结合至固体基质表面的小连接分子如适体或亲和体生产。适体是由一种叫做SELEX的体外进化过程衍生的寡核苷酸(例如Brody和Gold,Mo/ecw/ar说o&c/2Wo/ogy74:5-13,2000)。适体可通过已知方法(例如美国专利第5,270,163、5,567,588、5,670,637、5,696,249、5,843,653号)产生，或者可以得自商业来源(例如Somalogic，Boulder,CO)。适体是约7-50kDa的相对较小的分子。因为它们小、稳定并且不和蛋白一样容易受损，所以它们可以较高量结合至固体基质表面。这有效增大了阵列表面上的探针反应位点数。Affibody⑧配体(美国专利第5,831,012号)是高度特异性的亲和蛋白，可象适体一样设计和使用。亲和体可生产或由商业来源(AffibodyAB,Bromma,Sweden)购买。适体和亲和体可与抗体组合^f吏用，以增加半透明或不透明固体基质对于探针分子结合的功能亲和性。增加结合又产生增加的信号强度、变大的信噪比、更可重现的靶分子检测和更高的检测灵敏度。可重构微阵列可与两种抗体和捕获探针组合使用。捕获探针可为亲和体、适体或能够结合其中一种抗体的任何其它探针。两种抗体都应选择性结合靶细胞、分子或抗原。如果捕获探针结合一部分有IgG型特征的抗体，则结合的效力增加。这种探针应仅需要一小部分抗体结构存在，以便与抗体-靶复合物反应并结合。众多抗原覆盖的较大靶，例如孩t生物或细胞，可与抗体形成非常大的复合物。但是，截短的IgG抗体片段可与这种大靶相互作用，并仍结合载玻片表面上的适体或亲和体探针。在某些实施方案中，使两种抗体结合溶液中的耙。一旦形成革巴-抗体复合物，复合物就可接触可重构基质阵列上的适体或亲和体探针分子D所述探针可结合一抗，而二抗可缀合至生物发光标记或其它标记。然后可使用光学检测或任何其它已知的检测方法检测基质阵列表面上的标记复合物。例如，适体可被修整得以高亲和性特异性结合小鼠IgG的Fc部分。可使含目标靶分子的样品与对目标抗原特异性的小鼠抗体在溶液中相互作用。样品与结合相同抗原上不同表位的不同生物素化或其它方法标记的二抗(非小鼠抗体)混合。结合一抗和二抗的靶抗原接触适体微阵列。抗小鼠适体使复合物附着至固体基质。在彻底清洗以去除未结合的标记抗体后，才企测连接至基质阵列表面的含标记抗体的复合物。技术人员会认识到，可使用该方案的许多变更方法。例如，在替代性实施方案中，一抗可与多种标记二抗联合使用，其中每一种标记二抗都结合靶分子的不同表位。这例如可发生在可用的二抗是多克隆抗体的情况下。或者，使用一种以上的对相同抗原具有亲和性的二抗可提升检测灵敏度。在另一个替代实施方案中，一种二抗可结合一类靶(例如所有大肠杆菌细菌)，而一种二抗结合特定亚型(例如大肠杆菌菌抹0157:H7)。t在一个非限制性实例中，为检测单核细胞增生利斯特菌("Weha附owoc声oge"e),可将IgG小鼠抗单核细胞增生利斯特菌抗体以合适的浓度(通常1-50)Lig/ml)与目标食品样品温育。可加入兔(或其它非小鼠)生物素化抗单核细胞增生利斯特菌二抗(1-50吗/ml),并温育5-30分钟。然后可将具有两种抗体的样品应用于含抗小鼠IgG适体的阵列。相隔短时间(约15分钟)后，可清洗阵列，以便仅与单核细胞增生利斯特菌复合的小鼠IgG和兔生物素化抗体保留在阵列上。然后将缀合HRP的链霉抗生物素化蛋白或其它指示剂的溶液施加于表面，这可揭示存在或不存在附着于表面的抗单核细胞增生利斯特菌抗体复合物。磁珠在某些实施方案中，探针、抗原或其它目标配体可附着至磁珠，用于分离和/或检测乾结合。磁珠使用方法的其它细节公开于以下的实施例部分。在优选实施方案中，附着于珠的探针、抗原或其它配体可为蛋白或肽，例如抗体、抗体片段、抗体结合蛋白(例如A蛋白)或靶蛋白。将分子偶联至磁珠或磁性基质的方法在本领域众所周知，即美国专利笫4,695,393、3,970,518、4,230,685和4,677,055号。连接可为共价的或非共价的。许多潜在的化学交联剂在本领域众所周知，包括EDC、二硝基苯、双亚氨酸酯、辛二酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、3,3'-二硫代-双丙亚氨酸二曱酯、4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯基叠氮、双琥珀酰亚胺酒石酸酯和叠氮乙二醛。可预见的是，使用的磁性粒子可为各种大小。尽管大磁性粒子(溶液中的平均直径大于10ium)可响应于弱磁场和》兹场梯度，《旦它们往往快速沉降，限制了其对需要均一条件的反应的可用性。与较小颗粒相比大颗粒还具有更有限的表面积/重量，以至于很少有材料可与它们偶合。在优选实施方案中，磁珠直径小于10pm。铁磁材料一般在磁场作用下变成永磁性的。称为"超顺磁，，的材料在磁场梯度中受力，但不变成永磁性的。磁性氧化铁晶体可为铁磁性的或超顺磁性的，这取决于晶体大小。超顺磁铁氧化物一般在晶体直径小于约300埃(A)时产生；较大晶体一般具有铁磁特征。可按照美国专利第4,267,234号，在聚环乙亚胺存在下通过碱沉淀氯化亚铁和氯化铁(？62+/63+=l)制备据报道具有300A直径和表面胺基的可分散磁性氧化铁颗粒。在制备过程中这些颗粒暴露于磁场3次，描述为可再分散的。磁性粒子与戊二醛悬浮聚合系统混合，形成具有报告直径0.1|nm的磁性聚戊二醛孩t球。聚戊二醛獨:球在表面上具有缀合醛基，其可与含氨基的分子如蛋白形成键。尽管预期各种颗粒大小可应用于所公开的方法，但在优选实施方案中，颗粒在约0.1至约1.5jxm直径之间。具有该范围平均直径的颗粒可产生高达约100-150m2/g的表面积，提供了高生物亲和性吸附偶联的能力。该大小范围的磁性粒子克服了较大颗粒的快速沉降问题，消除了对产生磁场的大磁铁和分离较小颗粒所需的磁场梯度的需要。用于实现磁性粒子分离的磁铁仅需要产生约100至约1000奥斯特的磁场。这种场可用永磁铁荻得，永磁铁优选小于支持磁力粒子分散的容器，并因此可适于桌面使用。尽管铁磁颗粒可能在本发明的某些应用中有用，但通常优选具有超顺磁特征的颗粒，因为超顺磁颗粒不表现出与铁磁颗粒相关的磁性聚集，允许再扩散和再利用。在一个优选实施方案中，可将一对球形磁铁与容器如1.5mlEppendorf管并置，用于将磁珠收集到管侧上。球形磁铁的使用提供了一个更强的局部磁场，其有利于磁珠与溶液的分离。制备磁性颗粒的方法可包括在碱中沉淀金属盐，以形成磁性金属氧化物晶体，在水和电解液中再分散并清洗晶体。如果晶体是超顺磁的，则可在清洗之间使用磁性分离收集晶体。然后可用能够吸附或共价键合金属氧化物并携带与蛋白或其它配体偶联的官能团的材料包被晶体。磁珠的商业来源在本领域也是已知的，可使用例如DynalBiotech(BrownDeer,WI，USA)。成像铝蜂窝芯盒在一个代表性实施方案中，成像蜂窝中心单元盒是例如上文讨论的TOADTM的光学成像仪上用于成像和检测发光度的一^7iH。其通过镜台上的两个锁定销定位和保持在适当位置，以提供盒相对于CCD照相机的正确方向。盒的下表面(底部)是贴附于蜂窝铝芯的光学透明窗。标记盒的不透明上(顶)表面，以形成用于注入蜂窝中的单个单元的模板。贴附于蜂窝顶部的其内表面是高度反射性的，将光子传输回传感器，要不然它们会逃脱检测。中心单元55型盒可一次过处理总共55个样品。但是，在要求保护的主题范围内显然可使用不同配置和数量的单元。盒的建造包括将覆层切成合适的大小，按式样将铝蜂窝切成约2.75x2.75英寸见方的方块。冲切底部透明层，并冲出锁孔，然后将其贴至铝蜂窝(见图19)。最后一步是贴附上覆层模板，其为操作者提供了注入单元的指引。贴附下覆层至蜂窝应如下进行首先将胶粘剂(例如活化的玻璃纤维树脂)粘附于蜂窝下表面，然后注意避免弄污光学窗，将蜂窝置于下覆层上以粘合。可如下容易地完成铝与乙酸酯的稳固粘合用玻璃纤维树脂和催化剂轻轻涂在浸于一浅盘树脂中的蜂窝下缘，然后在没有任何加重的情况下让其于乙酸酯上保持静止不动。可由0.250"x48"x96"、1/4英寸单元、5.2密度、未穿孔芯、照明产品用外观分级的原料切割铝蜂窝，要注意所要求的样式如下所示，认识到水平切割仅平分单元，垂直切割以直线平分单元和结点。切割公差要求是保持在由每一切割的完整长度开始的1/4单元行或垂直列之内。在优选实施方案中，下覆层是7mil的透明冲切聚酯薄片，2.64x2.64英寸见方，与标准Avery标签5196正好相同大小。上覆层是具有底衬面的标签原料，贴附至铝蜂窝，也计为2.64x2.64英寸见方，沖切至标准Avery标签5196大小。上表面以模板样式印刷，或者贴附Avery5196印刷标签。模板孔被叠边(KISS)沖至衬层，以便移液枪头可轻易穿过上覆层，内容物分配入单元。祐遂游合^/有几种可能的粘合剂可使用。聚酯或环氧树脂应适用。粘合要求是极小的，所以环氧树脂提供的较大强度看起来是不必要的。聚酯树脂已成功使用。树脂应与粉末填充剂混合，以在固化期当中增厚树脂，使得几乎没有树脂流到聚酯薄片上，因为其凝固了。推荐铝粉末，因为其也使粘合剂完全不透明，一个单元至下一个单元的交叉光污染最小(在门漏缝的情况下)。辦舰代表性的材料列表和每个盒的尺寸显示于表11,蜂窝尺寸相近。蜂窝样式冲切比确切的尺寸更重要，因为最终组装将单元窗居中定位在照相机上。技术人员会认识到，可使用替代尺寸。表ll:材料列表原材料铝％，，单元0.25"x48"x96"聚酯1008267mil厚度高反射性标签板约7mil厚度锁销孔大小锁销位置4竟台孔径量度盒尺寸2.75"x2.75"2.64"x2.64"(Avery5196)2.64"x2.64"(Avery5196)大3/16",小1/16"中下覆层，中心到中心2.375，2.375"关于覆层布局和沖切、铝虫奪窝和用锁孔定位蜂窝的其它细节在下文讨论的示例图中提供。注意，在代表性实施方案中，锁孔在透明覆层贴附至蜂窝之前预沖出，如图22所示排列。关键单元居于光学孔径的中心上排列。在优选实施方案中，整个蜂窝单元结构可同时进行光学检测，关键(中间)单元居于光学孔径的中心上。贴附至盒的不透明上模板为操作者提供了将样品载入孔中的直观指引。盒中的每个单元都有地址。地址依据行及该行中的编号(参见图20)，但可使用替代的编号方案。在说明性的代表性实施方案中，有9行，称为A、B、C、D、E、F、G、H和I，行中各个单元的位置编号如图20所示。例如，中心单元的地址是E4。载样模板可印刷至盒的上表面，引导操作者栽入单元样品，并在成像前去除(参见图23)。在代表性实施方案中，用于载样的上模板与标准Avery5196标签具有相同大小，计有2.64英寸见方，在每个冲切标签原料的8.5x11英寸薄片中印刷9个模板。在才莫板上有55个单元入口。入口由样品用的行和数字进4于编号和识别。55单元实施方案的孔位置显示于表12。水平方向上由模板的左边缘(左上角的指示符)向孔中心进行检测，垂直方向上从模板边缘(O英寸)开始由顶部向底部进行检测。中心单元水平位置(Eh4)的坐标是1.32英寸，垂直位置(Ev4)是1.32英寸。表12:55型单元模板的水平和垂直坐标55型盒各个单元的坐标行A、B、C、D、E、F、G、H、I位置指示编号(参见蜂窝ID图)水平尺寸2.64英寸由左至右开始检测(以"h"指示)垂体尺寸2.64英寸由上至下开始检测(以"v"指示)中心单元坐标1.32英寸水平的和垂直的<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>T-B大片铝芯材料的代表性冲切图案如图21所示。计约2.75x2.75英寸的薄片中的各个方块应具有如图23所示的完整单元结构。这些单元的边缘不需要修整或抛光。它们应当被干净地冲切，没有颗粒物和磨损(洗干净)。实现目标的冲切图案以局部特写示于图22,完整薄片示于图21。铝芯的沖切方块应干净地、没灰尘和颗粒物地在细心包装的盒子中的塑料袋内传送，以免在路上受到损伤。图^^r测和数据分析在各个实施方案中，如实施例1所例举的，可通过例如分析化学发光靶-配体复合物发射的光学信号检测阳性测定结果。用于光学信号检测和分析的各种方法和装置是本领域已知的，可用于要求保护的方法。例如，互补金属氧^:物半导体(CMOS)成像传感器用于数码照相机，并逐渐可见于各种分析仪器。CMOS成像传感器质量正在提升中，对于检测低水平光谱图像正挑战并取代电荷耦合元件(CCD)成像仪。大部分现代光检测器设计用于通过提供对靶敏感的光电二极管二维阵列捕获光谱信号。光电二极管设计用于在接触光时产生电流，产生的电流可以各种方式分析。现代传感器将模拟光电二极管信号转变为数字信号形式，然后可储存并处理数字信号形式，用于后续分析。高分辨率数码图像可用合适的光源、光学系统、图像传感器和计算机逐像素产生。使用此系统，可获得单色或彩色形式的照片。但是，光电二极管将产生与仅在特定环境中撞击光电二极管的能量相关的模拟输出信号，例如在通过特定波长的单色光使靶发光时。即使光电二极管的输出信号相对于施加于光电二极管的发光基本上是线性的，像素的信号值一般也不与光子通量精确相关。这是因为将光子通量转变为光电二极管电能的量子效率(QE)随某些因素变化。另外，在大部分情况下，一种以上波长的光将撞击光电二极管。每个光电二极管都具有一定的QE值，其将随波长和温度之类的因子变化。光子通量代表撞击二维阵列表面的电磁能量，QE代表光电二极管将该能量转变为电能的能力。QE通常表示为能流的百分率，等于低于100%的某百分率。因为QE随照射光电二极管的光波长大幅变化，所以一个波长的^f言号与另一个波长的信号的比较难以解释，除非对应用的所有波长来说QE系数都是已知的。此外，生产商设计的大部分图像传感器产生的图像与胶片上或人眼应观察到的图像接近等同。生产商对重现"栩栩如生"的照片和颜色感兴趣。生产商可提供对每个像素的原始数字信息的存取，但图像传感器一般在该信息可用于分析之前处理该信息，以更好地呈现代表人视觉预期的"栩栩如生"的颜色和强度。为此，图像传感器产生的数据一般与撞击传感器的光电二极管的光子通量不直接相关。此因素限制了图像传感器对分析用途的可用性。^豫传J器橫芈使用光电二极管检测器的研究者可能不正确地假设由检测器获得的数字数据与撞击检测器的光子通量相关联，因为信号输出强度的增加一般与特定波长与频宽的信号输入增加直接相关。因为光电二极管输出是很线性的，所以光电二极管表面上不同波长的光子通量的增加将在光电二极管动态范围内产生线性输出信号。但是，如果QE在撞击光电二极管的波长范围内是可变的，则输出数据与光子通量将不相关。对于在一定时间段内撞击光电二极管的特定数量的光子，如果第一个波长的光电二极管QE比第二个波长高，则光电二极管在笫一个波长产生的电流大于在第二个波长产生的电流。般不能解决准确性问题。使用图像传感器评价的发射光谱可能非常宽，即便激发源具有窄波长范围。为此，在评价图像传感器的输出数据时应仔细考虑光电二极管QE曲线的形状。关于图像传感器的选择，CMOS图像传感器与电荷耦合元件在基本原理上是不同的，越来越多地应用于显微镜和诊断仪器，因为它们建造更便宜，需要相当少的能量来操作。CCD照相机在过去一直具有的低强度光处境下的明显优势已不复存在。CMOS图像现在可与传统的胶片彩色成像方法匹敌，且容易操作。图像可作为保存数组数据像素地址的各种格式的数字文件由一个处理器转移至另一个处理器。生产商已付出了相当大的精力来使用各种滤色器和内插方法重现"栩栩如生"的彩色图像传感器，以增强数字图像，呈现非常接近于人眼体验的颜色。但是，用彩色CMOS图像传感器获得的令人喜爱的"栩栩如生"的彩色照片对分析方法是无用的。单色图像存在相似的问题，除非图像通过罕有精确的单波长光产生。图1是可使用的彩色CMOS图像传感器实例的简单说明。没有说明CMOS成像仪的所有元件和特征。图1和该部分其余的图是说明性的，不必按比例制图。在图1中，图像传感器100包括成像阵列110。成像阵列包含大量以二维阵列排列的像素。如在阵列110的特定区域的放大像素阵列120所示，在成像阵列110中有一个与各个像素相关的滤色器。图像传感器100—般还包括涉及处理和传输成像阵列110产生的信号的电子元件，包括模拟信号处理器140、模拟到数字转换器150和数字逻辑电路160。CMOS彩色图像传感器中的光电二极管阵列被规则的薄层聚合滤色器覆盖，例如常规的BayerRGB(红-绿-蓝)二维阵列。在顺序(Bayer)模式中，各个滤色器依大小装在单个光电二极管上，以由宽频带的入射照明捕获颜色信息。在RGB阵列中，要非常着重于绿色滤色器，以解决550nm的人^L觉最大响应。每个红色滤色器和每个蓝色滤色器有2个绿色滤色器。但是，即便人眼对绿色550nm区更适合，但对于QE系数来说黄色一般是更好的选择。CMOS图像传感器和限定有源像素阵列的集成电路固有地为单色(黑色和白色)装置，其仅响应于撞击光电二极管的电子总数，而不响应于光的颜色。颜色通过将光穿过顺序序列的滤色器(例如红色、绿色和蓝色滤色器)检测，或用沉积在像素阵列上的微型透明聚合薄层滤色器检测。有源像素传感器(APS)技术是最流行的CMOS图像检测器设计。除了光电二极管以外，各个像素(或成像元件)在其表面上包括三个晶体管，其将累积的电荷转变成可检测电压，重置光电二极管，并将电压转为垂直列线。因此，光电二极管仅占据像素区域的一部分。光电二极管区域包含的面积等于大部分CMOS传感器总像素面积的30-80%。由光电二极管占据的该区域是吸收光子的区域，而像素的其它部分是相对不透光、阻断光、反射光或吸收光的。光电二极管区或窗称为像素或图像传感器的"孔径"或"填充系数"。小孔径或填充系数使灵敏度显著丧失和信噪比相对降低，并导致传感器的动态范围减小。CMOS图像传感器可用于产生图片，该图片基于光子撞击光电二极管表面时产生的信号，所述信号与有源像素传感器阵列中的各个像素相关。处理像素信号，以形成单色(黑色和白色)或彩色的全部图片。单色CMOS图像传感器在像素的光电二极管部分之上不具有滤色器。但是，彩色CMOS成像仪即便采用标准Bayer模式滤色器，一般也比单色CMOS成像仪更灵敏。因为在过滤掉颜色的光电二极管中，某些穿过滤色器的光被吸收，永不会到达光电二极管，所以看起来可能无滤色器的单色CMOS光电二极管固有地会更灵敏，但一般来说并非如此。这种假定完全没有考虑滤色器对光电二极管QE所具有的可能增强某些信号的作用，并忽视了下文描述的由彩色光电二极管结构中的微透镜提供的优势。单色CMOS图像传感器不具有滤色器，它们一般在各个像素上不具有微透镜。这些是使单色成像仪在成像仪灵敏度方面的吸引力不如彩色CMOS图像传感器的重要因素。图2说明了可利用的彩色图像传感器成像阵列的一小部分。说明的部分在整个成像阵列中是重复的。200部分由4个像素组成，每个像素都具有滤色器。滤色器220-250具有基于最适于阵列的选择的颜色。下面的滤色器210说明了单个像素的结构。对于每个像素，例如像素260,有一部分含光电二极管270,光电二极管区域仅是总区域的一部分。成像传感器将仅检测落在光电二极管区域上的部分光。在用于分析的彩色成像仪中，一种可能的方法应是通过谨慎选择滤色器和光电二极管，以产生对于给定带宽大约恒定的QE系数，来建造成像仪。通过在具有选定滤色器的阵列中组合合适数目的光电二极管，光能检测应更准确。选择的滤色器可有助于拉平和提升QE系数。但是，实际上选择滤色器和光电二极管是为了其它目的，目标是产生视觉更令人满意的图像。为了改进量子效率和光谱响应，几个CMOS生产商使用滤色器阵列，其基于可减原色青色、品红色和黄色(CMY),而不是标准相加原色红色、绿色和蓝色(RGB)。CMOS图像生产商一般使用已针对摄影图像选择的BayerRGB或BayerCMY模式。图3是RGB和CMY滤色器的说明。对于这些滤色器，将成像阵列分为小滤色器阵列，每个这种滤色器阵列均具有相同滤色器模式。RBG滤色器阵列300含有2x2滤色器阵列，每个阵列均含有两个对角线像素的一个红色滤色器和一个蓝色滤色器，以及余下的两个对角线像素的两个绿色滤色器。CMY滤色器阵列310也包含2x2滤色器阵列，每个阵列均含有两个对角线像素的一个青色滤色器和一个品红色滤色器，以及余下的两个对角线像素的两个黄色滤色器。尽管说明的滤色器是最常见的滤色器排列，但许多其它滤色器颜色和模式是可能的，可使用任何滤色器模式。在一定波长范围提供有益之处的某些其它替代滤色器才莫式示于表3。与单色图像传感器相反，彩色CMOS图像传感器也含有有效地将光子导向光电二极管孔径的孩i透镜。泡透镜(bubblelens)—般含防反射涂层，可有效增加光电二极管的表面积达显著量，在某些应用中达约60%。微透镜显著增加有效填充系数，可更多地补偿削减可到达光电二极管的总光的滤色器。图4是图像传感器中微透镜的简单说明。在成像传感器中，有多个像素405。各个像素都含有有源部分410，有源部分仅包括一部分像素区。为了部分补偿一般不会撞击有源部分410的光能，每个像素405都具有相关微透镜420。各个微透镜420的功能是将更多的光能聚焦于有源部分410，因此允许检测更大百分率的入射光子通量。例如，光430撞击孩1透镜420,聚焦在像素410的有源部分405上。^錄传4器说必降低或阻碍图像传感器光^t区域收集的光子的3种主要机制是吸收、反射和传送。这些因素具有波长依赖特性，部分限定了图像传感器的量子效率(QE)。例如，入射光的反射和传送随波长变化，400nm以下的较短波长被反射的百分率高。较短波长在前几微米的光敏区被吸收，但超过650nm的最长波长经常穿过光敏区。图5说明了图像传感器的典型量子效率光语响应。对于图5,评价BayerCMY滤色器。光谗响应500说明了针对入射在图像传感器上的不同波长光的图像传感器量子效率。对具有品红色滤色器510的像素、具有青色滤色器520的像素和具有黄色滤色器530的像素有单独的响应曲线。各条曲线在不同的入射光波长都具有峰和谷。通过检查图像传感器中使用的各个滤色器类型的QE波长依赖性曲线，对于任何目标波长或区间都可测定与光子通量成比例的输出信号，包括单色图像传感器的像素。在许多情况下，阵列中的每个像素都与其邻近像素基本相同，只是滤色器种类不同(CMY、RGB、其它模式或无滤色器)。滤色器的作用是增加或降低给定光子通量的光电二极管能量输出。对信号的作用是波长依赖性的。如果在成像阵列间对每个像素进行公平对比，则QE在信号输出中是可变的，应提出公式外作因子。在CMOS成像仪中，获得各个像素的像素信号作为原始数据，之后模拟到数字转换器以设定时间间隔转化为数值。如果QE表示为分数，则像素信号与QE和光子通量的乘积成正比像素信号=常数xQEx光子通量如果原始数据可按照合适的QE标准化，则可建立可用于随后更准确分析的数值。可获得彩色CMOS图像传感器的像素值，然后发生芯片上转换，数值通过将特定滤色器的各个信号值乘以QE倒数标准化。对于相对狹窄的带宽，QE可作为常数处理，这取决于使用的波长和滤色器类型。在一个实例中，对于Kodak1310彩色CMOS图像传感器，在550-650nm范围内的BayerCMY模式提供了约46%的QE,然后由650nm线性下降，达到990nm的5%,每5nm下降约0.6%。另外，品红色和黄色滤色器在630nm至990nm范围内非常相似。对于采用CMY模式的Kodak1310彩色图像传感器于670nm的具体实例，QE值示于表4。具有黄色滤色器的像素应将其数字原始数据乘以2.38，品红色滤色器像素乘以2.27,青色滤色器像素乘以7.69。在该实施方案中，每个像素的信号有效转化为与实际光子通量成正比的数值。要注意的是，表4仅包含特定波长的光(670nm)撞击图像传感器时的图像传感器QE。任何其它光波长的QE都是可变的，如图5所示。Q五屑数戎jH可基于特定的滤色器类型和波长的已知QE系数进行考虑QE差的校正。(例如参见表3和表4中包含的数据)。但是，图像传感器还可用于自动化校正像素QE差异。可标准化传感器阵列的各个区域，例如各个滤色器象限，以使象限中的每个像素都最佳地实时转变为光子通量。如果像素和滤色器全部是相同类型，例如示于表3的YYYY、MMMM和CCCC滤色器模式，则不进行校正。例如，如果在阵列中有两种或多种滤色器类型(例如YYYC、RGBBayer或改进的CMYBayer滤色器才莫式)，则可进行校正。自动校正QE的方法可用于两种或多种滤色器和光电二极管类型的任何组合，这种方法校正以标准化一个象限中的4个像素，使得各个像素产生对等的输出信号。如果像素被紧密堆积在涉及给定阵列区内的光子通量变化的象限中，则可假定相同数量的光子在任何给定时刻撞击该象限中的每个像素。根据目前可用的高分辨率传感器，并根据预期的未来分辨率的提升，假定任何给定象限中的相邻像素经受相同的光子通量是适宜的。使用此假设，象限中的各个相素均应产生相同输出。因此，可使用自动校正使每个滤色器象限中的相邻像素相同。象限中最灵敏的像素类型可用于提出QE和波长差的因子，简化了对波长和带宽依赖性的校正问题。在一个实例中，一旦确定了象限中最灵敏像素的背景校正系数，则可假定相同象限中其它像素中的每一个都具有相同的背景校正系数。自动校正还减少或消除了与不同滤色器和光电二极管类型的温度变动相关的问题。在以下部分讨论了用于阈值和标准化光度分配的自动化方法。在另一个实施方案中，成像传感器的阵列包含多个滤色器象限。在每个象限的4个像素中使用两个或多个滤色器。在每个象限的4个像素中，测定各个滤色器和光电二极管类型的模拟向数字转换信号输出的平均值。如果例如在象限中有3个黄色滤色的像素和1个青色滤色的像素，则首先测定3个黄色像素的平均值。然后将黄色像素的输出值与青色像素的值对比，以确定哪个输出在数值上更大。在所述实施方案下，有一个假^没全部4个像素接受相等的光子通量。将最高输出值分配给象限中的全部4个像素。然后阵列中下一象限可以相同方式校正，过程一直持续到整个阵列已分配了校正的输出值，以和光子通量相关联。在使用图像传感器记录图像时，自动校正的过程随时间重复。在再另一个实例中，图像传感器接收的光波长可由第一个波长变至第二个波长。第一类滤色器可^是供第一个波长的最高QE,而笫二类滤色器可提供第二个波长的最高QE。波长变化可纳入计算过程，因此改变光的自动化校正可实时进行。对于QE差的自动校正来说，不必预先知道各个滤色器类型的QE。在获得图像时基于光子通量的自动校正传感器优化了图像，以与光子通量相关联。该校正信号的方法去除了不同滤色器类型的温度和波长依赖性差异，可使用软件实施。因此，这种方法自动校正碰撞图像传感器的宽带信号。在再另一个实例中，针对光子通量自动校正的图像传感器产生的数字信号可以灰度级图像呈现，随后在单色图像中目测。成/求传^器戎雀图像传感器的优化可包括校准步骤。校准可通过用已知波长和强度的光照射滤色器和光电二极管完成。对于彩色CMOS成像仪，获得各个滤色器的原始数据，并与预期值对比。根据所获得的比较结果，可得到QE和乘数(标准化系数)，其为获得用于阵列中每个像素的每个滤色器的等同输出信号所需要的。使用QE系数转换获得的优化信号可更准确地将信号与光子通量关联，因此更精确地表征事件，例如在化学反应中与激发-发射光镨或吸收现象相关的光学事件。通过正确地转变信号以计算QE系数来增强灵敏度和准确性。使用标准CMOS成像仪(例如Kodak1310彩色CMOS图像传感器)，可对产生的原始数据进行信号优化处理。信号转变为与入射成像仪的光子通量相关联的数值。该处理可应用于彩色或单色CMOS图像传感器，以使信号与光子通量成比例。可对处理的数据进行目检，例如经灰度级标准(0-255单色)产生与实际光子通量关联的黑色和白色图像。数据的目视图像表面上与灰度级单色图像传感器等同，但对于等同的发光，数据的目视图像比单色未转换对应CMOS产生的图像更强，因为彩色CMOS芯片一般比单色芯片更灵敏。彩色图^f象传感器一般提供更好的信号，比单色成像仪更灵敏，因为像素光电二极管滤色器提升了光电二极管的QE。可使用QE系数校正彩色图像传感器对光的滤色，以将信号转换为与光子通量成正比的数值。此外，利用滤色器微透镜有效放大光电二极管孔径的优势。图6说明了优化图像传感器校准程序的非限制性实例。在校准程序600中，产生已知波长和强度的光605。在已知强度下，各个像素上的光子通量是已知的，如果像素的QE是100。/。，则其应为输出。已知光射到图像传感器上610。获得图像传感器各个像素的输出615。然后可将图像传感器的输出与实际光子通量对比620。使用对比，可计算像素的量子效率625，然后基于量子效率计算标准化系数630。对于彩色CMOS图像传感器，可对各个滤色器颜色进行对比和计算，产生针对各个滤色器颜色的标准化系数。在其它实施方案中，可对图像传感器的各个像素或对图像传感器的像素象限进行对比和计算，产生适用于图像传感器的某些部分的标准化系数。因为标准化系数随撞击图像传感器的光各个波长变化，所以改变已知光的波长635,对各个需要的波长重复此程序。在某些实施方案中，图像传感器可为含^f象素阵列的彩色传感器，各个像素都具有滤色器。滤色器可在象限中排列，各个象限都具有特定过滤模式。可获得阵列笫一象限中各个像素的输出。然后测定象限中各个滤色器类型的平均输出。在一个实例中，如果滤色器象限是含一个青色滤色器、一个品红色滤色器和两个黄色滤色器的CMY模式，则测定青色输出、品红色输出和两个黄色输出的平均值。然后对比输出并确定最高输出。接着将最高输出分配给象限中的各个像素。例如，如果平均黄色输出是CMY象限的最高输出，表明在特定条件下黄色滤色器具有最高QE系数，则将平均黄色输出分配给象限中的各个像素。如果在阵列中有多个象限，则获得下一个象限的输出并继续该程序。一旦已校正了最后一个象限，则完成该程序，获得阵列的校正输出。然后可随时间重复该程序，以允许对图像传感器进行实时QE系数校正。图7是流程图，说明了优化图像传感器的代表性程序。在优化程序700中，用图像传感器捕获事件图像705。在本发明的一个实施方案中，图像传感器是彩色CMOS图像传感器，其使用诸如BayerRGB或CMY模式的滤色器模式。事件图像的原始数据由图像传感器获得710。原始数据是未优化的数据，由于图像传感器的性质其一般将随撞击图像传感器的实际光子通量而极大变化。由于标准化系数取决于光波长，所以测定波长715。基于光波长测定各个像素的标准化系数720。对于一个利用CMOS彩色图像传感器的实施方案，在标准化中使用各个透镜颜色的标准化系数。在其它实施方案下，标准化系数可基于其它因素变化。然后使用图像传感器像素的合适标准化系数转换原始数据725,因此产生接近捕获的事件图像的实际光子通量的优化数据组。在本发明的实'施方案下，可使用转换数据产生图像730。炎乂检浙荧光团经常用于检测玻璃表面上偶联反应的存在或不存在。当用激光或其它光源激发荧光团时，荧光检测器检测产生的衰减波强度。通常，使用处于吸收峰的激光激发荧光团，检测器被调整到以较长发射波长读取该特定荧光团特有的发射信号。吸收和发射之间的波长跃迁称为Stokes频移。大部分荧光检测方法使用具有大Stokes频移的荧光团，使得发射和吸收曲线充分分开。对于具有小Stokes频移的荧光团，必须以波长比最佳峰吸收最大值短的波长激发，因为发射和吸收曲线重叠。信号发射强度下降，检测靶分子的灵敏度下降。对大Stokes频移的需要还限制了可使用荧光团的选择。因为吸收和发射曲线彼此经常很接近，所以发射信号的准确读取可能很复杂。如果发射和吸收曲线间的距离小，则难以将发射光语的光与吸收信号的光分开。在吸收峰具有狭窄频带的激光经常与滤光片一起使用，以阻断达到某一临界点的全部光，该临界点就在发射光语曲线之下。通过选择合适的长通滤光片、带通滤光片或长通滤光片和带通滤光片的组合，可用窄窗观察发射信号，消除激发光源的大部分干扰。通过对准检测器和仪器也避免了激发光源的干扰，使得发射信号可在相对激发光束的大入射角读取。尽管滤光片消除了大部分激发光源的信号，但是它们也阻断了显著部分的衰减(发射)信号。大部分带通滤光片阻断多达40-50%的发射信号。长通滤光片可额外阻断10%的发射信号。焚光检测用于多种常见测试方法。DNA杂交是常以该方式分析，使用偶联一组已知寡核苷酸的合适荧光团，所述寡核苷酸杂交捕获固定至栽玻片的寡核苷酸。夹心免疫测定也使用该分析方法，或者使用结合一抗的标记二抗，或者使用生物素化二抗和抗生物素蛋白-焚光团作为标记。对该方法的任何修改都是众所周知的。在荧光检测中可发生各种其它类型的光干扰。光散射通过反射发射光束发生，而光弥散通过反射和弯曲发射光束发生。散射和弥散可占撞击检测器的光的一大部分。一般来说，当底物(例如蛋白、核酸或其它生物分子)固定到玻璃载玻片表面上时，其用作镜子，以各种方向反射和散射光。被覆盖表面的量以及附着物质的质量或密度可极大影响散射光的量。附着至玻璃表面的蛋白、寡核苷酸或聚合物的化学组合物也可影响散射光，如以下图8所示。另外，附着于玻璃载玻片物质的材料自身可发荧光。使用的玻璃还可具有可影响检测器接收的信号的表面不规则性。经过玻璃被吸收的能量可随一个点到另一个点变化，使信号分析非常成问题。这种问题需要使用新的荧光检测和/或数据分析方法。衷减的发射充和教射克衰减信号一般非常弱，光散射强，使准确定量检测分析物有疑问。经常假定光散射被滤光片消除。但是，散射光几乎总是存在，可为到达检测器的总信号的显著部分。用于去除光散射的滤光片还去除大部分靶发射信号，从而降低了^T测器灵敏度。滤光片还可传播少量散射光。如果散射光相对比衰减的发射光大，则检测的信号将为几个来源的组合，其中仅有一个代表靶分子结合。光散射的成分描述于图8。两个斑点(例如不同抗体)沉积在玻璃表面上。在检测靶的方法当中，其中一个斑点保持完全无反应性。另一个斑点与耙反应，例如细菌病原体和/或其它试剂。结合反应性抗体的革巴增加了附着于斑点的量，导致较大表面积和斑点处的分子结构改变。质量效应已经发生。反应性斑点的光散射与靶分子结合前的光散射不同。灵敏的光子，计数检测器可检测此散射差异。诸如某些流式细胞仪和浊度计的多种仪器利用散射定量溶液中的物质量。仪器检测撞击靶物质的光束的散射角。信号改变是参比信号(S,ef)和信号2(S》之间的差。在图8中，S2信号显示为具有两部分改变的散射光加偶联病原体的质量效应信号。反应性斑点的信号改变，同时非反应性斑点信号的信号不变。△S(非反应性斑点)-0△S(反应性斑点)=改变的(S》+M,-Sref如果质量效应足以引起大的散射作用，则用于靶检测的荧光团可被消除。例如，在DNA杂交实验中，附着于使用标准寡核苷酸探针(约24个核香酸长)的表面的质量在结合靶核酸时可增加2倍或更多倍。这种大质量改变可通过监测光散射而不是衰减波来检测。对于采用生物素化二抗的夹心免疫测定，当生物素化抗体结合病原体时发生另一种质量效应。当抗生物素蛋白缀合的荧光团结合生物素时发生第三种质量效应。由已连接并激发荧光团后荻得的最终捕获信号中扣减初始参比信号，可获得最灵敏信号。该信号代表改变的累积质量效应和反应性斑点的发射信号。△S(反应性斑点)=改变的累积质量效应+发射-Sref该分析方法可与CMOS成像仪或允许储存像素图像用于随后处理的任何已知数字成像方法一起使用。由各个斑点获得的信号包含更有用的信息，如果使用正确的扣减方法，则在靶结合时将显示出更强的改变。散射作用可转变成检测靶结合的优势。而且，不必具有充分分开的荧光团发射和吸收曲线，因为伪信号由图像中扣除。可检测发射信号的完整强度，而不利用滤光片降低发射光。扣减方法还消除了例如可来源于玻璃载玻片表面中不匀一性(碎片、裂隙)的伪信号和缺陷。非反应性斑点完全成为空白，不表现为信号。因为CMOS成像仪和^f象素捕获装置一般表现出随机的、非常低水平的噪音，所以对可检测何种信号没有限制。在任何给定的时间点，基线参比可表现出随机数量的波峰。落在两个波峰之间的弱信号相对于此背景噪音一般不会被检测到。如果捕获众多图像并将一个加到另一个上，则可改善信噪比问题。因为才企测器如CMOS成4象仪中固有的随机峰经常漂移，所以累积帧图往往倾向于平均随机噪音。但是，激发的荧光团发射的弱信号不改变其像素位置。因此，草巴结合产生的累积信号将随时间增加。该方法类似于通过追踪跨越天空移动的目标获取远距离星星或星系的照片。目标对象随着时间推移相对于背景看起来更明亮，因为信号已累积在检测器上的相同斑点上，同时背景光达到平均值。在一个代表性实施方案中，玻璃或尼龙载玻片或其它基质阵列在镜台上是牢固的。在靶分子结合前，激发激光以约30-40度的倾斜角聚焦在载玻片的一个末端。载玻片起波导作用，以将激发光传导向表面上含结合一抗的斑点。CMOS、CCD或其它光学成像仪用于捕获光信号。成像仪可位于载玻片之下并对准，使得载玻片上的斑点在成像仪正上方，并用光学透镜和孔径锐聚焦在成像仪表面上。获取许多图片。每张图片都代表一帧。例如，使用50毫秒曝光获得10帧。选择曝光，使得在单帧中捕获的光量在照相机的灵敏度范围内。然后加入10数字帧，以提供用于扣减不需要(背景)信号的参考集。累积的图像称为校准幻灯片。在一抗和/或二抗、酶和试剂等结合后，使用相同曝光，获取用于获得参比幻灯图像的相同帧数量的样品幻灯片。累积的一组帧称为样品幻灯图像。各个斑点的发光信号通过由样品幻灯图像扣减参比幻灯图像测定。该方法基本消除了背景噪音和基质阵列伪信号，导致对靶分子的非常敏感的检测。在替代实施方案中，可以静止帧或视频形式获得图片。典型图像帧以2000ms运行，对参比和样品分析各捕获100帧。该方法去除了伪信号和非反应性斑点，只留下了代表靶分子结合阵列的信号。自动阈值校正样品分析中常见的问题涉及需要在不存在绝对标准时进行检测和解释值的含义。例如，在检测发光度时，因为一般不能正好在反应开始时获得检测值，并因为底物浓度通常是未知的，所以一般仅可获得相对发光度检测值，并用于分析方法。没有可针对其检测信号的绝对标准。发光度经常使用CCD照相机和软件检测。由于电路、光学器件、CCD芯片和外壳等的变化，各个设备都将有差别地检测绝对数值。在不同时刻、不同扫描以及在不同日期即^f吏相同"^殳备检测不同，由于温度和电路反应的敏感变化，溶液、扫描时间等的变化，也会使给定检测组中获得的绝对值难以解释。对于特定仪器，当这些信号差相比于所获得的数值相对小时，有可能容易地区分组中的一个样品与组中的其它样品，并将其分配给具有不同分布模式的群，例如作为阴性或阳性血清样品的特定标记。但是，实际上一个实验与另一个实验之间的检测差异可能大于相同或相似样品的绝对数值。在相对发光度值很低并进行低水平检测时尤其如此。通过使用一组检测中所有其它检测值都与其相比较的参比，有可能准确指出信号大于、等于或小于该参比数值。而且，由于经常观察到1000至100万相对发光度单位的广泛动态范围，所以有可能检测完全在每iooo单位几份之内的相对发光度。但对于每个新;险测组，由于绝对值的变化，通过由另一组检测值中扣除背景检测值或特定样品检测值获得的一组检测的相对发光度，不一定为测试样品提供对等的相对发光度。需要区分具有分布曲线的一个系列(血清阴性组或血清正常组)中的一个样品组的方法，所述分布曲线与另一个样品组(阳性或独特标记和区分的样品组)的分布曲线不同。并且，还需要使所有仪器以相同方式区分信号的能力相同的方法。这可仅使用样品的检测发光度对任何测试样品进行，只要阴性或阳性参比组和背景参比信号也在筛选步骤中获得。一般来说，最好使用阴性或正常组作为参比，因为可制备样品合并物并用作参比，其贴近同时测试和平均的几个样品的预期平均值。阳性或独特标记的血清可冲艮据标记而有相当大的改变。例如，用具有循环抗体作为目标标记的牛分支杆菌感染的牛在感染早期可具有非常少的抗体。在不同动物中或在感染晚期，抗体浓度在浓度上可能非常大或非常小。阳性感染动物不应用作参比。阴性(正常血清)没有对牛分支杆菌特异性的抗体标记，可用作参比。々对发'^M發解上述全光学测定装置(TOAD)和一起使用的软件、光学器件以及载有一组分析样品的设备外壳，提供给研究者样品池中各个样品的数值。样品池一般含12个或更多个孔，每个孔均含有样品或对照溶液，在规定时间周期内(例如10分钟)对其扫描以捕荻图像。一般同时扫描几个样品。在没有样品(背景)的情况下应观察到代表背景数值的信号，该信号在扫描样品的同时通过^r查CCD照相机目标区域中样品间的区域获得。样品数值和背景数值之间的差异代表特定测试样品的相对发光度。一组12个样品的代表性图像示于图l5,约10个血清阴性动物于相同底物浓度的合并物作为参比(阴性对照)。因为在单次样品池测定中仅可处理11个样品和阴性对照，所以需要很多组来分析大量样品。对于每一组，获得11个额外样品，其数值相对于该样品池的阴性对照参比是可检测的。表5显示了使用未感染和感染牛血清的盲研究中9个连续测定组的结果和99个不同样品的相对发光度。样品池中各个样品的相对发光度提供了有用的信息，使得可以使用参比阴性对照合并物区分阳性和阴性感染动物。这可通过指定阈值来实现，在阈值上样品为阳性，在阈值下样品为阴性。凭经验由一组给定实验条件获得阈值。用于测定样品是阳性感染还是阴性感染的阈截断值凭经验确定。获得9个样品池中每一个的阴性对照参比值，背景、NC和NC相对发光度值(由NC中扣除BG)示于表6。获得合并的阴性对照血清的相对发光度(参见NC_RL,表6)。NC—RL的值在相当程度上可变。单独检测的几个血清的平均值加平均值的多重标准偏差相对于合并的阴性参比的比率是一个常数。该比率恒定是因为CCD图像输出与撞击其表面的光子成正比，因此，合并的血清参比和测试中的阴性样品血清受到一组实验条件相同程度的影响。利用相对于合并阴性样品参比为阴性的血清的平均预期相对发光度值与实际上可为阴性或可不为阴性的样品的观测值之间的关系，通过将平均预期相对发光度值加上超出平均值(应包括任何阴性血清样品)的标准偏差乘数，自动测定阈值。这可通过以下等式表示阈值=ObsNC+X(SD)-NC一RL合并参比ObsNC=观测的阴性对照样品血清值X=乘数SD=几个阴性样品血清值的标准偏差NC_RL=阴性对照合并血清参比值如果样品的观测值等于NC合并参比，则阈值刚好是超出给定实验条件组的合并参比的标准偏差乘数。阈值-X(SD)因为几个测试阴性样品的平均值加测试样品的标准偏差乘数相对于合并参比测试样品之间的关系是恒定的，所以可通过如下所示的简式自动计算阈值。{0^。平均值+X(SD)}/NC_RL合并参比=常数因此，阈值={常数-1}NC_RL阈值系数={常数-1}因为其值在阈值以上或以下来确定样品池中的特定样品为阳性的还是阴性的。阳性指定Obs相对发光度>l'^Ki阴性指定Obs相对发光度<阈<直实际上，{常数-1}的值允许在测试后改变，使得可确定对特异性和灵l文度检测的影响。然后建立标准ROC曲线(参见例如图16)。根据数值表选择针对需要的任何特异性和灵敏度截断值的阈值系数(表7)。例如，0.9的阈值系数分别代表91%和76%的特异性和灵敏度。标雀必/A7值和^7对发'充^计算的阈值用于根据其相对发光度指定样品为阳性感染血清组或正常血清组。如果使用的阈值系数产生100%灵敏度，则所有阳性样品都应被鉴别出来(即假阴性应为零)，但可能有很多假阳性(正常血清组)，因为阈值太低以至于不能消除假阳性掺入。假阳性可在随后的实验中用反射辅助检测消除。通过相对于选定阈值标准化相对发光度，样品可被鉴别为阳性的或阴性的，因为其值分别高于或低于1.0。这是更有用的表示数值的方式，因为其使得更容易检查一系列样品，根据该样品的数值立刻明白该样品处于应被分配的指定中。通过将样品的观测相对发光度除以该样品池的阈值，将阈值由相对发光度值转变为(标准化为)整数。在比较一个样品与另一个样品时，可以一眼就看出比率增量7阈值超过或低于1.0。这单独确定了阳性或阴性样品的指定。相对发光度检查自身不能这样容易地解释指定。阳性指定(Obs相对发狄)/阈值".0阴性指定{Obs相对发歧}/阈值<1.099头测试动物的自动化和标准化值列于表8，仅用于首轮测试。筛选和反射辅助检测的图示示于图17。通过自动计算阈值，设定给定实验条件组的灵敏度和特异性的标准。各个设备都依据相同标准以等同方式解释结果。并通过将计算相对发光度除以阔值，标准化观测的相对发光度，根据它们大于或小于i.o,容易地评价系列中的或设备与设备之间的所有样品相对于选定阈值是阳性或阴性的。用于蛋白和肽的一般方法围内，可使用各种多肽或蛋白。在某些实施方案中，蛋白可包含含有抗原结合位点的抗体或抗体片段。许多具有针对单个分析物的结合特异性的抗体是本领域已知的。本文使用的蛋白、多肽或肽一般指但不限于大于约200个氨基酸直至由基因翻译的全长序列的蛋白；大于约100个氨基酸的多肽；和/或约3个至约100个氨基酸的肽。为方《更起见，术语"蛋白"、"多肽"和"肽"在本文可互换使用，因此，术语"蛋白或肽"所包括的氨基酸序列包含天然蛋白中可见的20种普通氨基酸中的至少一种，或包含至少一个修饰或不常见氨基酸，包括但不限于示于表9的氨基酸。可通过本领域技术人员已知的任何技术制备蛋白或肽，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白、多肽或肽；由天然来源分离蛋白或肽；或化学合成蛋白或肽。对应于各种基因的核苷酸和蛋白、多肽和肽序列先前已公开，并可见于本领域一般技术人员已知的计算机化数据库。一个这种数据库是美国国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept凄丈净居库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。已^口基因的编码区可使用本文公开的技术或本领域一般技术人员应当知道的技术扩增和/或表达。另一方面，蛋白、多肽和肽的各种商品化制品是本领域技术人员已知的。其它实施方案可涉及融合蛋白，例如下文讨论的CP10一ESAT融合蛋白。这些分子一般具有全部或显著部分的肽，其以N-末端或C-末端连接至第二种多肽或蛋白的全部或部分。例如，融合体可使用其它物种的前导序列，以允许蛋白在异源宿主中重组表达。另一种有用的融合体包括加入免疫活性结构域，例如抗体表位。某些类型的融合蛋白可使用两种或多种不同蛋白的抗原性表位，以便供广i普抗体筛选使用。预期使用来自多个病原体蛋白的融合表位可为检测感染宿主中的抗病原体抗体提供增加的灵敏度。产生融合蛋白的方法对本领域技术人员来说是众所周知的。这种蛋白例如可如下生产使用双功能交联试剂化学连接；从头合成完整融合蛋白；或将编码首个蛋白或肽的DNA序列连接至编码第二个肽或蛋白的DNA序列，接着表达完整融合蛋白。在某些实施方案中，可分离或纯化蛋白或肽。蛋白纯化技术对本领域技术人员来说是众所周知的。这些技术包括以某一水平将细胞、组织或器官匀浆和粗提为多肽和非多肽级分。目标蛋白或多肽可使用层析和电泳技术进一步纯化，以实现部分或完全纯化(或纯化至均一)。特别适合于制备纯肽的分析方法是离子交换层析、凝胶排阻层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、亲和层析、免疫亲和层析和等电聚焦。特别有效的肽纯化方法是快速蛋白液相层析(FPLC)乃至HPLC。各种适用于蛋白纯化的技术对本领域技术人员来说都是众所周知的。这些技术包括例如用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀，或热变性，接着离心；层析步骤，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、反相层析、羟磷灰石层析和亲和层析；等电聚焦；凝胶电泳；及这些技术和其它技术的组合。如本领域通常所知的，一般认为进行各种纯化步骤的顺序可变，或某些步骤可省略，仍得到适合制备大致纯的蛋白或肽的方法。一般不要求蛋白或肽总是以其最纯形式提供。实际上，设想在某些实施方案中使用显著不够纯的产物。部分纯化可通过使用组合的较少纯化步骤完成，或通过使用不同形式的相同通用纯化程序完成。例如，人们认识到，使用HPLC装置进行的阳离子交换柱层析一般产生比使用低压层析系统的相同技术高"倍数"的纯化。表现出低度相对纯化的方法可在总蛋白产物回收或保持表达蛋白的活性方面有优势。亲和层析是依赖于待分离物质与可与其特异性结合的分子之间的特异性亲和性的层析步骤。这是受体-配体类型的相互作用。通过将其中一种结合配偶体与不溶性基质共价偶联合成柱填料。然后柱填料能够特异性吸附溶液中的物质。通过将条件改变为其中不发生结合的条件(例如改变的pH、离子强度、温度等)进行洗脱。基质应当是自身不以任何显著程度吸附分子的物质，具有大范围的化学、物理和热稳定性。配体应当以不影响其结合特性的方式偶联。配体应当还提供相对紧密的结合。并且，应当有可能在不破坏样品或配体的情况下洗脱所述物质。蛋白或肽。各种自动化合成仪是市售可获得的，可按照已知方法使用。参见例如Stewart和Young，(1984);Tam等，(1983);Me订ifield，(1986);以及Barany和Merrifield(1979)。通过这种方法可容易地合成通常约6个至约35-50个氨基酸的短肽序列。或者，可使用重组DNA技术，其中将编码目标肽的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染入合适的宿主细胞中，并在适于表达的条件下培养。抗体术语"抗体"用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，包括抗体片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。制备和使用各种抗体型构建物和片段的技术在本领域众所周知。制备和表征抗体的方法在本领域也是众所周知的(参见例如Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,1988)。用于检测各种目标病原体的抗体也可由各种各样的已知来源商购获得。例如，可由美国典型培养物保藏中心(Rockville,MD)获得各种分泌抗体的杂交瘤系。可通过用免疫原免疫动物并由该免疫动物收集抗血清制备多克隆抗体。广泛的动物物种可用于生产抗血清。通常，用于生产抗血清的动物是非人动物，例如兔、小鼠、大鼠、仓鼠、猪或马。因为兔相对大的血容量，所以兔是生产多克隆抗体的首优。多克隆抗体和单克隆抗体都可使用常规免疫技术制备，对本领域技术人员来说一般是已知的。含抗原性表位的组合物可用于免疫一种或多种实验动物，例如兔或小鼠，其然后继续生产特异性抗体。在允许抗体生产的时间之后，仅仅通过由动物取血并由全血制备血清样品，就可获得多克隆抗血清。如本领域众所周知的，给定的组合物其免疫原性可变。因此，必须经常加强宿主免疫系统，这可通过将免疫原与载体偶联实现。代表性和优选的载体是匙孔贼血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵白蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作载体。将抗原缀合至栽体蛋白的方法在本领域众所周知，包括戊二醛、间-马来酰亚胺基苯曱酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和双二氮杂化联苯胺(bis-biazotizedbenzidine)。本领域还众所周知，可通过使用称为佐剂的免疫应答非特异性刺激剂增强特定免疫原组合物的免疫原性。代表性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(含灭活结核分支杆菌的免疫应答非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动物而变化。可^f吏用各种途径给予免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的生产可通过在免疫后的各个时间点取免疫动物血样监测。还可给予第二次加强注射。重复加强和滴定的过程，直至获得合适的滴度。当获得期望的免疫原性水平时，可对免疫动物采血，分离血清并储存，和/或可使用动物产生单克隆抗体。通过使用众所周知的技术可容易地制备单克隆抗体，例如在美国专利4,196,265中例举的技术。通常，该技术包括用选定的免疫原组合物免疫合适的动物。免疫症且合物以有效刺激抗体生产细胞的方式给予。优选啮齿动物如小鼠和大鼠的细胞，但是，也可能使用兔、绵羊或青蛙细胞。优选小鼠，最优选BALB/c小鼠，因为其最常规使用，一般产生较高百分率的稳定融合体。在免疫后，选择具有抗体生产潜力的体细胞，具体地说是B-淋巴细胞(B-细胞)，用于mAb生产方案。这些细胞可由活检脾脏、扁桃腺或淋巴结获得，或者可由外周血样品获得。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为它们是处于分裂成浆细胞期的抗体生产细胞的丰富来源，后者是因为外周血容易获得。通常，免疫一组动物，取出具有最高抗体滴度的动物脾脏，通过用注射器匀浆脾脏获得脾脏淋巴细胞。通常，免疫小鼠的脾脏包含约5xl(f至2xlOS淋巴细胞。然后将免疫动物的生产抗体的B淋巴细胞与永生化骨髓瘤细胞的细胞融合，所述骨髓瘤细胞一般是与免疫动物相同物种的其中一种骨髓瘤细胞。适用于生产杂交瘤的融合步骤的骨髓瘤细胞系优选是不产生抗体的，具有高融合效率和使其不能在某些选择培养基中生长的酶缺陷，所述选择培养基支持仅期望的融合细胞(杂交瘤)生长。可使用本领域技术人员所知的众多骨髓瘤中的任一种。例如，当免疫动物是小鼠时，人们可4吏用P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-ll、MPC11誦X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;对于大鼠，人们可使用R210.RCY3、Y3-Ag;U誦266、GM1500-GRG2、LICR-LON國薩y2和UC729-6对于细胞融合体全是有用的。产生抗体的牌或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂合体的生产方法通常包括在促进细胞膜融合的一种或多种物质(化学的或电的)存在下，使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1比率混合，尽管该比率可分别由约20:1至1:1变化。业已描述了^f吏用仙台病毒的融合方法和使用聚乙二醇(PEG)(例如37。/。(体积/体积)PEG)的融合方法。使用电诱导融合方法也是适合的。融合方法通常产生以低频率产生存活的杂合体，约1x10—6至lxl0-8。然而，这不成问题，因为通过在选择培养基中培养区分活的融合杂合体与亲代未融合的细胞(特别是一般应继续无限分裂的未融合骨髓瘤细胞)。选择培养基一般含阻断核苷酸在组织培养基中从头合成的物质。代表性和优选的物质是氨蝶呤、氨曱喋呤和重氮丝氨酸。氨蝶呤和氨曱喋呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。在使用氨蝶呤或氨曱喋呤的情况下，用次黄嘌呤和胸腺嗜啶作为核苦酸源补充培养基(HAT培养基)。在使用重氮丝氨酸的情况下，培养基补充次黄嘌呤。优选的选择培养基是HAT。只有能够运行核苷酸补救途径的细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺失补救途径的关键酶,例如次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT),它们不能存活。B-细胞可运行该途径，但它们在培养物中具有有限的寿命，一般在约2周内死亡。因此，在选择培养基中可存活的细胞只能是由骨髓瘤和B细胞形成的杂合体。该培养提供了一个杂交瘤群，由其选择特异性杂交瘤。通常，通过如下培养细胞进行杂交瘤选择在微量滴定板中单克隆稀释，接着测试单个克隆上清液(在约2周或3周后)的期望反应性。所述测定应是灵敏、简单和快速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、斑点免疫结合测定等。选定的杂交瘤然后应连续稀释，并克隆为单个生产抗体的细胞系，接着克隆可无限繁殖，以提供mAb。细胞系可以两种基本方式用于mAb生产。可将杂交瘤样品注射入组织相容动物类型中(经常注射入腹腔中)，所述动物类型用于为初始融合提供体细胞和骨髓瘤细胞。注射的动物发展出分泌由融合细胞杂合体生产的特异性单克隆抗体的胂瘤。然后，可放出动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的mAb。单个细胞系还可在体外培养，其中mAb天然分泌入培养基中，由培养基可容易地获得高浓度的mAb。如果有需要，使用过滤、离心和各种层析方法，如HPLC或亲和层析，进一步纯化通过任一种方法生产的mAb。实施例纳入以下的实施例来阐述本发明的优选实施方案。本领域技术人员应认识到，以下实施例中公开的技术代表了本发明人发现的技术，在实施本发明时性能良好，因此可被看作是构成了实施本发明的优选模式。但是，按照本发明的公开内容，技术人员应认识到，可对公开的具体实施方案进行许多改变，仍获得类似或相似的结果，而不偏离本发明的精神和范围。实施例1.牛结核病测试的代表性方法如上所述，可使用含一种或多种在目标靶病原体中表达的肽序列或其它抗原的捕获探针结合和检测由受试者荻得的血液、血清或其它样品中存在的抗病原体抗体。技术人员会认识到，待检测的靶不受限制，存在针对其的循环宿主抗体的任何靶都可使用相似方法检测，相反，抗目标靶的抗体可用作捕获探针，例如通过夹心式ELISA或本领域众所周知的其它技术检测靶抗原的存在。材料和方法在当前的牛结核病检测的代表性实施方案中，使用的捕获探针为重组融合蛋白，其由牛结核分支杆菌菌抹H37Rv基因组中编码CFP-10和ESAT-6的两个相邻可读框(ORF)表达。通过PCR定向诱变方法按读框融合这两个基因产物，其中CFP-10的TGA终止密码子变为Gly(GGA)，额外的G残基插入CFP-10和ESAT-6之间的32个核苦酸插入区的下游，以便-f呆持正确的读框。这产生融合蛋白，其由融合至完整ESAT-6基因产物(95个^酸)的完整CFP-10基因产物(IOO个氨基酸)和间-ORF区中插入的12个"无义"氨基酸组成。然后使重组抗原(RecAg)附着至铁氧体磁珠，作为用于感染动物中的牛抗体的探针。CFP-10JU^^列EQQQALSSQMGF(SEQIDNO:1)CFP-10核苷酸序列atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcggatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtcgacggcaggttcgttgcagggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccgcggtggtgcgcttccaagaagcagccaataagcagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatattcgtcaggccggcgtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttcIGA(SEQIDNO:2)间-ORF区cccgctaatacgaaaagaaacggagcaaaaac(SEQIDNO:3)ESAT画6氨基赫列NVTGMFA(SEQIDNO:4)ESAT-6核苷酸序列atgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccagggaaatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag(SEQIDNO:5)完整核苷酸序列atggcagagatgaagaccgatgccgctaccctcgcgcaggaggcaggtaatttcgagcggatctccggcgacctgaaaacccagatcgaccaggtggagtcgacggcaggttcgttgcagggccagtggcgcggcgcggcggggacggccgcccaggccgcggtggtgcgcttccaagaagcagccaataagcagaagcaggaactcgacgagatctcgacgaatattcgtcaggccggcgtccaatactcgagggccgacgaggagcagcagcaggcgctgtcctcgcaaatgggcttcGGAcccgctGaatacgaaaagaaacggagcaaaaacatgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccagggaaatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgcagcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgccacggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggtcaggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag(SEQIDNO:6)如所示，在CFP-10编码序列3'末端的TGA终止密码子被诱变为编码甘氨酸的GGA甘氨酸密码子。另外，G残基插入到诱变的GGA密码子下游的6个碱基处，使融合的ESAT-6编码序列符合CFP-10序列的读框。重组CFP-ESAT抗原由GenWayBiotech,Inc.(SanDiego，CA)制备。^^^^厨合蛋^^缀合使用BangsLaboratories,Inc.(Fishers,IN)的COOH樣t球用PolyLink蛋白偶联试剂盒(PolyLinkProteinCouplingKitforCOOHMicrospheres)和稍微改良的偶联方法，将CFP-10:ESAT-6重组融合蛋白抗原(CFP-ESAT)缀合至铁氧体磁珠。将没有A蛋白和其它干扰物质的融合蛋白共价偶联至丙烯酸羧基(COOH)包被的铁氧体磁珠。简单地讲，羧基用具有NHS》务饰的水溶性碳二亚胺活化，然后其与这些基团反应，产生活性酯。该酯对待缀合至珠的蛋白上的伯胺有活性。代表性方案公开于DataSheet#644(随附PolyLinkProteinCouplingKit)。铁氧体磁珠-CFP-ESAT缀合物母液在甘氨酰胺緩冲液中封闭和清洗后于含有微生物抑制剂的标准稀释緩冲液中悬浮至2mg/ml铁氧体磁珠浓度。在使用前，将珠在标准稀释緩冲液(IOrnMPBS、0.％BSA、0.05%ProClin)中稀释至0.04mg/ml浓度，用于牛TB测定。等份的稀释珠制备物用于掺入稀释血清样品，用于各个样品的分析。膽羧基(COOH)包被的铁氧体艰l球和PolyLink蛋白偶联试剂盒来自BangsLaboratories,Inc.,(FishersIN)。生物素化山羊抗牛IgM(p链特异性的)来自KPL(Gaithersburg,MD)。HRP-SA溶液，SuperSignalWestPicoLuminol/EnhancerSolution和SuperSignalWestPicoStablePeroxideSolution来自Pierce(Rockford,IL)。嫂以下提供了Mbv感染的快速诊断测试的代表性逐步方案。更一般地讲，在典型测试中，通过将20|Lil全牛血清(优选无叠氮化物)加至1.5mlEppendorfProteinLoBind管中的980pi标准稀释緩冲液(IOmMPBS、0.1%BSA、0.05%ProClin)中制备1:50稀释度的血清样品。然后将280jal的该样品分配到第二个EppendorfLoBind管中，将70jul充分分散的0.05mg/mlESAT-6/CFP-10BangsBiomag珠缀合物溶液用滴管移入牛血清样品中，在室温于无磁性样品架(rack)位中温育I5分钟。然后将管紧密地置于磁性样品架中，向样品加入720pi清洗緩冲液(lOmMPBS、0.05%Tween20),然后于磁力场中再温育2分钟。在样品管保持在磁性样品架中的情况下，通过将L-1000吸液枪头落到管底部并吸出所有緩冲液和样品(留下铁氧体磁珠的两个分立点"蛇眼"，其在力场中稳定地附着于容器壁)，小心地去除所有样品液体。然后由样品架中移开管，用900|ilPBS-0.05%Tween清洗緩冲液清洗珠。再将样品置于力场中2分钟以附着珠。再重复清洗步骤，使得实现3次清洗(初始的720^掺入和2次随后的清洗)。然后使用250iul透析KPLOi链特异性的)生物素化抗牛IgM(0.3pg/ml的标准稀释緩冲液)将珠由样品壁清洗回溶液中。珠于室温与生物素化抗体温育IO分钟。再将720iulPBS-Tween清洗緩沖液掺入样品，如前对第一个样品温育步骤的描述在磁铁上温育和清洗。然后再由磁力场中取出仅含铁氧体磁珠的管，使用200plHRPSA(0.2吗/ml的标准稀释緩冲溶液)将珠分配入溶液中，它们在溶液中于室温温育5分钟。最后，使用相同方法将720plPBS-Tween清洗緩冲液掺入样品中，通过以2分钟间隔分散并附着珠清洗两次。然后将200^鲁米那过氧化物(Pierce)的1:1混合物加入到各个管中，均一地将珠分散入溶液中。将全部200pl鲁米那-过氧化物-珠复合物转移入透明的可拆孔(breakawaywell)中，沉积入12个样品池(l个样品始终是阴性对照样品，由测试为TB阴性的牛血清的合并收集物组成)中用于成像。发射的光子在上述TOADTM装置上捕获10分钟。然后用自动阈值分配对包括阴性对照以及背景(由4个背景场的平均信号确定)在内的每个样品的观测值进行软件处理。结果由程序确定为MZn;阴性或阳性。阳性在如上所述的两轮反射中复测。可遵循此通用步骤或依据本领域众所周知的技术通过常规实验对此通用步骤进行修改。以下描述了用于要求保护的方法的更详细的代表性逐步方案。技术人员会认识到，以下列出的详细方案步骤代表了要求保护的方法的优选实施方案，各个步骤、浓度、量、时间等可通过常规实验在要求保护的方法范围内改变。优选应配制所有血清稀释度，所有测试都在1.5mlEppendorfProteinLoBind管中进行。每个(12个样品)样品池都包含1个阴性对照样品。使用280jal等份的TB测试阴性的牛血清(1:50稀释度)合并收集物来代替单独的血清样品，并同待测试的牛样品完全相同地处理。纳入阳性对照是可选的，但为了测定试剂的质控检验而定期运行是一个好注意。将50pi于标准PriTest稀释緩冲液(lOmMPBS、0.1%BSA、0.05%ProClin)中配制的0.04mg/mlBBSA缀合的BangsBiomag珠溶液分配入1.5mlEppendorfProteinLoBind管中。加入另外的280pi稀释緩沖液，达到附着珠至磁铁的体积。阳性对照同其它样品完全一样由以下的第6步(清洗步骤)开始处理。1)通过加入20iLil全牛血清(无叠氮化钠)至980mJ稀幹緩冲液(10mMPBS、0.1%BSA、0.05%ProClin)，并将等份280jxl加入至1.5mlEppendorfProteinLoBind管中，制备1:50稀释度的各个血清样品。2)将0.05mg/mlESAT-6/CFP-10BangsBiomag珠缀合物的70)ul充分分散溶液用滴管移入280jxl牛血清样品中，于室温温育15分钟。将各个管紧密地置于磁性孔中，对样品掺入720ilU清洗緩沖液(10mMPBS、0.05%Tween20)。在磁4失上再温育2分钟，以允许在接触磁铁的管侧形成铁氧体磁珠的凝缩斑点'两点，。3)通过将L-1000移液枪头置于管中并以平滑稳定液流由底部吸出液体，直至在尖端观察到气泡，小心地由管中吸出液体，不扰动结合在管側的珠。(在整个方案中一个移液枪头用于1个样品)。4)在由磁性孔取出管后，加入900pi清洗緩沖液，通过靠着管壁的枪头緩慢吸入和排出溶液将珠轻柔地混合回溶液中(小心使起泡最小)。将管放回磁性孔中，温育2分钟。如上所述用滴管移出液体，不扰动结合的珠。再重复此步骤1次，总共进行3次清洗(初始掺入和2次随后的清洗)。5)在由磁性孔中取出管后，向每个样品加入以0.3)ug/ml在稀释緩沖液中制备的250fil透析KPL生物素-缀合亲和纯化的山羊抗牛IgM(vi链特异性的)抗体，通过轻^:手动涡旋将珠分散入溶液中。于室温温育10分钟，紧密地置于磁性孔中，掺入720pl清洗緩冲液，再温育2分钟。6)同笫3步一样小心地用滴管移出液体，如先前第4步中所述进行另2次清洗步骤。由磁性孔中取出样品管。7)向各个管加入200piPierceHRP-SA(以0.2吗/ml在稀释緩冲液中制备)，将珠分散入溶液中，于室温温育5分钟。紧密地置于磁性孔中，将720^清洗緩冲液掺入样品中，于室温温育2分钟。8)小心地用滴管移出液体，如先前第4步中所述进行另2次清洗步骤。由磁性孔中取出样品管。9)以1:1比率制备PierceSuperSignalWestPicoLuminolEnhancer和SuperSignalWestPicoStablePeroxide的溶液，加入200pi至各个样品管中。手动轻^L涡旋各个管的内容物，用L-200移液枪头将液体喷至管下侧，以将珠分散入溶液中。将全部200pi体积由各个样品管转移入透明的塑料可拆孔中，沉积入12个样品池(其中1个样品是合并的M/)ov阴性血清的阴性对照(l:50稀释度))中。10)使用冷却的CCD高分辨率照相机在优化条件下在如上所述的TOADTM装置上捕获发射的光子10分钟，用软件分析。各个样品和阴性对照以及背景(由4个背景场的平均值确定)的观测值导入到反射检测一自动阈值调整Excel表格模板中。通过excel模板中的算法分析各个样品的结果，给出指明的Af6ov阴性或阳性。在此第一轮筛选中的阳性完全如上所述进行复测(反射检测弁1)。在此第二轮检测中的阳性进行最后一次检测(反射检测#2),以证实阳性状态(牛分支杆菌感染)。结果使用PriTest快速诊断测试和反射辅助检测获得的3个盲灵敏度和特异性研究的结果合并入一个99个样品的研究中。初始筛选的结果示于表5。用铁氧体缀合物GWESAT70|ul、0.04mg/ml探针、10mMPBS0.05%Tween20清洗緩冲液、IgM0.3pg/ml10mMPBS0.1%BSA0.05%PC抗体溶液、0.2jag/mlHRPSA、10mMPBS0.1%BSA0.05%PC以15、10、5分钟温育周期如上所述进行测定。3个研究表现出平均灵敏度88,特异性84、ROC0.94、PPV52和NPV96。11个血清和阴性对照的单个样品池的代表性图像示于图15。反射辅助检测的优势示于表8。显然，反射辅助检测步骤降低了所获假阳性结果的数量。已对血清完成了超过500个测试。约20个阳性样品和更多的阴性血清样品以1:50稀释度用于鉴别影响测定有效性的因素。以下讨论了这些因素中的一些。温度对测定的影响可显著改变结果。低温(约4'C)和高温(约37。C)均使阳性和阴性血清样品彼此之间的区分变得困难得多。在高温时，包括阴性血清在内的所有样品似乎都非常强地反应，使得产生如此之多的光，以至于信号基本上不能被辨别。降低温度对阴性和阳性血清的信号损失具有完全相反的影响。优选的温度看起来非常蘇近室温(约2rc)。基于有限的分析，最佳的信号于pH约7.4检测。降低pH至4.0导致阳性血清信号显著降低。^參,责必二在在测定中测试了许多生物素化二抗，包括生物素化IgY抗牛IgG、生物素化山羊IgG抗牛IgG和生物素化山羊IgG抗牛IgM。还测试了组合。所有单独和组合的测试都已不同程度地成功区分了阳性和阴性血清，但使用的最简单和现时最佳的抗体是生物素化山羊IgG抗牛IgM。采用0.2貼/mlHRP—SA的最佳浓度是0.3)ug/mlIgM的标准稀释緩沖溶液。蛋白的铁氧体磁珠缀合物。发现A蛋白在产生假阳性结果和/或高背景方面明显干扰测定进展。在RecAg缀合过程中，在溶剂或底物中即使存在痕量的A蛋白也导致珠与生物素化抗体和牛血清抗体强反应。在痕量污染下，阴性对照的背景信号将和阳性血清测试一样明亮或更明亮。A蛋白常用于抗体纯化程序，经常与抗体共洗脱，必须被消除，否则就观察到假阳性信号。这是确定无疑的，与抗体如何使用无关，因为A蛋白既结合Fc又结合Fab(程度较低)，使得可以桥接其它抗体。如果抗体缀合至铁氧体磁珠并在混合物中具有A蛋白，则一些A蛋白将同抗体一起沉在铁氧体磁珠上。因为我们通常用针对一抗铁氧体上的抗体应答，所以(通过与鲁米诺的HRPSA反应)获得的任何生物素都应被假定为证实一抗已选取了表位。但是，在铁氧体磁珠上有A蛋白和灵敏检测器的情况下，A蛋白捕获了一些生物素化二抗，导致在测定结束时检测到光，而不管一抗所产生的情况。在没有表位的情况下检测到假阳性。如果抗体生物素化(计划作为二抗检测物)且存在A蛋白，则一些A蛋白被生物素化，因为其与生物素化抗体的Fc和Fab结合，甚至在透析后也沉在试剂中。因为A蛋白可在两个抗体之间建桥连接它们，所以即便不存在表位，生物素化抗体也将连接至铁氧体上的抗体(或印迹到硝酸纤维素上)，再产生假阳性检测。^#遽一#以去發^4f冷A蛋白对抗体的结合性在低pH急剧下降。我们使用lOmM甘氨酸pH2.8透析，通过将抗体置于具有100kD膜截流分子量的透析管中驱动解离，向甘氨酸加入阳离子树脂，以捕获透析液中穿过膜的蛋白。通常，将lg强阳离子交换树脂加入到甘氨酸pH2.8中，1升交换液对膜管(floatalyzer)中的5ml抗体，透析以2-3升交换液进行16-24小时。透析液转换为pH7.410mMPBS，以2-3升交换液再继续透析16-24小时。所以，比率在甘氨酸緩冲液pH2.8中为200:1x3，在PBS介质中是相同的(百万倍的第一和第二交换比率)。如果用生物素化抗体操作，则将10mMPBS0.1%BSA0.05%proclin(抗-微生物抑制剂)溶液用于笫二组交换。这产生非常纯的抗体，在第一个实例中是在PBS中，准备用于铁氧体磁珠缀合或生物素化，在第二个实例中准备稀释至适于测定操作的水平。^/0H)^7^UZ)义V、的蛋冷哞^^^蛋冷该类蛋白通常是表位。如果存在A蛋白，则免疫测定将不正确操作，因为A蛋白非特异性结合抗体，假定表位污染了A蛋白。在结合强的pH下使用抗体结合A蛋白。第一步是将优选无生物素的合适IgG抗体掺入蛋白溶液。所述抗体还应当来自与在测定中一般使用的抗体不同的家族。所述抗体与蛋白溶液温育30分钟，通常在pH7.4的PBS溶液中。然后，使用100kD膜过滤器(例如Amiconl00kD滤器)过滤并收集滤过液。47kD的A蛋白一般应通过滤器，但其与结合其的抗体一起不能通过。目标蛋白通过该滤器并收集，没有A蛋白。收集的蛋白对PBSpH7.4透析。典型实例应是约为27kD的CFP10ESAT6。将1ml体积、500pg/mL的融合蛋白溶液掺入50]uL、0.7jig/mL山羊抗小鼠IgG抗体，并使其温育30分钟。将溶液转移至Amicon100kD滤器，放入离心机中离心并收集滤过液。回收的滤过液体积约为1ml。将滤过液转移至1mL的10kD膜透析管中，并置于1L10mMPBSpH7.4溶液中，以3次交换透析24小时以上。然后按照改良方案将新鲜分离的融合蛋白缀合至铁氧体磁珠。由缓冲液和其它试剂去除A蛋白许多商品化试剂污染了A蛋白。所有试剂在活化缀合步骤前都通过30kDAmicon滤器过滤，以确认A蛋白在这些时刻没有被疏忽地放回到混合物中。例如，在缀合前的铁氧体》兹珠的MES清洗步骤中，以及在制备用于珠活化的EDC和NHS试剂时，预过滤MES。过滤的溶液或干净的溶液还用于猝灭然后稳定珠。^的存活力开发M6v测定的一个困难涉及样品分析中的显著存活力。即使在重复测试相同样品时，也经常观察到与阴性对照合并物相比相对发光度的显著变化。启用了许多技术修改和方法改进使变异问题最小，但就任何给定样品的绝对RL值而言重现性仍很差。然而，最终意识到，阴性血清和阳性血清在以下范围内表现不同阳性血清持久地大大高于用作阴性对照的阴性血清合并物，而测试高的阴性血清不会一直测试高，可通过反射辅助检测消除。一般来说，发现在阳性血清阈值设定为超出测试的多个阴性血清平均值约1.6标准偏差时，获得非常可重现的结果。在此阈值下单次无反射筛选(例如表5)中的灵敏度为88%,特异性为84%。全部99个样品都使用随机化和盲方案4企测，以避免分析中任何可能的偏差。一些阳性血清看起来阳性很弱，但在初始筛选中和辅助反射检测中仍可检测到。初始筛选和辅助反射检测结果的对比示于表5。重要的是认识到在非常低的流行状态下，任何低于100%特异性的测试都将产生许多假阳性，使阳性预测值几乎无用。通过采用反射辅助检测策略，随着每次放行测试的动物群被强化和集中，前提是灵敏度仍高。这使得有可能消除假阳性，有把握鉴别确实感染的动物。一些优化测定的决定因素涉及在清洗緩沖液中使用0.05%Tween和使用Lobindeppendorf管。塑料容器表面上非常低但不可预测量的吸附有助于存活力，此存活力在Lobind形式中可被降低。投入了相当大的精力来寻找可能的珠损失的证据，但这在观察到的变化中似乎不是一个显著因素。ROC曲线数据还可通过另一种叫做ROC(接受者操作特征)曲线的统计学应用来分析，由于任何检测的阈值位置是变化的，所以ROC曲线考虑了灵敏度和特异性的变化。检测在区分真阴性和真阳性这两个群方面有多有用通过检查ROC曲线下的面积来表征。面积越接近0.5,检测越差，面积越接近1.0,才企测越好。在一次使用本文公开的快速诊断检测的初始筛选后ROC曲线下面积为0.94(图16)。阳性预测值和流行率使用报告的CaudalFold、Bovigam的灵敏度和特异性值以及在使用反射辅助检测测试的99个随机牛血清的当前公开测定的结果，以下显示了基于所使用方法的阳性预测值(PPV)的直接对比(图18)。对于给定流行率，具有较高PPV的测试将更精确地预测哪些动物被感染。阳性预测值通过下式计算组中的总真阳性血清_未检测出的真.阳性研究中才企测出的总阳性当前要求保护的方法在阳性预测值方面超越现有测定Bovigam和Caudalfold的优越性由图18显而易见。对于反射辅助检测，因为高特异性(99%),预期在低流行率检测环境中预测的大部分假阳性将被放行，而不是被不正确地屠宰，这由采用本文公开的反射辅助检测方法降低了假阳性数表明。结论本文公开了使用重组体快速(低于4小时)区分牛分支杆菌阳性感染牛和未感染牛的方法。筛选99个样品产生88%的灵敏度和84%的特异性。通过调整阈值，检测可设定为以约74%的特异性捕获100%的阳性感染动物。反射辅助检测通过降低或消除假阳性结果产生改进的结果。仅需要最低数量的额外检测将特异性增加至99%，灵敏度(88%)没有任何改变。根据PPV,公开的反射辅助检测方法优于本领域目前已知的最精确测试Bovigam或Caudalfold测试中的任一种。因为其更快和成本低得多，对实施没有技术要求，所以是根除牛中的牛分支杆菌的有用工具。血清是唯一需要的样品，所以单次到访和取样可提供确定动物是否感染的需要信息。血清可冷冻储存不受限的时间段，直至准备开始检测。可在视为合适的情况下进行重复检测，没有任何取血样时已改变了动物的免疫应答的顾虑。实施例2.检测病原体的方法本发明的方法、组合物和装置允许使用CP10—ESAT融合蛋白测定有效和快速地鉴别和分离结核病感染动物。在这种测定中，使展示出牛分支杆菌的一种或多种抗原性表位的合成蛋白或肽与预期感染牛分支杆菌的动物的血液、血清或血浆反应。抗体与靶抗原结合表明动物被牛分支杆菌感染。由于使用的CP10—ESAT融合蛋白表现出与已知感染其它物种如人的分支杆菌品系的免疫交叉反应性，所以技术人员会认识到，可使用相同的组合物、装置和方法检测其它物种中的结核病，例如人、野牛、鹿或已知为分支杆菌属潜在携带者的任何其它动物。与CP10和ESAT同源的蛋白是众所周知的各种分支杆菌属的抗原(例如vanPittius等，GenomeBiology2(10),2001)。在CP10—ESAT融合蛋白连接至基质(如蛋白芯片、GrabberTM载玻片或磁珠)的情况下，感染宿主血液中存在的抗分支杆菌属的抗体也将结合基质。在适宜的清洗步骤后，例如可通过加入商品化生物素化抗牛抗体，接着使用缀合的HRP-SA、过氧化物和鲁米诺如上所述进行化学发光测定，检测样品中抗分支杆菌属抗体的存在情况。在盲研究中使用上述方案测试开头的一组33个牛血清样品。在测定条件下，有0个假阴性结果。在33个盲样品中，在第一轮测定中获得4个假阳性结果。使用较高灵敏度的相同测定对在第一轮测试阳性的各个样品进行反射检测。在反射检测后，假阳性数降为0。分析灵敏度对特异性的ROC曲线表明，所述测定以约70%的特异性基本可获得100%灵敏度，同时以约70%灵敏度获得100%特异性(参见例如表7和图16)。通过以100%灵敏度和70%特异性进行反射样品检测，有可能消除实际上全部的假阳性测试结果。技术人员会认识到，本文公开的反射辅助检测方法不限于检测结核病，而是可用于检测实际上任何类型的病原体、污染物、生物危害、生物战物质、患病细胞或其它病症，只要可获得合适的配体和/或探针。在此具体的代表性实施方案中，所述方法公开了使用相同测定在约100%灵敏度和约70%特异性的条件下对所有阳性样品进行辅助反射检测。在这些条件下，实际上没有假阴性结果。因此，各轮反复的反射检测将由阳性测试群中消除约70%的真阴性受试者。仅对先前轮次测试阳性的样品应用4轮反复反射检测在检测感染动物时应产生接近100%的准确性。例如，以70%特异性进行4轮反复检测应产生0.3x0.3x0.3x0.3或低于1%的假阳性率。使用5轮应产生约0.25%^艮阳性率。使用6轮应产生低于0.1%的假阳性率。此外，因为反射检测仅对阳性样品进行，所以每一轮进行的测定数快速下降，产生一种快速、有效和廉^f介的方法来获得接近100%的测试准确性。反射辅助检测策略在几小时内提供了针对感染动物的清晰路线，它们永不会再进入畜群感染其它动物。在发达国家，例如美国和欧洲，畜群中感染动物的百分率比较低。假定感染率是1/1,000，事件观测结果~~1000头牛可能有1头MB感染1头MB感染动物999头未感染动物98%灵敏度和特异性的测试结果20个"假阳性"才企测出每50个真阳性中的49个预期结果总共21头动物测试为阳性必须使用证实检测来发现1头感染动物，假定其没有返回畜群中感染其它动物假定使用的测定在实验室中一直可产生98%灵敏度和98%特异性。根据大部分标准这应被认为是相当好的。但在以上实施例中，筛选许多阴性动物以发现单个感染动物(1000头动物中1头感染)，我们预期应有20头未感染动物测试为假阳性。我们观察到单独的高灵敏度和特异性将不产生结果。我们预期在该组中应检测出21头动物阳性，假定感染动物没有悄悄退回到未检测到的假阴性畜群中。在98%灵敏度下，在每50头阳性动物中有1头会逃脱去再感染畜群。我们不知道如何鉴别21头动物中哪一头确实被感染。所以就必须对这21头动物进行昂贵得多的证实检测，以解决问题。如果畜群大小为10,000头，具有一头感染动物，则第一遍应产生201个阳性。并且，随着畜群中感染动物数量增加，将出现许多假阴性检测结果。未检测的动物将再进入感染畜群中的其它动物。没有单个检测始终一致地产生以100%确定性有效隔离感染动物所需要的灵敏度和特异性水平。反射辅助检测包括有意以其中假阳性正如所料的阈值检测，因为检测阳性的阈值已设定得低到足以捕获100%阳性感染动物。到那时，再以相同测定在笫二批中检测所有在笫一轮中未通过阴性的动物，第二批确实未感染的动物可安全放行。所述方法可以序贯步骤持续，直至证实了唯一的真阳性隔离动物，并快速集中于感染动物。该方法原则上远比单步骤测定有效。如果特异性在可预期100%灵敏度的阈值下为中等程度高，则每一轮放行大量动物。单管血清非常足够了，仅对"阳性，，结果动物重复检测。因为灵敏度为100%,所以在第一轮检测阳性并在第二或第三轮检测阴性的动物可作为确实未感染的动物安全放行。公开的代表性测定于针对100%灵敏度的阈值提供70%特异性。我们可以计算1000畜群数中弄清我们的阳性感染动物的数量。作为说明，显示了针对IO，OOO动物数量的计算结果。反射辅助检测观测结果感染的或"阳性的""阴'f生"放行1000头牛可能有1头MB感染1头MB感染999头未感染初始测试筛选300700反射弁l90210反射#22763反射#3819反射斜26总数427998头测试未感染保留各头动物的血清，只有在检测中为阳性的才反射检测。由1000头畜群范围内隔离出2头动物的测试总数是1128,对于每头动物,少于1ml的血清对完成全部测试绰绰有余。因为每轮放行如此多的动物，所以将感染动物隔离至两种可能性之一只需要128次额外检测。为在10,000大小的畜群中筛选和挑出2头动物，应当仅需要6次反射检测步骤和11,285次检测。我们预期在初始筛选中应放行7,000头动物。实施例3.对TB检测的进一步研究尽管在诊断学领域有许多技术优势，但迄今为止没有快速、廉价和准确的方法来诊断即便最小的活动性分支杆菌感染。没有一种测试处于其它测试之上，它们一般都很差，灵敏度或特异性不足。Zahrani等(Am.J.Respir.Crit.CareMed.,162巻，笫4期，2000,1323-1329)报告了60例活动性TB中的典型诊断结果。以下检测的灵敏度和特异性分别为分支杆菌培养物73%和100%;PCR42%和100%;胸X-射线67-77°/。和66-76%;结核菌素测试94%和20%;以及血清学33%和87%。结核菌素测试是目前唯一能够检测潜伏疾病的测试，但利用该方法有许多假阳性测试。尽管已长期和持续地研究可检测针对分支杆菌感染的循环抗体的血清学测定，但使用侧向流动或ELISA法的结果一般较差。血清学测试是令人感兴趣的，因为它们和其它方法相比一般是快速的，需要非常少的检测材料，并使感染人的机会最小，否则人要处理活动性疾病患者的感染组织(例如痰样)。血清测试还提供了检测潜伏非活动性疾病的可能性，使得其可早期治疗，使将来的并发症以及由一个个体向另一个个体的传播最小。这在HIVTB感染患者中特别令人感兴趣，HIVTB感染患者快速死于TB,可将感染传播给其它接触者。不知道确切地为什么循环分支杆菌抗体如此难以捉摸地逃脱检测。有许多假设。本发明公开内容显示的代表性方法、组合物、成像软件和仪器在以高灵敏度和特异性用于与人TB紧密相似的疾病(感染牛分支杆菌的牛和獾)时，已经显示出抗体大量存在，容易检测到活动性和潜伏形式的疾病。牛分支杆菌(Mbv)血清学测试和人中的TB血清学测试一样，在历史上不能准确4企测和区分感染动物和未感染动物。(Wood,P.R.和Rothel,J.S.Invitroimmunodiagnosticassaysforbovinetuberculosis.1994,Vet.Micro,40:125-135)。4吏用相同的方法、组合物和装置可实现对人TB的快速、准确和节省成本的检测。本文公开的针对牛分支杆菌(M6v)感染的代表性实施方案提供了用于广泛筛选牛中的TB感染的理想血清学方法。还已表明其在獾测试中表现良好。测试似乎产生高准确度，导致初始筛选少于2小时，不需要高水平的技术知识。使用血清的反射辅助检测对最小假阳性的灵敏度和特异性进优化。可使用相同方法，采用仅一滴血以高特异性和灵敏度检测人中的TB。与MarkChambers(VLA)进行合作研究，以测试獾血清的TB。研究表明，有可能根据Mbv抗体阳性或阴性区分獾，其通过Mbv培养证实。Mbv培养阳性的獾产生针对不同表位的抗体，所述表位包括MPB83和CFP10一BSAT6(融合蛋白)。基于抗体的测定用于鉴别未感染和阳性感染的獾。基于H&E和培养证实的Mbv阳性和未感染(阴性)獾的獾血清样品获得并报告优化结果。阴性对照研究和参比值通过研究捕获的已知从未感染的獾获得。检测针对分支杆菌抗原的抗体的通用流程示于图25。铁氧体表位缀合物用于鉴别和分离针对Mbv的抗体，条件是血清中存在Mbv抗体。相同的测试可用于检测人中的TB。缀合物与稀释血清温育30分钟。然后在磁性孔(magneticport)收集铁氧体。用过的稀释血清废弃。清洗铁氧体缀合物，以去除残余的痕量獾血清。再收集它们，然后悬浮在具有抗獾(或牛)抗体的抗体的溶液中。通过向溶液中加入生物素化兔抗小鼠或抗小鸡抗体检测附着于缀合物的抗体。20分钟后，再收集铁氧体缀合物，清洗，然后在辣根过氧化物酶中悬浮10分钟。然后收集铁氧体，清洗两次，并悬浮在鲁米诺过氧化物中。然后将鲁米诺过氧化物铁氧体缀合物转移至蜂窝盒用于成像。测试了两个表位。MPB83用于测试英国研究者提供的非常大量的獾和牛的所有血清。我们另外又在MPB83测试为阳性的接种和未接种獾血清中测试了CFP10—ESAT6。测定首先以基于培养、H&E和死后^r查的非常准确的指定优化，随后在盲研究中通过单独的准确表明与阳性和阴性疾病指定强相关的血清分析优化(参见表14)。相对于盒中的背景和各个其它样品检测各个样品的发光度。相对于Mbv培养阳性的獾的信号，检测处理的Mbv培养阴性的獾(或牛)样品的信号强度，以鉴别针对所述表位的抗体。MPB83铁氧体缀合物似乎精确地鉴别人工感染的接种捕获獾。这还在牛中^f吏用合适抗体组合证实。为进一步测定BCG可在测定中引起干扰的可能性，我们需要从未人工感染过的接种捕获獾的血清样品。BCG接种和从未感染的捕获獾血清样品被纳入作为野外獾研究中的阴性对照血清，该组中除一个样品与其它阴性血清无法区分外，这些阴性对照血清强有力地表明，铁氧体探针上的MPB83抗原仍能区分感染动物和BCG接种的未感染动物。3名不同操作者在3台不同仪器上以盲研究测试了接近一半的1500多个獾样品。灵敏度和特异性在样品筛选中均接近90%，ROC面积一直在0.95-1.0之间。英国测试牛血清的冷冻安瓿由MartinVordermeier(UK)提供，指定基于皮试和培养结果。牛血清基于MPB83或CFP10—ESAT6铁氧体缀合物被快速鉴别为阳性感染或阴性感染。在牛测试中获得的特异性和灵敏度的种类根据优化方案示于图26。表14:Mbv感染的牛和獾的筛选和反射辅助检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>^射裙磁检刺,没有一个测试始终一致地产生使预期出现的假阳性数最小所要求的灵敏度和特异性水平，即便在好的测定方法中。反射辅助检测包括有意以其中在测定筛选部分^f艮阳性如所预期和承受的阈值测试，因为检测阳性的阈值已设定得低到足以捕荻100%的阳性感染动物。这样做提升了统计的、精确鉴别的阳性反应者。筛选中所有阳性样品的反射辅助检测(RSTest)以筛选特异性特有的速率反复地消除了假阳性。以此方法，保留并鉴别了真阳性血清，而假阳性样品在随后的检测中被表明对疾病确实是阴性。我们发现，该测试方法在鉴别真阳性方面更有效，同时使不正确指定为阳性的数目最小。对于当前公开的测定中的高特异性和灵敏度，理想测试结果需要相对少的重复。相同方法可应用于检测人中的TB。已进行了超过1500头牛的测试，测定优化方法有许多改进。正确选择用于铁氧体缀合的抗体和抗原很重要。我们也开始认识到，某些蛋白可多么强烈地干扰血清测试。例如，A蛋白即便在非常低的水平伴随附着于铁氧体探针的抗原，也引起如此多的干扰，以至于测试几乎无用。观察到许多假阳性结果，没有合适的步骤来消除这些种类的污染物。大部分抗体在A蛋白柱上亲和纯化，引入了一种许多研究者不认为有问题的显著干扰组分。这可部分解释为什么侧向流动和ELISA法是相当不敏感的检测方法。实施例4.人TB检测公开的CCD成像技术和软件可始终如一地检测达到阿克(10一18)/mL水平的靶蛋白。在适当选择的抗原附着于铁氧体缀合物的情况下，还可提供用于人TB的血清学测试，其高度准确、廉^f介和快速。对患病人血清的充分表征的阳性和阴性样品进行MPB83和CFP10_ESAT6铁氧体缀合物检测。还可检验其它抗原或抗原组合。根据牛和獾检测，在人血清TB测试中，潜伏和活动性疾病均在2小时测试期内以高灵敏度和特异性被鉴别出来。本文公开和要求保护的所有组合物、方法和装置都可按照本文公开内容制备和执行，不需要过度实验。尽管已就优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对本领域技术人员显而易见的是，可将改变应用于所述组合物、方法和装置，以及应用在本文所述方法的步骤中或顺序步骤中，而不偏离本发明的理念、精神和范围。更具体地说，显然，某些在化学和生理上均相关的物质可替代本文描述的物质，同时会获得相同或相似的结果。所有这些相似的替代和改变对本领域技术人员是显而易见的，被视为属于所附权利要求限定的本发明精神、范围和理念的范围。表l.非限制，t不定种的方丈线杆菌(^4criwo6ac77/M51jf/;.)不定种的放线菌(/4"/"o附戸5卿.)A泉病毒(l、2、3、4、5和7型)腺病毒(40和41型)'不定种的气球菌(^eracoc，卿.)嗜水气单胞菌(/!erowowos/^ro卢/a)十二指肠钩虫(^"c^y/oWo附art/wofifewa/e)广州管圆线虫(^"g7'cwfro"gy/w51似虫引烟线虫(^scan's/M加6A7'co/cfe5:)不定种的虫0虫(<4jra〃'J卿.)不定种的曲霉045perg/Z/tw5fip.)炭疽杆菌(5ac〃/wa",Arac/力蜡状芽胞杆菌(万ac///^cerew》不定种的类杆菌(万actera/fifes4pp.)结肠小袋纤毛虫^a/a"/W/wwco//)杆菌样巴通体(万arto"e〃a6w7/(/bA7w'j)皮炎芽生菌(祝a对ow少ces蓝舌病毒(Bluetonguevirus)支气管败血性博代氏杆菌(Bwcfete//a百日咳博德特氏菌(5orafe/e〃a/7eW脂/力博氏疏螺旋体(万orWa6wr^to^/m')粘膜炎布兰汉氏球菌不定种的4"鲁斯氏菌(Bn/ce/tow/.)牛布鲁菌(及a6oW船)伯氏考克斯氏体(Cow'e〃a6mw"〃)柯萨奇病毒(Coxsackievirus)克-雅氏病致病因子(Creutzfeldt-Jakobagent),库鲁病致病因子(Kuruagent)克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congohemorrhagicfevervirus)新型隐球菌(C，tococcws"eo/or膨"s)小5求隐孑包子虫(CA7/7tos/7on'd/Mm/arvww)H^衣'tt媽席停马耳他布鲁氏菌(及附e/"e"w》猪布鲁菌(及不定种的布鲁线虫(万n/^a^sp/7.)鼻疽伯克霍尔德-菌(jBwrA/ioAier/awa〃e/)类鼻疽伯克霍尔德、菌(6wrA/w/cfeha胎儿弯曲杆菌胎儿亚种(Caw/^/o6acfer/eto滞6取空肠弯曲杆菌(Ca/w/^/o6acter结肠弯曲菌(C.co//)胎儿弯曲杆菌空肠亚种(C./eftw5w&sp.白色念珠菌(Ca"cft'rfaa/Z^cara)不定种的二氧化碳嗜纤维菌鹦A热衣原体((7///0^>^^;wz7toc/)沙百艮衣原、体(C7/a/w少af/afrac/jo附art5)不定种的柠檬酸杆菌(C/伊o6acter^,)华支睾吸虫(C7o"o/"c/m'sw'"e;w/s)肉毒杆菌((7/015^7'￡//"/6o似/z'WM7W)艰难梭菌〖C/(W的fifrMW减折C/fe)产气荚膜梭菌(C/asWfift.w/M/e圻/wge"力破伤风杆菌(C7asfrWww/"aw)不定种的石皮伤风杆菌(C/仍fr/fiffM/WJT/7/.)粗球抱子菌(Coccififto油sf加7w他)科洛拉多蜱热病毒(Coloradotickfevervirus)白喉杆菌(Ccvjwe6flrcte〃'i/附c/^pfe/en'ae)肠道病原性大肠杆菌(E^cAer/c/H'aco//,e她ro戸决oge附'c)肠毒'f生大肠；+干菌(Esc/ier/cA/"co//,肝片吸虫(Fosc/o/a/e/a,/ca)土拉弗朗西斯菌(Frawc/i^〃a似/ar/"e"^)不定种的梭形杆菌(Fww6a"eA7'歸鄉.)溶血孪生球菌/we/wofyja—蓝氏贾第鞭毛虫(G/ara^/awZ>//a)巨纟田月包病毒(Cytomegalovirus)登革热病毒(Denguevirus)(l、2、3、4)类白喉菌(D^础era他)东部(西部)马脑脊髓炎病毒(Eastern(Western)equineencephalitisvirus)埃博拉病毒纟田沣立棘j求绦虫(五c/z'"ococcms^ra"w/o5M5)多房棘球绦虫(五c/l!'"OCOCCW51埃可病毒(Echovirus)迟钝爱德华菌(￡ywarfi>we//atorab)'溶组织内阿米巴(五"fawoe6a/w'对o(yrtca)不定种的肠细菌C&ztera6acterw/.)肠病毒70(Enterovirus70)絮状表皮癣菌不定种的小孑包子菌(A^cra驴orw/w^/.)不定种的毛裤菌(7Wc/io/7A!yto"EB病毒肠出血小生大肠杆菌(Eyc/^n'cWaco//,肠侵袭性大肠杆菌(J&c/jer/c/w'aco//,胡宁病毒/马丘波病毒(Juninvirus/Machupovirus)不定种的克雷伯氏会(XMwW/a^;.)科萨努尔森^木病病毒(KyasanurForestdiseasevirus)不定种的乳杆菌(Lac/otoc///^s/7/.)嗜肺军团菌(Ze^7'o加〃a/7"ew附o/;/H7a)不定种的利什曼原虫(Ze/s/wwaw/a^;.)问号钩体(Z/取。5p/ra/"femg^ms)单核细胞增多性李斯特菌(Li对eha巴细胞性络丛脑膜炎病毒(Lymphocyticchoriomeningitisvirus)马尔堡病毒(Marburgvirus)麻渗病毒(Measlesvirus)不定种的微5求菌(M/crococa/s5/p,)不定种的莫4立菌(MoraxeZ/aw/.)不定种的贾第鞭毛虫(G/flrWa少p.)杜克雷嗜血杆菌(//ae/wo/Miw血cre[y/)B型流感嗜血杆菌(//aewo;/a7iw//1/7j/e"加e(^ow/6」)汉坦病毒(riantavirus)甲肝病毒乙肝病毒丙肝病毒丁肝病毒戊肝病毒单纯疱渗病毒猿猴疱療病毒(说Apw-Am57'/w/ae)荚膜组织胞浆菌(/feto户/aswa人冠状病毒人免疫缺陷病毒人乳头瘤病毒人轮状病毒人T细胞淋巴营养病毒流感病毒鄂木斯克出血热病毒旋盘尾丝虫(O"c/ocercavo/vm/m51)不定种的后睾吸虫(OjW'对OAr/^5p/.)细小病毒B19不定种的巴氏杆菌(AwfeweZ/a)不定种的消化球菌(尸印tococo/sV/.)不定种的消化链球菌类志贺邻单胞菌(尸/ej7'o附owos玻瓦桑脑炎病毒(Powassanencephalitisvirus)不定种的变形杆菌(iVofew5pp.)不定种的寸艮单月包菌(尸化WCfowO/KM)狂犬病病毒(Rabiesvirus)p乎吸道合月包体病毒(Respiratorysyncytialvirus)不定种的分支杆菌(綺coto"e"'M/w鄉.)结核分支杆菌(A^co&fl"m'扁ft/6ercw/cw7.5),牛分支軒菌(M6ov/力人型支原体(A^co//owwt/cww'"h),口腔支原体(M:ora/e)，唾液支原体(A/.，发酵支原体(M/er附e"torn)肺炎支原体(A^co//as膨/we"/wo/w'ae)福氏耐格里阿米巴(Waeg/m'at/ow/m)美洲板口线虫(iVica/OA"a/wer/cam/力奈瑟氏淋病双球菌(淑鹏r/a脑膜炎奈瑟氏菌(倫》犯由附e"/喂'tofo)不定种的奈瑟氏菌(iVe/鹏r/a卿.)不定种的诺卡氏菌(iVocarcft'aw户.)诺瓦克病毒(Norwalkvirus)瘙痒病因子CSbrap/eage"0不定种的沙雷氏菌(&m^/a)不定种的志贺氏菌0%/^//"乎/.)辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)申克孢子丝菌弥orc^/w/x:^c/;ewc始)圣路易斯脑炎病毒(St,Louisencephalitisvirus)墨莱溪谷脑炎病毒(MurrayValleyencephalitisvirus)金黄色葡萄球菌OSVa/j/jy/ococowawrew力念珠状链杆菌(Sfrepto6adZ/Mi1无乳链J求菌(5Vre/tococowo;ga/ar"/ae)粪链球菌(浙取ococcwj/aecot//》肺炎链球菌(iSfre/7tococcws/)"ew附ow'ae)化脓性链5求菌(5Vre/7tococctw/y/oge"e力唾液链球菌(浙e/^ococow似"vor/w力牛肉绦虫(7bew/a加^7'"o^a)猪肉绦虫(raem'aso/z'wm)犬弓虫回虫(7bjcocaraca"z'力,3苗弓虫回虫(77.raft)刚i也弓形虫(7b;w/7/awwago"力7)鼻病毒(Rhinovirus)'J、珠立克次氏体(WcA:ete/a！afcwv)普氏立克次氏体(R/cAe加'aprawazefc/),力口拿大立克次氏体(RCa"acfat),立克氏立克次氏体(Wcfe咖'a罗斯河病毒/阿尼昂尼昂病毒(Rossrivervirus/O'Nyong-Nyongvirus)风渗病毒(Rubellavirus)猪霍乱沙门氏菌(&/mowe//a副<另寒沙、门菌(iSa/mo"e//a/7anarj^/H')伤寒沙门菌(^0(//0"6//00;//m')不定种的沙门菌(&/附0加//0^;.)不定种的吸虫(Sc/h'stoso腿鄉.)7K痘-带状痕渗病毒(Varicella-zostervirus)委内瑞拉马脑炎e《《/we7K'f生口咸炎病毒(Vesicularstomatitisvirus)霍乱弧菌血清变型01(F/6r/ocAo/erae,柳ovar0/)gij溶血瓜菌(F/6〃'opara/zae/Moft'CM力班氏吴策线虫(『Mc/erer/at6awcra///)黄热病毒(Yellowfevervirus)小肠结肠炎耶尔森菌(7ew/"/aeWer假结核耶尔森菌(F"erj/n/a鼠疫耶尔森菌(ye"/"/a/e甜)梅毒虫累旋体(7Ve/o"e/wa不定种的毛线虫(7>7'c/2/"e〃a^;.;阴道毛滴虫(7Wc/o附o"aj1vagz'"offo)毛首鞭形线虫(7hc/m〃\y/r/c//w")布氏锥虫(D7/awcw0附fl6rwcez')尿素分解尿素原体(C/reqpto腿症苗病毒表2:预测的RST数对特异性和流行率的依赖性<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表3:CMOS彩色成像仪的改变的滤色器<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>表4:Kodak1310成像传感器于670nm的量子效率和标准化系数<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>表5—牛TBS&S盲研究初始筛选Obs观测的样品数值BG样品间的背景数值RL相对发光度(Obs-BG)△NC差值(Obs-NC)NC合并的血清阴性对照值(未納入表中)Pos如果〉NC阈值则指定样品为阳性Neg如果<NC阈值则指定样品为阴性<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>表5(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>表5(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>表7:牛分支杆菌阳性和阴性的99个样品的ROC图1<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表8牛TBS&S盲研究总结<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>表8(续)<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>灵敏度88特异性99PPV94NPV96表9修饰的和不常见氨基酸<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>表10.筛选和RST测试结果之间的对比<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>权利要求1.一种用于检测一组样品中的病原体的方法，所述方法包括a)以约100％灵敏度测定所述样品的所述病原体存在情况；b)仅对显示出阳性测试结果的样品使用相同测定进行反复的复测；和c)仅对在每轮检测后显示出阳性测试结果的样品重复进行反复的复测，直至获得选定的准确度水平。2.权利要求l的方法，其中所述反复复测重复3、4、5或6轮。3.权利要求1的方法，其中所述测定具有100%的灵敏度和70%的选择性。4.权利要求l的方法，其中所述测定具有99%、99.5%、99.8%、99.9%或100%的灵敏度。5.权利要求1的方法，其中所述病原体为分支杆菌属(Myco6of"m'w附)物种。6.权利要求5的方法，其中所述病原体为牛分支杆菌7.权利要求5的方法，其中所述测定包括使CP10—ESAT融合蛋白与受试者的血液、血清或血浆样品接触，并检测结合所述融合蛋白的4元体。8.权利要求7的方法，其中所述受试者是牛、獾、野牛、鹿或人。9.权利要求1的反射辅助检测方法，其中假阴性结果数为零。10.权利要求7的方法，所述方法还包括使用生物素化山羊IgG抗牛IgM抗体、缀合辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白和鲁米那过氧化物溶液产生化学发光，^r测样品中抗融合蛋白抗体的存在情况。11.权利要求10的方法，其中化学发光使用全光学测定装置(TotalOpticalAssayDevice)才企测。12.权利要求10的方法，其中化学发光使用含反射蜂窝单元的盒检测。—13.权利要求10的方法，所述方法还包括对由各个样品检测的化'学发光信号进行数据分析。14.权利要求13的方法，其中所述数据分析包括自动阈值校正。15.权利要求13的方法，其中所述数据分析包括像素组的背景测定，所述像素组的背景设定为等于组中任何像素的最高背景发射。16.权利要求13的方法，其中所述数据分析包括应用量子效率才史正系数。17.权利要求14的方法，其中阳性结果的阈值设定为高出多个阴性样品的平均测试值约1.6个标准偏差。18.权利要求7的方法，其中所述融合蛋白缀合至磁珠。19.权利要求11的方法，所述方法还包括使用球形磁铁收集溶液中的磁珠。20.—种^r测样品中的分子标记的方法，所述方法包括a)以约100%灵敏度测定所述样品的所蜂分子标记存在情况；b)仅对显示出阳性测试结果的样品使用相同测定反复复测；和c)仅对在每轮检测后显示出阳性测试结果的样品重复进行反复复测，直至获得选定的准确度水平。21.权利要求20的方法，其中所述分子标记是病症标记。全文摘要本文公开内容涉及检测病原体和/或分子标记的方法、组合物和装置。在一个具体实施方案中，待检测的病原体可为牛分支杆菌(Mycobacteriumbovis)或任何其它在哺乳动物中引起结核病的分支杆菌属(Mycobacterium)物种。但是，公开的方法不是限制性的，实际上可筛选和检测任何类型的病原体和/或分子标记。优选实施方案包括使用约100％灵敏度和最高可能的对应特异性(在一个实施例中为70％)的相同测定的反射辅助检测。反复使用的这种测定条件导致每轮测试排除70％的未感染受试者。使用4轮或更多轮检测产生小于1％的误差。因为仅复测阳性样品，所以所述方法提供了一种快速、廉价和高度准确的检测感染受试者的方法。文档编号C12Q1/68GK101253272SQ200580047409公开日2008年8月27日申请日期2005年12月2日优先权日2004年12月3日发明者A·L·谢尔伍德,L·R·格林申请人:普里特斯特公司