在哺乳动物细胞中Li表达的抑制作用的制作方法

专利名称：在哺乳动物细胞中Li表达的抑制作用的制作方法
在哺乳动物细胞中Li表达的抑制作用
背景技术：
通过T淋巴细胞识别那些抗原的肽片段，能够调节对特异性抗原 的免疫反应。在抗原呈递细胞之内，；波处理抗原的肽片段与主要组织相容性 复合体(MHC)分子的抗原肽结合位点相连。然后，这种肽-MHC复合物被 传递到细胞表面，从而能够^皮辅助细胞上的T细胞受体或细胞毒性T'淋巴细 月包识别(识别外源肽和本MHC分子的邻4矣面)。存在两类能够供给肽的MHC 分子，I类MHC分子和II类MHC分子。 I类MHC分子将抗原呈递到CD8-细胞毒性阳性T-淋巴细月包中， 之后，抗原被活化并能够直接杀死抗原呈递细胞。在内质网中，在其合成时 刻左右，I类MHC分子只接受来自内源合成蛋白的肽，例如有传染性的病毒。 II类MHC分子呈递抗原到CD4 -阳性辅助T-淋巴细胞(T辅助 细胞)中。 一旦^t活化，T辅助细胞能够通过直接接触和细月包因子释it促进 细胞毒性T淋巴细胞的活化。与I类MHC分子不同，Il类MHC分子结合已 经经非特异性或特异性胞吞作用内在化的外源性抗原。在合成时刻左右，通 过与恒定的链蛋白(Ii)相结合阻止II类MHC分子与内源性抗原相结合。 从内质网将这种II类MHC-Ii蛋白质复合物传递到前-Golgi层，在此通过水 解4乍用释放Ii,结合夕卜源4元原肽(Daibata et al" Molecular Immunology 31: 255-260 (1994); Xu et al" Molecular Immunology 31: 723-731 (1994)) I类MHC分子和Il类MHC分子在细胞中有不同的分布。尽管 不同的细胞型表达水平不同，但是几乎所有的有核细胞都能表达I类MHC 分子。免疫系统的细胞在它们的表面上表达大量的I类MHC分子，而肝细 胞的表达水平相对较低。无核细胞很少表达或不表达I类MHC分子。II类 MHC分子高水平的表达在B'淋巴细月包和巨噬细月包上，而不是在其估J且织细 胞上，通过暴露于细胞因子中，许多其他细胞型可以被诱导表达II类MHC 分子。
在标准情况下，由于Ii蛋白总是与新生II类MHC分子共合成， 所以内源肽(带有可能导致自体免疫性疾病的自我决定因素)不结合非类 MHC分子。因为身体免疫监视系统从未看见过包含自动决定肽和II类MHC 分子，因此这些决定基的耐受性没有得到发展。在生长的个体中如果II类 MHC分子不受到Ii的才卬制，那么内源自主决定基会^皮II类MHC分子呈递， 起始对那些内源抗原的自身免疫反应。在某些自身免疫疾病中情况就是这 样。通过在恶性细胞中启动这种作用，可以对肺瘤的内源性抗原以治疗为目 的4吏用"自身免疫反应"，/人而限制S中瘤细力包的发育或者除去肺瘤细胞。在阴性-II类MHC分子、li -阴性肿瘤中已经显示了增大II类 MHC分子表达同时不伴随Ii蛋白增加的治疗效果(Ostrand-Rosenberg et al., Journal of Immunol. 144: 4068-4071 (1990》Clements etal., Journal of Immunol. 149: 2391-2396 (1992); Baskar et al" Ce〃. Immunol. 155: 123-133 (1994); Baskar et al" J. Exp. Med. 181: 619-629 (1995); and Armstrong et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6886-6891 (1997))。在这些研究中，转染II类MHC分子 基因进入ll类MHC-阴性鼠肉瘤细月包中，产生ll类MHC-阳'性的、^旦li-阴 性的肿瘤细月包系。将这些细月包注入MHC相容的宿主体内，能够延緩母体胂 瘤细胞的生长。由于Ii链妨碍内源肿瘤抗原的呈递，Ii蛋白基因与II类MHC 基因共转染进入肉瘤细胞系中，能够抑制Il类MHC基因的肺瘤-治疗效果。 用鼠黑素瘤细月包已经产生了具有可比4生的结果(Chen and Ananthaswamy， Journal of Immunology 151: 244-255 (1993)).通常认为，这种治疗方法的成功是由于树状细胞的天然活性。树 状细"包是专业的清除剂，能够处理进入肽中的外源4元原并将其/人细月包表面上 的MHC 4元原呈递给T '淋巴细月包。树4犬细月包具有通过I类MHC分子和II类 MHC分子呈递抗原的能力，4吏他们能够活化T辅助剂和T杀伤细^<。人们 认为，为了引起强大的T杀伤细胞反应，需要有效的T辅助细胞反应，并且 通过树4大细"包产生结合的活化作用能够导致增加的抗肿瘤反应(Ridge et al., Nature 193: 474-477 (1998); Schoenberger et al" Nature 193: 480-483 (1998))。 依据发现的肿瘤细胞，巨噬细胞系的树状细胞能够吸收并处理肿瘤净寺异性抗 原和肿瘤相关抗原。然后，树状细胞迁徙到排干肿瘤位点的淋巴结处，并存 在于新的T细胞发育结点皮层附近的结点处。在结点皮层，能够识别树状细 胞肿瘤决定簇的静止的T杀伤细胞^皮活化并增殖，随后被释放进入f盾环中， 作为有^:的抗肿瘤药物，杀手T细^^。
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尽管与T辅助细胞活化或"许可"树状细胞通过I类MHC分子呈 递抗原相互作用，并由ot匕活^匕T杀伤细月包，但是同时与T辅助细月包和T杀伤 细月包相互作用是没有必要的；在T辅助细胞调节的活化作用之后，活4匕的树 状细胞能够在相当长的一段时间内维持它们刺激T杀伤细胞的能力。分别被 II类MHC分子或I类MHC分子决定簇呈递的抗原肽不需要来自同一个4元原 蛋白，从恶性细胞中分离的两个或两个以上抗原可以净皮树状细胞处理并呈 递。所以，许可一个决定簇，或许不具有肿瘤特异性，带有该决定簇，就能 够许可其他具有肿瘤特异性的决定基活化T杀伤细胞。这种'minorl '或者 cryptic '决定蔟已经^皮用于各种各才羊的治疗目的(Mougdil et al.， J. Immunol. 159: 2574-2579 (1997》。
的免疫反应。许多肽通常不能用于引入II类MHC分子，为II类MHC分子 提供丰富的多变的肽源。这系列决定簇的开发引起反应性T辅助细胞凄史目的 膨胀。这种膨胀的数目引起树状细胞许可，其中有一些直接以肿瘤特异性决 定基和肺瘤相关决定基为目的。尽管正常细胞很可能共用肿瘤细胞决定簇， 但是在正常细胞中只产生4艮小的细J包损伤。这是因为抗肿瘤反应的多步文应子 反应(杀手T细胞的量，外界活化细胞因子，巨噬细胞的吞噬及其产物，等 等)并不直接针对正常细J包的原因。通过抑制II类MHC分子与Ii蛋白的相互作用可以改变正常的II 类MHC抗原抗原呈递作用。这一过程可以通减少Ii蛋白总数，(例如通过通 过减少表达)或通过用Ii免疫调节功能的干扰作用来完成。使用各种各冲羊的 反义技术可以实现Ii表达的抑制作用。已经有文献净艮道与用于Ii蛋白的 mRNA的AUG位点相互作用的反义低聚核普酸能够降低外源性抗原的II类 MHC呈递过考呈(Bertolino et al., Internal Immunology 3: 435-443 (1991))。然而， 对Ii蛋白表达和对内源性抗原通过II类MHC分子呈递的作用还没有被冲企验 过。近年来，Humphreys等人的美国专利第5，726，020号(1998)已纟至i口、别 了三个反义低聚核苷酸和依据引入抗原呈递细胞表达II类MHC分子的逆基 因构建物能够有效的抑制Ii蛋白的表达。接种通过这一机理被Ii抑制的肿瘤 细胞的小鼠比接种未经治疗的母体肿瘤细胞的小鼠相比，表现出更长的存活 时间。这一观察结果表明，Ii蛋白的抑制作用增加了抗原决定簇抗原决定簇 呈递的范围，引起一种对于肿瘤细胞更加有效的免疫反应。在肉瘤细I包(Sail)胖瘤才莫型中，用这种Ii反义4氐聚核華酸处理
的肿瘤细胞是4氐抗母体肺瘤入侵的有效的疫苗。作为临床上有效的体内治疗性反义试剂，可表现的Ii反义逆基因构建物(Ii - RGC)是可以创造的(美 国专利申请第10/ 127,347号)。这是通过将不同的Ii基因片段反方向克隆入 可表现的质粒或腺病毒中来构建的，能够评价多种肿瘤细胞给药方法 (Hillman et al.， Gene Ther. 10, 1512-8 (2003); Hillman et al" Human Gene Therapy 14, 763-775 (2003))。在多个鼠肿瘤纟田胞系，包括A20淋巴瘤细胞， MC-38结肠恶性腺瘤细胞，Renca格腊维次氏瘤细胞，B16恶性黑素瘤细月包， 和RM - 9前列腺癌细胞中稳定或短暂的DNA转染来评价Ii - RGC基因。选 择最具活性的一个Ii-RGC (-92,97)(在AUG中的起始密码子中A在位点 1 )进4亍体内研究。在试-睑的细胞系之中，A20已经是II+ZH+类MHC。当构建物通 过脂质体或基因才&转染方法传递时，Ii-RGC (-92,97)显著地抑制Ii表达。 另一种试验的肿瘤系是11-/1"类MHC。这种细胞系在活体外用Ii-RGC (-92,97)和CIITA或IFN-K之一或两者进行共转染，建造11-阳性/li-抑制类 MHC表现型(Lu et al" Cancer Immunol lmmunother 48， 492-8 (2003); Hillman et al" Gene Ther. 10， 1512-8 (2003); Hillman et al. Human Gene Therapy 14, 763-775 (2003))。在体内，11阳性/li-抑制类MHC表现型的感应现象还可以 通过Ii - RGC和CIITA质粒与脂质体的瘤内注射产生(Lu et al.， Cancer Immunol lmmunother 48， 492-8 (2003); Hillman et al., Human Gene Therapy 14， 763-775 (2003))，或者通过包含li - RGC ( - 92,97)、 CIITA和IFN - K腺病 毒载体的重纟且细月包产生(Hillman et al.， Gene Ther. 10, 1512-8 (2003)).使用二种肿瘤4莫型Renca肾癌和RM-9前列腺癌，在确定的皮 下肿瘤中通过瘤内注射4企-睑这种治疗构建物的体内活性。在这两种肿瘤才莫型 中，得到完全退化的肿瘤。在Renca模型中，瘤内注射CIITA和Ii - RGC质 粒构建物和亚最佳剂量的IL-2质粒4天之后，在大约50%的小鼠中^见察到 肿瘤退4b3E见象(Lu et al., Cancer Immunol lmmunother 48, 492-8 (2003))。在确 定的Renca肿瘤中，重纟且细月包&泉病毒，包4舌CIITA、 IFN -k、 Ii -RGC构建物 和IL -2基因的瘤内注射能够导致大约60 -70 %的小鼠出现完全的肿瘤退化 作用且防止Renca肿瘤复发(Hillman et al.， Gene Ther. 10， 1512-8 (2003))。在 具有4曼蚀性的贫乏地免疫原性RM -9前列腺肿瘤才莫型中，在50%的小鼠中。 放射疗法能够增加次最佳剂量IL -2和MHC 11类-阳性/li -抑制表现型的产生 完全肺瘤退化的效果。(Hillman etal.， Human Gene Therapy 14,763-775,2003). 选择性地;故射治疗确定的RM-9皮下注射肿瘤一天，然后使用质粒pCIITA、 plFN-p、 plL-2和pli-RGC进行连续4天的瘤内质粒基因治疗。只有当在基因治疗之前进4亍肿瘤i文射疗法时，用这四种质粒进4亍的瘤内治疗都能导致超 过50%小鼠产生完全的肿瘤退化作用。通过放射疗法和瘤内基因治疗不再受 肺瘤影响的小鼠在第64天重新复发，这种小鼠能够防止RM -9复发，但不 能防止同源的EL -4复发。这种发现表明，在RM -9模型中，放射疗法能够 4是高瘤内基因治疗对于原位肿瘤特异性免疫应答感应现象的治疗效果。为了获得最佳的治疗效果，II类MHC和Ii必须用CIITAi秀导， 且在Renca和RM - 9月中瘤才莫型中Ii必须4皮Ii - RGC 4中制(Lu et al., Cancer Immunol lmmimother48, 492-8 (2003); Hillman etal.， Human Gene Therapy 14， 763-775, 2003)。该结果与Martin等人的结果一致(J Immunol 162， 6663-70 (1999)) Martin等人的结果显示，在鼠的肺癌模型中，通过CIITA的II类MHC 的感应J见象并不产生有效的肿瘤细"包疫苗。这一研究结果证实了我们的发 现，即通过转染CIITA的II类MHC感应现象，可以产生Ii,并不能达到满 意的治疗效果。必须通过抑制Ii蛋白获得MHCII十/H-类治疗表现型。为了 检验Ii蛋白的最佳抑制效果，使用不同比率的治疗构建物CIITA和Ii - RGC。 为了保证优秀的Ii抑制作用，要求至少1 :4的比率(CIITA : Ii - RGC )。在 RM-9前列腺肿瘤中4吏用IFN-k从而产生不表达为母体细胞的I类MHC分 子。Renca细月包是1类阳性MHC细胞且IFN -k并不是产生I类MHC分子所 必须的，但能够进一步正调节其表达。在两种肿瘤模型中，亚治疗剂量的IL-2质粒是促进免疫反应所必须的。这里给出了对于小鼠确定肿瘤的治疗效果，还给出了在临床前研 究确定最佳治疗方案的稳定进展，并创造了用于治疗人类癌症的试剂。在研 究小鼠时使用的CIITA基因是人类的，而且其产物对鼠用于I1类MHC和Ii 基因的启动基因有很好的作用(Ting etal.， Cell 109， 521-33 (1999)).产生了一 些能够在人B淋巴母细胞和海拉细胞林中抑制Ii表达的人Ii- RGC。带有 CIITA构建物的细胞的转导作用导致细胞表面II类MHC分子和胞内Ii的正 调节作用，而具有CIITA和hli - RGC的细胞的转导作用抑制Ii,且不提高 II类MHC分子的表达。在其他的人月中瘤细月包系，包4舌人B淋巴瘤细月包系Raji 和人恶性黑素瘤细胞系中复制这些数据。在本发明中，可以4吏用新i史计的RNAi遗传构建物和新合成的4氐 聚核普酸进行这种方法。双链RNA可以用于哺乳动物细胞中RNA干涉 (RNAi)的靶分子基因表达的选择性抑制作用。与反义不同，通过双链RNA 并入4亥酸酶复合物，术i吾为RNA-i秀导的;^默复合物(RISC)来调节RNAi,
所述复合物随后裂解乾分子RNA。已经显示，长度小于25个核普酸的双链RNA并不激化病毒传染的RNA响应特性RNA。 RNA序列可以以耙分子基 因RNA的任何区域为基准，通常在编码区。当使用合成的RNAi时，4吏用阳 离子脂质体给药纳摩尔浓度的RNAi，在培养基中治疗细胞。活性RNAi可 能也发展为表达的构建物。在所有的研究中，使用不与靶分子序列兼容的 RNAi作为参照物。在《吏用Western、 FACS和/或表型试-验进4亍RNAi治疗治 疗之后12到72小时测定基因表达的抑制作用。 Ii的RNAi抑制作用的稳固性能适用于由内源合成抗原呈递引起 刺激作用。只须在一'J、部分细胞中抑制Ii一个很短的时间，就可以得到免疫 刺激效果。这一点与其他与癌细胞生长有关的特异性乾分子完全相反，所述 其他与癌细胞生长有关的特异性靶分子需要在几乎所有的细胞中连续的抑 制作用。 RNA干4尤4支术(RNAi)是能够使双链RNA (dsRNA)特异'l"生抑制 带有互补序列的基因表达的过程(Moss， Curr. Biol. 11: R772-5 (2001); Elbashir， Genes Dev. 15: 188-200 (2001 )).这一过禾呈涉及若干基因产物，包括「 DICER， DICER是一种核并唐4亥酸酶，能够向前裂解长链dsRNA成为21到 25个核苦酸长度的乂又链片,史。这些片賴:作为短干护C RNAs或小干扰RNAs (siRNA)在本4页i或内是已知的(Elbashir et al.， 2001)。对果蝇进^f亍的研究已经i正明，DICER能够-使长dsRNA成为由二 个21 nt束组成的siRNAs，其中，这二个21 nt束包括相互津奮确互补的19 nt 区域，产生19nt二倍区，该二倍区与2 nt - 3'凸起側面连接(WO 01/75164; Bernstein et al., Nature 409:363,2001).。然后，SiRNAs诱导形成蛋白质复合 物，该蛋白质复合物能够识别并裂解耙分子mRNAs。 DICER酶的同系物已 经在/人大肠杆菌到人类范围内的多种种族中识别(Sharp, 2001; Zamore, Nat. Struct. Biol. 8:746， 2001),这说明siRNAs具有能够4吏基因表达在许多不同的 细胞型，包括哺乳动物和人类细胞中静止的能力。随后人们发现，可以通过引入合成的21 -核苷酸siRNA二倍体 在哺乳动物细月包中引发RNAi(EIbashir et al., 2001)。在哺乳动物细万包培养基 中，RNAi已经成功地在多种不同的细胞型中进行再造，所述不同的细月包型 中都具有通过例如转染4支术#:引入细胞中的合成siRNAs (Elbashir et al.， 2001)。虽然由于21核普酸siRNAs太短而不能在哺乳动物细胞中i秀导干护乙 素反应(Kumar and Carmichael， 1998)，但是已经足够长来提供輩巴分子基因的 序列特异性抑制作用，在作为研究工具和治疗剂方面，它们拥有巨大的潜力。
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发明内容
本发明直接指向组合物和方法，包括细胞中Ii表达的抑制作用以 便改变4元原呈递途径。本发明一方面涉及有效抑制Ii表达的siRNAs。在一 个实施方案中，本发明的siRNA包4舌一种RNA二4咅体。第一束RNA二倍体 包括Ii的有义序列。第二束RNA 二倍体包括Ii的有义序列的反向互补序列。 在另一方面，siRNA包括在一种单一分子中的Ii有义序列， 一种所迷有义序 列的反向互补序列和一种间插序列，所述间插序列能够使二倍体在有义序列 和反向互补序列之间形成二倍体。在所有的实施方案中，Ii的有义序列优选 长度为IO到25个核苷酸，更优选长度为19到25个核苷酸，或最优选长度 为21到23个核苦酸。在另一方面，本发明提供了一种DNA序列，所述DNA 序列能够编码siRNAs， siRNAs能够有效的抑制Ii表达，抑制包4舌这种DNAs 或siRNAs的细胞并抑制其使用方法。在一个方面，本发明涉及用于抑制细胞中Ii表达的方法。这种方 法包括向表达Ii的细月包中引入一种siRNA,其中siRNA是直接或者间接i也引 入细胞的。其后，siRNA形成一种RNA -诱导的沉默复合物，从而抑制Ii在 细胞中表达。抑制Ii表达的目的是为了改变抗原呈递途径。更具体地说，Ii表 达的抑制作用可以用来促进具有抗原表位的II类MHC分子的装量，其中抗 原表位通常不存在于上下文中。因此，在另一方面，本发明涉及I1类MHC 分子-阴.性细力包向II类MHC分子-阳'l"生细月包的转变。这种4争变通过例:f^用重 组细胞载体转染II类MHC分子-阴性细胞来起作用，其中，所述重组细月包栽 体包括一种编码蛋白的可表现核酸序列，该核酸序列在Il类MHC分子-阴性 细月包中的#"染作用产生转染细力包表面上II类MHC分子的感应J见象。在另一方面，本发明涉及用于显示Il类MHC分子-卩日性细月包重要 表面上抗原表位的方法，其中，所述I1类MHC分子-阳性细胞中Ii蛋白表达 受到抑制。这种方法包括a)提供一种细胞，这种细胞或者是II类MHC分 子-P日性细胞，或者是祐:诱导表达II类MHC分子的细胞，和表达重要抗原表 位的细月包；和b)向步骤a)的细胞中引入siRNA，其中siRNA被直接或间才妻 地引入细胞中，并且，其中siRNA能够形成RNA-i秀导的沉,默复合物，从而 抑制Ii在细胞中表达。在另一实施方案中，这种方法可能包括a)提供一种细 胞，这种细胞或者是II类MHC分子-阳性细胞或者是被诱导在其细胞表面上 表达II类MHC分子的细胞，且进一步地，其中，该细胞表达Ii;和b)向步骤a)的细胞中引入一种重要抗原表位和一种Ii的抑制剂。Ii的抑制剂可能是 siRNA。在另一方面，本发明涉及用于刺激哺乳动物体内免疫反应的方 法，免疫反应直接指向Ii蛋白表达被抑制的II类MHC分子-卩日性细胞的重要 表面上的抗原表位。这种方法包括提供能够表达重要抗原表位的II类MHC 分子-阳性细胞或能够表达所关心的抗原表位和被i秀导在其细胞表面表达II 类MHC分子的Il类MHC分子-阴性的细胞；此后，向所述细胞中引入一种 siRNA，其中这种siRNA直4娄或间4妻地被引入细胞，且siRNA能够形成一种 RNA-诱导的沉默复合物，从而抑制Ii的表达；和用所述细胞或者II类MHC 分子与右f生自所述细月包的抗原表位的复合物来免疫哺乳动物。在另一方面，本发明涉及用于輩巴向动物细胞型，用于免疫反应的 方法，这种细胞型的特点在于识别抗原的表达。在这种方法中，提供了^寻自 个体的外周血单核细胞的培养物，该培养物包括抗原呈递细J包。 一种Ii表达 的siRNA抑制剂被直接或者间接地引入培养物的抗原呈递细胞中，其中，在 适于表达的情况下，siRNA抑制剂是一种可表现的核酸序列，能够编码识别 -抗原进入^f立于培养物中的细月包中。在下面的部分详细描述了本发明的多个涉及的方面。


图1是表示相对荧光强度的示意图。通过用腺苦酸/CIITAI^病 毒载体传染鼠结肠恶性腺瘤细胞(MC38),随后用Ii反义寡聚核苦酸处理， 生产11+ / H -类MHC表现型。A)母体MC38细胞(未治疗)；B)用腺普酸/ CIITA传染的MC38细胞；C)用腺苷酸/ CIITA传染且用官能参照低聚核普 酸处理的MC38细胞；D)用腺普酸/ CIITA传染且用不匹配对照低聚4亥苦酸 处理的MC38细胞；E)用腺苦酸/ CIITA传染且用Ii反义低聚核苦酸处理的 MC38细胞。图2是表示在接种MHC^+/N-类细胞疫苗的小鼠体内MC - 38 结肠恶性腺瘤生长抑制作用的图表。插图i兌明(圆形)用MC-38细月包免疫 的小鼠；(三角形)用MC - 38细胞免疫的小鼠，其中该MC - 38用腺普酸/ CIITA和不匹配参照低聚核苷酸处理过；(菱形)用MC - 38细胞免疫的小鼠， 其中该MC - 38用腺苷酸/ CIITA和官能参照低聚核苷酸处理过；和(正方形)用MC - 38细月包免疫的小鼠，其中该MC - 38用腺苷酸/ CIHA和Ii反 义低聚核苦酸处理过。图3是表示小鼠体内母体肿瘤抑制作用的示意图，所述小鼠是接 种致死性辐射MC-38细胞的小鼠，其中，MC-38细胞用CIITA持续4争染， 能够利用Ii反义抑制Ii表达。用PBS (三角形)、官能低聚核苷酸(圓形) 或Ii反义(正方形)处理MC - 38细J包并将其转染CIITA，用CIITA接种小 鼠(5只小鼠/组)。图4是表示在接种MHC 11十/li-类细胞疫苗和用GM-CSF处理 的小鼠体内，MC-38结肠恶性腺瘤生长抑制作用的示意图。插图说明(三 角形)用母体MC-38细胞免疫的小鼠；(圆形)用MC-38细胞和GM-CSF 免疫的小鼠；(空心正方形)用经CIITA、官能对照j氐聚核芬酸和GM - CSF 处理的MC-38细胞免疫的小鼠；(菱形)用经CIITA、 Ii反义低聚核苷酸和 GM - CSF处理的MC - 38细万包免疫的小鼠。图5是表示MC-38细胞中通过腺苷酸/ IFN - j.引起的II类MHC 分子和Ii感应现象的示意图。用腺苷酸/ IFN ( 3 MOI)感染MC - 38指定 的时间，然后用抗II类MHC分子或Ii抗体染色且通过流式细胞计进行分析。图6是表示相对荧光强度的示意图。通过用腺苷酸/CIITA和腺 苷酸/li-RGC (li-92，97)协同感染细胞，在Renca细胞中产生MHC 11+/Ii -类表现型。用不同的腺苷酸/ CIITA与腺苷酸/ li - RGC的比率协同感染 Renca纟田胞，培养72小时并用II类MHC分子或Ii蛋白表达染色。A表示了 母体Renca细胞；B表示了腺芬酸/ CIITA受感染细胞；C表示了腺苦酸/ CIITA与腺芬酸/ li画RGC以1:2的比率协同感染作用；D表示了腺苦酸/ CIITA与腺苦酸/ li - RGC以1:4的比率协同感染作用。图7是时间过程实-验的表现，在此实验中，通过用腺苦酸/ IFN - / li - RGC (mli - 92,97 )传染细J包，在MC - 38细月包中产生MHC 11+ / li -类 表现型。在腺苦酸/ IFN / li - RGC ( mli - - 92,97 )处理120小时之后产 生Ii -但11+类表现型(左图)，而单独用腺苷酸/ IFN -.y.传染则在MC - 38 细胞中不产生MHC 11+/H-类表现型(右图)。图8表现了瞬时转染Raji细胞(11+/ li+类MHC ), —种人类B-淋巴瘤细胞系中的li -抑制作用。将细胞平涂于12 -孔平皿中以1.25 X 105 细胞/小孔的密度过夜，并用人类Ii-反向基因构建物(hli - RGC)转染，从而
264中制Ii表达。Effectene转染试剂(25.mu.l, QIAGEN)与浓缩的hli - RGC质4立 DNA ( 1 ug —起;軎养，产生和直接添力口到细月包中的介质混合的effectene DNA 复合4勿。在培养48小时之后，通过用4元人类Ii4元体、LN2 ( Pharmingen)和 抗HLA- DR抗体免疫染色的II类MHC分子染色剂(Pharmingen )，对细胞 进4亍Ii和II类MHC分子表达分析。从图中可以看出，根据使用的Ii - RGC 序列，与阳性对照细胞(左側附图)相比，细胞的Ii表达被抑制了 4 %到9 %。图9表现了通过体内给药腺苷酸/1" RGC载体抑制肿瘤生长并 生成11+ / H -类MHC表J见型。对BALB / c小鼠皮下注射5 X 105的Renca 肾腺癌细胞。在注射肺瘤细胞之后大约10天，当肺瘤达到50-200 mm3时， 在4个连续给药日中的一天里对肿瘤注射不同的栽体与DMRI E / c的结合 物。然后，每两或三天测量肿瘤尺寸。当紳瘤尺寸达到1000 mm3时，处死 小鼠。左边的示图中的数据表示了在第一天注射2.mu.g IL-2、 3.mu.g腺香 酸/BN/CIITA和18.11111.§^>苦酸/8>1/11-1100:(-92,97)，随后第2-4天注 射2.mu.g IL - 2、 18扁.g腺苦酸/ BN / li - RGC ( - 92,97)和3吗空质粒(腺 苦酸/BN)(无CIITA)的四只小鼠。很明显，用CIITA和Ii -RGC包含栽体和 IL -2处理的小鼠的肿瘤生长表现出显著的减少，而只才妾收IL -2和对照栽体 治疗的小鼠体内肿瘤发育仍处于前进状态，并能够中止小鼠的生命。
具体实施例方式在一个方面，本发明涉及用于在个体免疫反应中调节或華巴向病 变-特异性的组合物和方法。调节，如这里使用的术语一样，是指涉及增大个 体免疫系统对抗原的灵壽丈度或降低个体免疫系统对抗原的灵敏度(耐受性)。 靶向，如这里使用的术语一样，是指涉及增大对抗原表位的灵敏度。本申请所公开内容的所有方面都涉及的必需要素是细胞中Ii合 成的抑制作用。术语"抑制作用"或"抑制"是指负调节，或起到减少Ii活性的 作用或能够降低Ii RNAs水平使其低于不存在本发明抑制剂或抑制因子的情 况下所观察到的水平。如在本发明背景技术部分介绍的一样，Ii是一种蛋白， 能够被II类MHC分子共同调节。Ii结合II类MHC分子从而阻断通向内源 合成4元原的II类MHC分子的途径(即，抗原合成在II类MHC分子-表达细 胞之内)。将II类MHC分子/li复合物从内质网传递到前Golgi层，在这里， Ii被能够负荷外源性抗原(即，不是在抗原呈递细胞之内合成并被例如噬菌 作用、调理作用、细胞表面抗体识别作用、互补受体识别、和Fc受体识另'J 机理选择进入抗原呈递细胞之内的抗原)的阶段裂解过程释力文。
由于复合Ii蛋白的存在，抗原被从内质网中结合的II类MHC分 子上排出，这种抗原种类可以被认为是内源合成的抗原。这种抗原包4舌胞浆 蛋白，胞浆蛋白被蛋白体消化并作为肽被抗原舦运输体(TAP)传递进入内 质网。这种内源合成的抗原通常在内质网中与I类MHC分子结合。由于Ii 蛋白阻断抗原肽肽-结合^f立点，这种抗原片革殳通常不与II类MHC分子的内质 网结合。通过抑制Ii蛋白的表达，具有巨大功能的肽被传输进入内质网用 于与I类MHC分子结合，并随后呈递给CD8+T淋巴细胞，这种具有巨大功 能的肽可以结合II类MHC分子用于随后呈递并活4t CD4+T免疫调节细月包。 这种CD4+ T免疫调节细胞配合各种各样的免疫反应途径可以具有辅助剂或 者抑制因子功能。T免疫调节细胞通过物理接触和细胞因子释i丈促进其他细 胞的活化作用，其他细胞例如细胞毒性T淋巴细胞(T杀伤细胞)、B淋巴细 胞、和树状细胞。这里使用的术语"重要的抗原表位"涉及一种抗原表位，该抗原表 位存在于衍生自蛋白的肽中，所述蛋白产生在发生抗原呈递作用的细I包内。 这里使用的该术语包括已知的或未知的抗原表位。因此"重要的，，调节剂并不 是指抗原表位是预先确定的。抗原表位是"重要的"抗原表位仅仅由于此抗原 表位被包含在一种蛋白中，所述蛋白在发生呈递作用的细胞的细胞质中^皮合 成。将肽从肽库中传递进入内质网用于结合内质网附近的I类MHC 分子，通过这种肽与II类MHC分子的结合能够得到为干预治疗提供时才几的 重要生物学结i仑。通常，在Ii抑制作用村子的情况下结合II类MHC分子的 抗原表位是"隐蔽的"表位，因为这种抗原表位不另外呈递到通过经典的抗原 呈递途径与II类MHC分子结合的免疫系统中。通过分析试-验抗原氨基酸序 列的重叠的合成肽文库，可以实-睑上揭露这种隐蔽的抗原表位。已经发现， 用试验抗原免疫的一族小鼠对得自文库的一组肽具有应答作用("显性抗原表 位")。然而，当用文库的单一肽免疫另外的同源性小鼠时，发现一种先前未 鉴定的子集(除了免疫肽中任何显性表位之外)也包含免疫抗原表^立。这种 先前未鉴别的抗原表位包括一组隐蔽的抗原表位。尽管本发明的方法能够同时促进针对显性和隐性抗原表位的免 疫性，但是在某些临床情况中，对于隐性抗原表位免疫反应的促进作用对治 疗效果起到一种特殊的作用。例如，就促进对癌症相关抗原表位的治疗反应来i兌，T辅助细另包对隐性抗原表位的反应^艮可能为有效的树状细胞许可作准 备，该树状细胞许可依次产生稳固的细胞毒性T淋巴细胞抗肿瘤反应，但是 抑制T细胞从来不对这种隐性抗原表位发生反应。已经证实，对已经T细胞 与癌症相关抗原显性抗原表位反应的抑制作用的发展，在肿瘤微转移的生长 中起到重要作用。因此，本发明的一种有效的应用是促进T辅助细胞与隐性 癌症相关决定蔟的反应。在另一方面，就自体免疫性疾病来说，对自体免疫性疾病涉及抗 原的显性4元原表位的反应能够<足进这种疾病的发病才几理。开发可作为选择 的，例如抑制对于新型隐性抗原表位的免疫反应途径在治疗上是有效的。这 种方案同才羊可以应用在其《也医学病况例如过敏症、移4直糸夂斥、和传染'f生疾病 和心血管疾病的治疗过孝呈中。在i貪断、治疗监察和治疗患有这种疾病的病人 时，要4吏用到一种化合物，在该化合物形成过程中最基础和最有效的第一步 骤是识别在Ii蛋白被抑制条件下被抗原呈递细胞呈递呈递的II类MHC抗原 表位。这种抗原表位包括显性抗原表位和隐性抗原表位。由于就例如，癌症 或传染病来说，免疫抑制反应不会向隐性抗原表位发展，且就自身免疫疾病 或移植排斥来说，不会产生激化反应，因此隐性抗原表位可能更为有效。因 此，医生可以根据给出的病理状况重新开始Thl或Th2，激活或抑制反应。 产生、分离和表征这种抗原表位的方法是本发明的一个主题。在另一方面，本发明提供了包含抗原表位的个体肽的呈递、分离 和识别过程，其中所述抗原表位在没有Ii蛋白存在的情况下在内质网中与II 类MHC分子结合。这种肽可以^皮合成且单独《吏用或与疫苗应用相结合Y吏用， 从而提高或抑制对由他们引起的疾病相关抗原的免疫反应。分离和表征这种 抗原表^立肽的方法已经:故美国专利第5，827，526号、美国专利第5,874,531号 和美国专利第5,880,103号所描述，这些专利通过引证在此并入本文。许多抗原属于"内源合成"类抗原(通常从I1类MHC分子呈递过 程中分离出)，这些抗原特异性地与某些病理学的病况有关。假定有，例如， 肿瘤细胞或其他恶性细胞。这种细胞合成癌症特异性蛋白质和癌症相关蛋白 质，所述癌症特异性蛋白质和癌症相关蛋白质包含治疗有效的II类MHC抗 原表位。然而，因为这些蛋白质是在抗原呈递细胞内被合成的，这种蛋白质 的抗原表位被从与同样细胞II类MHC分子相关的呈递过程中赶出。通过能 够合成抗原抗原蛋白的细胞对抗原表位呈递作用的抑制，也支持过滤性毒菌 引起感染的细胞。病毒特异性抗原被从与病毒受感染细胞的II类MHC分子 结合的呈递过程中赶出，而这种抗原可以存在于与同样细胞的I类MHC分子的结合过程。从而，其他外源病原体(例如，细菌或寄生虫)占领一种细 月包并利用细月包器合成对病理病况具有特异性的蛋白质，结果是相同的。事物 发展正常趋势的改变能够呈递结合II类MHC分子的病理特异性抗原，对新 型II类MHC抗原表位产生的反应有^f足进作用。 —系列治疗方式都包括在本发明的范围内。可以耳又得专利的组合 物与这些治疗中的许多疗法有关。治疗方法包括体内和体夕卜
实施方案。被把向用于Ii抑制作用的细胞可以是II类MHC分子-阳性 细胞(例如，天然存在的抗原呈递细胞例如树状细月包、巨谨细胞或B-淋巴细 胞)，或^皮i秀导表达II类MHC分子的II类MHC分子-阴性细胞(例如，紳 瘤细胞)。这里使用的"阴性I1类MHC分子"的表达，不仅仅特定地包才舌能够 在它们的细J包表面表达非II类MHC分子的细胞，而且包括另一种细月包，这 种细胞与阳性参照细胞，例如天然存在的抗原呈递细胞(例如，树状细月包) 表面上的II类MHC分子凄t目相比，包含相对低的II类MHC分子数目。在 这里，术语"相对低的"是指与II类MHC分子-阳性对照细胞(例如，天然存 在的抗原呈递细胞)可能包含的II类MHC分子数目相比，这里包括的细胞 在其细胞表面上估计只包含大约25 %、或者更少数目的II类MHC分子。使 用例如本领域中为大家所熟知的萤光免疫控、睑技术，可以产生丰富的II类 MHC分子。在申请人以前已经提交并执行了的专利申请中，公开了用于调节 免疫反应的Ii抑制作用。这些申请明确地公开了有抑制性的共聚物，该聚合 物能够被引入细胞中并直接通过结合Ii mRNA和反向基因构建物抑制Ii合 成，其中，该反向基因构建物作为核酸构建物被引入细胞中，所述核酸构建 物能够随后转录进入RNA分子，并在特异性杂交之后抑制Ii表达。这些早 期申请的专利申请包括美国申请第08 / 661,627号、第09 / 205,995号、第 10 / 054,387号和第10/ 127,347号，这些申请所公开的内容通过引i正在此并 入本文。美国申i會第08/661,627号和第09/205,995号分别作为美国专利第 5,726,020号和第6，368，855发表。如前面简短地提到的美国申请第09 /205,995号，其公幵的内容 中包含大量关于化学合成共聚物的内容，该共聚物包含大约IO到大约50个 斗亥香酸碱基。这种共聚物包含与RNA分子革巴向部分互^卜的核普酸》烕基序列， 或者称为反义序列。这种共聚物的实施例包括反义低聚核普酸和siRNAs.反 义共聚物能够通过两种4中制RNA翻i奪为蛋白质。 一种方法是阻断的RNA出口部分，该出口部分必须与核糖体、剪接体或对RNA成熟或翻译十分重要 的其他因子相互作用才能完成RNA的翻译。第二种方法包括酶、H核糖核 酸酶的增强，这些酶能够裂解与DNA杂交的RNA序列。因此，DNA或DNA 样共聚物与RNA中相应部分的结合能够引起RNA在共聚物结合位点的裂解。例如通过沃森-克里克碱基配对规则，共聚物与靶分子RNA杂交。 共聚物的序列由乾分子RNA的互补序列确定。通常共聚物是用长度覆盖至 少6个萆巴分子RNA互补核苷酸，的核苷酸序列化学合成的，其中最常用长 度为12 - 25个核芬酸的核脊酸序列。统计上讲，大约15个核苦酸的序列在 细胞的所有RNA中具有独特的性质，能够对任何特定的RNA具有高度的特 异耙向性。结合的RNA也是很稳定的，对于包括20个碱基对的共聚物来讲， 其KcH直大约在10~ 17 M周围。有时，在培养基中的细胞能够自然的吸收足够量的共聚物以达到 有效作用。这种吸收量好象是一种主动过程，需要生物化学能量和某些特定 细胞表面蛋白的参与。吸收还可以通过胞饮作用发生。通过在包含共聚物的 高渗介质中培养细胞，随后在稍微低渗的介质中重悬浮细胞从而诱导胞内胞 々欠囊的石皮裂，从而可以提高这种途径。在其它情况下，可以通过电转化4支术 利用脂类、脂质体或聚烷氧基共聚物帮助吸收，或或通过链球菌溶血素O治 疗渗透细胞膜。体内细胞通常比培养细胞更容易吸收共聚物。美国申请第09 / 205,995的实施例2 ^是供了对于细胞通过电转化4支术吸收共聚物的最优条 件。靶分子RNA的潜在位点是那些对功能性蛋白质复合物结合开放 的位点，和其他对于共聚物结合开放的位点。使用核糖核酸酶H(RNaseH)， 即一种能够裂解与DNA杂交的RNA的酶，能够识别这种位点。通过在核糖 核酸酶H参与的情况下向5 ' -i文射性碌-标记的RNA中单独添加或添加在混 合物中的DNA低聚核芬酸，经过RNA凝胶电泳和自动射线照相术之后，可 以识别与低聚核普酸及其他共聚物杂交的RNA上的位点。在本发明Ii RNA 中发现的位点是AUG起始密码子区和前信4吏RNA第 一接合位点区的位点， 这些位点大部分是对核糖核酸酶H裂解位点开ii:的。本发明中的术语"低聚核苷酸"是指多聚核苷酸，该多聚核普酸包 括核苷S臾单位，所述核苷酸单位是由天然存在的碱基和异戊烯吹喃糖通过磷 酸二酯键相连所形成的。术语"共聚物"包^"低聚核苦酸以及由非天然存在的
314氐聚核苷酸或低聚核芬酸〗奮饰亚基形成的在结构上相关的分子。这种{务饰发 生在核苷酸的碱基部分，或者发生在核苷酸的糖部分，或者发生在核苷酸间 连键基团。其他的连接体基团也经常被天然低聚核芬酸的糖和磷酸盐骨架取 代，产生共聚物，具体内容将在后面进行讨论。
i牛是可以利用的。美国专利第4,469,863号(1984)、美国专利第5,216,141 号(1993 )、美国专禾'J第5,264,564号(1993 )、美国专矛J第5,514,786号(1996)、 美国专矛j第5,587,300号(1996)、美国专矛J第5,587,469号(1996 )、美国专 利第5,602,240号(1997)、美国专利第5,610,289号(1997)、美国专利第 5,614,617号(1997)、美国专利第5,623,065号(1997 )、美国专利第5,623,070 号(1997)、美国专利第5,700,922号(1997)、和美国专利第5,726,297号 (1998)、这些专利所公开的内容通过引证在此并入本文。已经公开了很多特异性修饰作用，包括非桥氧原子的置换、桥氧 原子的置换、核苷酸内磷酸基团的置换、糖环周围的立体化学改变、呋喃核 糖基环状结构修饰作用、核普酸连接体修饰作用、和通过肽骨架置换糖磷酸 骨架从而产生一种肽酰核酸(pna)。引用专利申请的实行产生下列权利要求 的授权，该4又利要求是美国专利第6,368,855号的典型的独立的权利要求。 l.—种11类MHC -阳性抗原呈递细胞，该细胞不包含编码哺乳 动物B7分子的外源构建物，且包含Ii蛋白质表达或免疫调节功能的特异性 调节器，低聚核苷酸CTCGGT ACCT ACTGG被明确地排除在外，特异性调 节器基本上由10到50个核苷酸碱基的共聚物组成，该共聚物的特点在于在 生理条件下，能够特定地与编码哺乳动物Ii蛋白质的RNA分子的目标区杂 交，其中特异性调节器的特点在于能够抑制Ii表达。
为了提供相应的背景信息，和为附加的权利要求提供支持，人们 注意到先有技术公开的内容中包括至少二个上述权利要求中特异性限制。例 如，4氐聚核普酸3 ' CTCGGTACCTACTGG 5 '的特异性排除净皮并入到文献 Bertolino etal.， Int. Immunol. 3(5): 435-443 (1991)所公开的内容中。对于编码 哺乳动物B7分子的外源构建物的限制^皮引入Ostrand-Rosenberg (U.S. Pat. No. 5，858,776)所公开的内容中。这里所公开的一种重要的因素，也是之前从未才艮道过的内容，就 是通过利用一种反向基因构建物抑制Ii在人类细胞中的表达。虽然以前已经 才良导过人类Ii序列(Strubin et al.， EMBO J. 3: 869-872 (1984))，但是包含至少 一部分这种序列的反向基因构建物的4吏用在之前从未才艮道过。此外，尽管已
经报道过在例如鼠ii序列和人类n序列之间存在重要的保守序列，但是非人 类的反向基因构建物在用来抑制ii在人类细胞中的翻译时，是无效的。因此，在一个方面，本发明涉及一种可表i见的反向基因构建物， 包括能够编码RNA分子的DNA分子，该RNA分子与能够编码人类Ii蛋白 质的mRNA分子互4卜，RNA分子具有与mRNA分子杂交的能力，从而4中制 mRNA分子在人类细胞中的翻译。本发明的这个方面在随后的实施例部分进 行了具体的说明。更准确地说，已经证实，包含cDNA插入物的构建物的表 达在抑制Ii在人类淋巴瘤细胞系中的表达方面是有效的。在这些试验中有效 的构建物包4舌与Ii mRNA 5 "未翻译区互补的cDNA4悉入物，且包4舌起始密 码子的翻译。有效的构建物能够编码长度最多为大约435个核芬酸的抑制性 RNA。除了使用能够编码与人limRNA区域完全互补的RNA的反义基 因构建物之外，本领域普通4支术人员还可以识别野生型人类序列可以忍受的 脱离程度。本发明的范围包括那些通过常规试-睑就可以凭经验确定的变异体 (即，他们的特征是能够抑制人类细胞中li的表达)。 一种特别有效的野生 型变异体能够产生与人类li mRNA互补的长半衰期的反义RNA (相对于野 生型RNA来讲)，这种变异体被证明能够有效i也抑制人类细胞中的li表达。 在场半衰期的种类里，设计反义RNA的阅读框，避免出现在相同的阅读框 内起始密码子AUG随后立刻/马上接着中止密码子的情况。为了避免出现例 如在阅读框1内AUG在中止密码子前不远位置的情况，可以设计一种新型 的AUG,并引入阅读框1的AUG之前，在阅读框2或阅读框3中，确保在 此4务饰之后，阅读斗匡内不存在中止密石马子。
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除了使用反义基因构建物之外，本领域技术人员可以认识到，其 他的li表达抑制性共聚物可以被很方^f更的设计并构建。例如，双链小干4无 RNA ( siRNA )和编码这些分子的基因可以通过RNA干扰用来抑制li。本发明的一个目的是纟是供一种纟且合物、载体和包含该组合物的细 胞，以及使用他们的方法，其中，该组合物包括能够有效抑制li表达的siRNA。这里^f吏用的术语"RNA干4尤(RNAi)"是指双链RNA ( dsRNA ) 特异性的抑制基因向其互补序列表达的过程(Moss, Curr. Biol. 11(19): R772-5 (2001);, Elbashir, Genes Dev. 15(2): 188-200 (2001)).尽管不希望被任何理i仑所 限制，但是RNAi ^皮i人为是通过包括多重RNA-蛋白相互反应的机制所产生 的，该才几制包4舌一下四个主要的步骤集合带有RNA i秀导的沉默复合物 (RISC)的siRNA, RISC的活化，耙向识别和輩巴向裂解。这里使用的术语 "短干扰RNAs ( siRNA )"是指能够调节RNAi或基因沉默的任何核普酸。 术语siRNA包括多种天然产生的或合成的化合物，所述化合物具有RNAi功 能。这种化合物包括、旦不限于，具有大约21到23个碱基对的双倍合成寡聚 核苷酸，其末端有2-3个重叠的碱基对； 一个寡聚核苷酸的发卡结构，具有 由3-5个碱基对加入的21-23个碱基对的反义、互补和杂交序列；和能够导 致前述结构或功能等价物表达的各种基因构建物。这种基因构建物通常可以 体外制得并引入测试系统中，这种基因构建物还可以包括由宿主细胞或动物 体基因编码的天然存在的siRNA前体产生的siRNA。并不要求本发明的siRNA只包括RNA。本发明的siRNA可以包 4舌一种或 一种以上4t学{务饰和/或4亥酸类4以物。这里所述的l奮饰和/或类l以物 可以分别是不会负面影响siRNA抑制li表达能力的任意的修饰和/或类似物。 在siRNA中一个或一个以上化学^^饰和/或核酸类似物的内含物优选能够预 防或减》爰核酸酶的消化，并依次产生更稳定的siRNA用于实际应用。能够穂-定RNA的化学f务饰和/或核酸类4以物在本领域内是已知的。包括用多克原子K 替非桥键磷酸基氧原子的硫代磷酸衍生物是这种类似物的一个例子，表示了 对核酸酶消化增加的抵抗力。可以作为化学修饰乾点的siRNA的位点包括发 夹结构的环区域、发夹结构(例如帽结构)的5，和3'末端、线性双链siRNA 的3'悬挂区域，线性siRNA的有义链或反义链的5'和3，末端，和有义链或 反义链的 一种或 一种以上的核脊。这里使用的术语siRNA,与本领域内能够调节序列特异性RNAi 的分子是等价的。这种等价物包括，例如，双链RNA (dsRNA)、 4鼓RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干4尤低聚核苷酸和后转录基因沉默 RNA ( ptgsRNA )。尽管不希望局限于任何理i仑，人们通常i人为在RNAi中双链RNA 被处理成包括21-23个碱基对的片断，该片断能够结合互补mRNA并导致该 互补mRNA降解(Bernstein, Nature 409(6818): 363-6 (2001), and International Publication Number WO 0175164)。 siRNA能够导致序列特异性后转录基因沉 默。国际申请第WO 0175164中描述了为了治疗或预防目的将这种分子引入 细^^中来抑制基因表达。在4艮多专利、专利申"^青和"i:仑文中记录了可以为了实 现治疗或预防目的，将这种分子引入细胞中，抑制基因表达。这些文献通过 引i正在此并入本文，所述描述RNAH支术的文献包^^f旦不仅限于美国专利 第6686463号，美国专禾'J第6673611号，美国专矛J第6623962号，美国专矛J第 6506559号，美国专利第No. 6573099号，和美国专利第6531644号；国际申讳-第WO04061081号；第WO04052093号；第WO04048596号；第WO04048594 号；第 WO04048581号；第 WO04048566号；第 WO04046320号；第 WO04044537号^第WO04043楊号^第WO04033620号j第WO04030660号； 第WO04028471号；第WO 0175164号。描述有效利用这些化合物的方法和 扭克念的文章包^"<旦不<又限于Brummelkamp Science 296: 550-553 (2002); Caplen Expert Opin. Biol. Ther. 3:575-86 ('2003); Brummelkamp, Sciencexpress 21Mar03 1-6 (2003); Yu Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-52 (2002); Paul Nature Biotechnology 29:505-8 (2002); Paddison Proc Natl Acad Sci USA 99:1443-8 (2002); Brummelkamp Nature 424: 797-801 (2003); Brummelkamp, Science 296: -550-3 (2003); Sui Proc Natl Acad Sci USA 99: 5515-20 (2002); Paddison, Genes and Development 16:948-58 (2002).在本发明的内容中，包括能够有效抑制li表达的siRNA的组合物 可能包括一种RNA二倍体，该RNA二倍体包括一种li有义序列。在此实施 方案中，RNA二倍体包4舌一种第一《连和一种第二链，该第一链包4舌li的有义 序列，第二链包4舌li有义序列的反义互补序列。在一个实施方案中，li有义 序列由长度为10到25的核苷组成。更优选的，Ii的有义序列由长度为19到 25的核普组成。最〗尤选的，li的有义序列由长度为21到23的核香la成。li 的有义序列优选包括一种li序列，此li序列包含翻译起始位点，更优选的包 4舌人li mRNA的首个400 nt之内的li序列部分。在另 一个实施方案中，包括能够有效抑制li表达的siRNA的组 合物可能在单个分子中包4舌一种li有义序列、li序列的反向互补序列和一种间4悉序列，该间插序列能够在有义序列和反向互补序列之间双4咅形成。li的 有义序列可能的长度为10到25个核苷，或者，更优选的19到25个核苷， 或者最优选的长度为21到23个核苷。本发明的siRNA可能包括一种RNA， 该RNA的序列选自由SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12， SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18所组成的组。本发明的siRNA可能包括一种li有义序列或li有义序列的反向 互补序列，该li有义序列的反向互^卜序列小于完全相互互补或与li目标区域^ 互补的序列，这些对于本领域才支术人员来讲是非常显而易见的。4灸句话i兌， 在有义或反向互补序列中，siRNA可能包括错配或突出部分。在一方面，有 义序列或其反向互补序列可以是完全相邻的。这个或这些序列可能包括一种 或一种以上的取代、缺失、和/或插入。本发明唯一的要求是siRNA有义序 列对其反向互补序列和li的目标区域要具有足够的互补性，从而保i正RNAi 的活性。因此，本发明的一个目的是为能够保持足够的互补性的siRNA提供 序列修饰，保证RNAi活性。本领域技术人员可以预见，本发明修饰的siRNA 组合物将会基于计算出的修饰序列结合li互补序列和目标序列的结合自由能 发挥作用。核酸结合自由能的计算方法及计算所得值在链杂交中发挥的作用 在本领J或内是已知的。各式各样的给药系统可以用于体外和体内向靶细胞供给本发明 的siRNA。本发明的siRNA可以直4妻地或间4妻地引入需要抑制Ii的细胞中。 siRNA可以通过，例如，注射直接地孝皮引入细月包。同样地，本发明的一种目 标是提供一种组合物，该组合物包括可注射的，单位剂量形式的能够有效抑 制Ii的siRNA。举例来说，本发明的siRNA可以静脉注射或皮下注射，为了 达到治疗目的，与本发明的方法和组合物结合4吏用。这种治疗包括周期性给 药或连续给药，直到达到能够在需要的组织中抑制Ii表达的治疗有效水平为 止。间接地，可表现的DNA序列或编码siRNA的序列可以;陂引入细 胞中，之后从DNA序列或序列转录产生siRNA。因此，本发明的 一种目标 是提供一种组合物，该组合物包括一种DNA序列或一种能够编码有效抑制 Ii表达的siRNA的序列。本发明的DNA纟且合物包4舌一种第一 DNA序列和一种第二 DNA 序列，所述第一DNA序列能够编石马包4舌Ii有义序列的第一RNA序列，所述第二 DNA序列能够编码包括Ii反向互补有义序列的第二 RNA序列。第 一和 第二RNA序列在杂交的时候，能够形成一种siRNA二倍体，该siRNA 二倍 体能够形成一种RNA -谦导的沉默复合物，RNA -诱导的沉默复合物能够抑 制Ii表达。第一和第二DNA序列可能是化学合成的或通过PCR使用适当的 对Ii的引物合成的。4故为选择，DNA序列可以使用克隆技术通过细胞重组 获得，其中，克隆技术在本领域内是已知的。 一旦获得，DNA序列可以被纯 化，结合，然后被引入需要抑制Ii的细胞中。做为选择，可以将序列装入单 一载体或分离的载体中，将这种载体或这些载体引入需要抑制Ii的细胞中。给药系统可以用于向輩巴细胞中供给本发明的DNA组合物，所述 輩巴细胞包括，例如，病毒和非病毒系统。适当的病毒系统的实施例包括，例 ^n，腺病毒栽体、腺病毒相关病毒、十曼病毒载体、痘病病毒、逆转录病毒载 体、牛痘、单纯疱渗病毒、艾滋病病毒、小鼠细小病毒、乙型肝炎病毒和流 感病毒。还可以使用非病毒给药系统，例如使用未复合的DNA、 DNA-脂质 体复合物、DNA-蛋白质复合物和DNA-包衣镀金颗粒、细菌载体例如沙门 氏菌，及其他技术例如包括VP22转运蛋白、Co-X-基因和复制子载体的技 术。本发明上下文中的病毒载体或非病毒载体可以表达所关心的抗原。用于表达动物细胞中所关心的核酸序列的一个选择是腺病毒系 统。在随后的实施例部分，具体地7>开了腺病毒系统的使用。腺病毒拥有一 种双链DNA基因组其复制过程与寄主细胞分裂无关。相对于可选择的方法， 腺病毒载体提供了大量有利条件用于将可以表达的构建物引入细胞。例如， 腺病毒载体能够转换许多人类组织，且在分裂的和未分裂的细胞中获得高水 平的基因表达。由于在革巴细胞分离期间免疫系统的清除和稀释性损失，腺病 毒载体的特点在于一种相对短时间的转基因表达。 一些可以使用的给药途径 包括静脉注射、胆管内给药、腹腔内给药、胞膜内给药、颅内和鞘内注射、 和目标器官或组织的直接注射。因此，本领域技术人员可以认识到根据解剖 学知识能够实现目标。腺病毒基因组能够编码大约15个蛋白质，感染病毒包括一种纤 维蛋白质，这种纤维蛋白质能够结合细胞表面受体。这种受体的相互作用产 生内在4匕的病毒。病毒DNA进入受感染细胞的细月包核并且在;殳有细胞分裂 的情况下开始转录。在E1A和E1B基因的控制下进行表达和复制(see Horwitz, M.S., In Virology, 2.sup.nd ed., 1990, pp. 1723—1740)。除去El基因負巨够导致 病毒不能复制。
腺病毒血清型2和5已经广泛4吏用于载体建筑物。Bett等人(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91: 8802-8806 (1994)) 4吏用缺失El和E3腺病毒基因的 腺病毒5型栽体系统。293人类胚胎肾细胞系已经被用于表达E1蛋白质，且 因此可以转互补于El缺乏的病毒基因组。病毒可以从293细月包介质中分离 出来并用卩艮制'ht稀释喧菌斑试-睑(Graham and Prevek， In Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press 1991， pp. 109-128)净化。重组细胞病毒可以生长在293细胞系中，通过赖氨 酸感染的细胞培养和分离，并通过氯化铯密度梯度离心-提纯。与用于生产重 纟且细I包腺病毒的293细胞相关的问题是，由于El基因附加的侧面区，他们 可能在生产病毒颗粒期间产生有复制能力的腺病毒(RCA)。尽管这种材料 只是野生型腺病毒，并不是有复制能力的重組细胞，但是它对理想腺病毒材 料的产生有重要的影响并使生产成本、用于临床使用的生产过程和成批产品 验收的质量控制增大。已经产生可供选择的细胞系，例如PER.C6, PER.C6 比293细l包具有更明确的El基因集合(即不包含側面病毒序列)，这些细月包 系不允许产生RCA的重组细胞发生，且因此有可能抑制上述病毒生产。腺病毒相关病毒(AAV ) (Kotin, R.M., Hum. Gene Ther. 5: 793-801 (1994))是一种单链DNA,非自治的细小病毒能整合进入很多宿主的未分裂 细胞的基因组中。还没有证据证明AAV与人类疾病有关，AAV不引起免疫 反应。 AAV具有二个不同的生命周期阶^a。野生型病毒可以感染寄主细 胞，整合且保持潜伏状态。在有腺病毒参与的情况下，病毒被i秀导为溶解相， 该诱导过程取决于早期腺病毒基因的表达，并引起病毒复制活性。AAV基因 组由二个开放阅读框组成(叫做rep和cap )，这两个开放阅读框侧面与转化 的末端重复(ITR)序列连接。rep区编码能够调节AAV复制、病毒DNA转 录、和在宿主基因组集合物中具有核酸内切酶功能的四个蛋白质。rep基因 是唯一需要病毒复制的AAV序列。cap序列编码能够形成病毒衣壳的结构蛋 白质。ITRs包含病毒复制的启动子，提供用壳体包裹的信号并参与病毒DNA 集合。已经研发出重组细胞、复制缺陷病毒用于基因治疗缺少rep和cap的 序列。复制缺陷型AAV可以通过将AAV复制所必需的单独的因素共同转染 入自由的293细胞系中产生。美国专利第4,797,368号7>开了相关内容，这 些/〉开的内容通过引证在此并入本文。逆转录病毒载体可以用于感染分裂细胞，逆转录病毒由一种RNA 基因组所组成，这种RNA基因组被包覆在来源于寄主细胞膜和病毒蛋白的
38胞质鞘中。逆转录病毒基因表达包括一种反转录步骤，在此反转录步骤中阳 性链RNA基因组^皮用作才莫板直接合成双链DNA，然后将双链DNA整合到 宿主细胞DNA中。整合的原病毒能够使用寄主细胞器进行基因表达。鼠白血病病毒是一种经常^皮j吏用的逆转录病毒(Miller et al., Methods Enzymol. 217: 581-599 (1993)).逆转录病毒载体一般通过gag、 pol 和env基因的缺失进行构建。这些序列的缺失提供了插入重要核酸序列的能 力，并能够除去病毒的复制作用。编码抗菌素耐药性的基因通常作为筛选方 法4皮包4舌在内。还可以包括启动子和增强子功能，例如，为随后体内给药的 组织特异性表达作准备。长末端重复序列中包含的启动子和增强子也可以4皮 使用。携带重要外源核酸序列的病毒和这种病毒的修饰作用只能产生 在包装病毒的细胞系中。包装细胞系可以通过将删除的病毒基因(gag、 pol 和env)稳定插入细胞来构建，从而它们存在于不同的染色体中预防重组作 用。包装细胞系用来通过插入重组细胞前病毒DNA构造能够产生复制缺陷 型反转录病毒的生产细胞系，所述反转录病毒包含所关心的核酸序列。包含 长末端重复序列的质粒DNA侧面与包含用壳体包裹序列的gag基因的小部 分相接，且使用用于DNA传递和吸收的标准技术(电转化技术、4丐沉淀作用， 等等)将所关心的基因转染进入包装细胞系中。这种方法的变体已经被用于降 低有复制能力的病毒生产的可能性(Jolly， D.， Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994)).通过包裹基因(env)确定病毒宿主细胞的范围，可以使用具有不同 特异性的细胞取代env基因。还可以使用适当的配体与包裹蛋白质的结合进 行把向目标。重组逆转录病毒载体的给药可以通过任何适用技术实现。这种技 术包括，例如，病人细胞的非体内转导作用、直接将病毒注射入组织和通过 逆转录病毒生产细胞给药。非体内方法需要分离并在组织培养基中保藏病人 细胞。在这里，可以产生对乾细胞具有高比率的病毒颗粒并由此改进转导作 用效率(参见，例如，美国专利第5,399,346号，其^^开的内容在这里通过 引证并入本文)。美国专利第4，650，764号所公开的内容与逆转录病毒表达系 统的使用有关，所引用的专利公开的内容通过？I证在此并入本文。在有些情况下体内病毒的直接引入是必需的或优选的。反转录病 毒已经用于治疗脑肿瘤，其中反转录病毒只感染分裂细胞(肿瘤细万包)的可 能是尤其有利的。
已经提议直接对患有脑肿瘤的病人给药反转录病毒生产细胞系 (参见，例如，Oldfield etal.， Hum. Gene Ther. 4: 39-69 (1993))。这种生产细 胞可能在脑肿瘤内生存一,爻时期，并分泌能够转换脑肿瘤围绕物的反转录病毒。已经描述了用于表达的以痘病毒为基础的系统(Moss and Flexner， Annu. Rev. Immunol. 5: 305-324 (1987); Moss， B.， In Virology, 1990， pp. 2079-2111).例如，牛痘是一种大的、包裹的DNA病毒，这种DNA病毒能够 在感染细胞的细胞质中进行复制。来自i午多不同组织中的未分裂和分裂细月包 的均被感染，并观察到不完整的基因组的基因表达。可以通过将转基因插入 牛痘书t生的质粒中并^)夺这种DNA 4争染入受牛痘感染细月包中产生重组病毒， 其中，在受牛痘感染的细胞中进行同源重组导致病毒生产。 一种非常不利的 因素是这回引起宿主对150到200个病毒编码的蛋白质的免疫应答反应，产 生有问题的重复给药。单纯疱务病毒是一种大的，双链DNA病毒，能够在感染细月包的 细胞核中复制。这种病毒能够用于与外源核酸序列连接(参见Kennedy and Steiner, Q.J. Med. 86:697-702(1993))。它的优点包4舌宽的宿主细月包范围，分 裂的和未分裂的细胞的感染，且外源DNA的大序列可以通过同源重组作用 被插入病毒基因组中。它的缺点是难以使病毒制剂不含有复制能力的病毒和 有效的免疫反应。病毒胸普激酶基因的缺失致使含有低水平的胸苷激酶的细 月包中病毒复制能力的缺失。进4亍了活性细胞分裂的细胞(例如，肿瘤细月包) 具有足够的胸苷激酶活性，从而能够进行复制。许多其他病毒，包括HIV，小鼠的细小病毒，乙型肝炎病毒，和 流感病毒已经作为基因转移的载体#皮7>开(参见Jolly， D., Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994))。还可以4吏用非病毒DNA传递策略。这种DNA传递策略涉及未 复合的质粒DNA、 DNA-脂类复合物、DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质 复合物、DNA-包衣金颗粒和DNA-包衣的聚交酯乙交酯颗粒。纯化的核酸 可以直接净皮注射入《且织中，在例如月几肉《且织中产生瞬时的基因表达，这一点 在再生月几肉中尤其有效(Wolff et al.， Science 247: 1465-1468 (1990))。 Davis 等人(Hum. Gene Ther. 4: 733-740 (1993))已经7>布了 DNA到成熟肌肉(通常 优选骨駱肌)中的直接注射过程。
使用基因枪可以将位于金颗粒上的质粒DNA"射"入细胞(例如 表皮或恶性黑素瘤)中。DNA共沉淀在金颗并立上，然后^f吏用电火花或压缩》某 气作为4fr进剂点燃(Fynan et al" Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA. 90: 11478-11482 (1993))。电转化技术还可以通过l吏用电转化技术探针将DNA传递进入固态 肿瘤中，这一过程可以4吏用多种针矩阵和脉冲、旋转电场(Nishietal.， Cancer Res. 56: 1050-1055 (1996)).已经要求保护向皮下肿瘤的高效基因转移，这一 技术对重要细胞转染具有促进作用且与内部肿瘤注射步骤相比具有更好的 分布特性。优选使用脂类调节的转染作用用于体外和体内转染(Horton et al., J. Immunology 162: 6378 (1999))。 j吏用商业购得的脂类，例如DMRIE - C i式 剂，通过在注射之前混合DNA和脂类1到5分钟形成脂质体-DNA复合物。通过用疏水性分子包裹亲水性分子使脂质体其作用，从而促进细 胞进入。脂质体是由脂类制成的单层或多层脂质体。脂类组合物和制造工艺 能够影响脂质体的结构。其他分子可以;陂引入脂膜中。脂质体可以是阴离子 型或阳离子型。Nicolau等人(Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA. 80: 1068-1072 (1983))已经7>开了他们在关于月夷岛素>^人注射到鼠体内的阴离子型脂质体中 表达方面所作的工作。除非有另外的靶分子存在，阴离子型脂质体主要輩巴向 肝脏的网状内皮细胞。分子可以被引入脂质体表面从而改变它们的行为，例 如细胞-选择性的传递(Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987))。 Feigner等人(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413-7417 (1987)) 已经公开了他们在关于阳离子型脂质体方面所作的工作，这一/>开表明了核 酸通过静电相互作用的结合并显示出细胞进入。阳离子型脂质体的^脉注射 导致大部分器官中转基因表达 Feigner等人(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 84: 7413-7417 (1987))
已经公开了他们在关于阳离子型脂质体方面所作的工作，这一7>开表明了核 酸通过l争电相互作用的结合并显示出细胞进入。当注射入供给器官的传人血 液中时，阳离子型脂质体的静脉注射导致大部分器官中转基因表达。阳离子 型脂质体可以通过气雾剂对目标肺上皮细月包给药(Brigham et al.， Am. J. Med. Sci. 298: 278-281 (1989)).阳离子型脂质体转基因传递过程的体内试马全已经净皮 />布了 (参见，例如，Nabel et al., Rev. Hum. Gene Ther. 5: 79-92 (1994); Hyde et al., Nature 362: 250-255 (1993)和；Conary et al" J. CHn. Invest. 93: 1834-1840 (1994))。
正在研究能够作为DNA向呑噬细胞传递的系统的《鼓粒，这种方 法已经#皮Pangaea Pharmaceuticals才艮导过。 一种DNA孩乏嚢4匕传递系统已经 被应用并对能够吸收微球吞噬细胞，例如巨噬细胞的转导作用起到了更加有 效的效果。向微球中装入有可能编码免疫原性肽的质粒DNA，该免疫原性肽 在表达的时候能够导致肽通过MHC分子在细胞表面进行显示，所述细胞表 面能够刺激针对包含相同抗原表位的肽和蛋白质序列的免疫反应。目前这种 方法在抗肿瘤和抗病原体疫苗的发展方面起到了很多潜在的作用，但也可能 用于其^也的基因治疗用途。能够均一的自动装配入病毒样颗粒(VLPs)的天然病毒外壳蛋 白还可以用来包装DNA进行传递。人类多形瘤病毒的主要结构外壳蛋白 (VP1)可以用重组蛋白质来表示并能够在自动装配入VLP期间包装质招」 DNA。随后产生的颗粒可以;故用于转换各种各样的细胞系。在DNA载体中已经进^f亍了一些改进，乂人而更可能适用于许多非 病毒给药系统。这包括超螺旋孩(环(既不具有复制的细菌起源也不具有抗菌 素耐药'f生基因，并且由于它们显示一种高水平的生物防范作用，因此可能是 更安全的)，附加表达载体(在细胞核内非染色体外扩增质粒的地方复制附 加体表达系统，并因此避免基因组集合情况发生)和T7系统(一种严才各地 细胞质表达载体，其中载体本身表达噬菌体T7RNA聚合酶，且使用第一启 动子产生的聚合酶从第二T7启动子处驱除治疗基因)的使用。其他对DNA 载体工艺更加普遍的改进包括顺式作用因素的使用，从而起到高水平表达的 效果，还包括来源于a卫星重复DNA的序列的使用，从而提供每个细胞一 次的循环复制过程和核革巴向序列。正々。以上的i寸论，本发明涉及在多种动物细J包类型中或Ii的体内 或非体内的抑制作用。基于Il类MHC分子表达的状况，可以将与这里所讨 论的有关的动物细胞类型划分成很宽的范围。这里将简要介绍这种宽的划分 范围，并再次回顾特异性治疗方法的内容。天然存在的抗原呈递细胞(有时被认为是专门抗原呈递细胞)参 与获得性免疫反应。这些细胞是Il类MHC分子阳性细胞，包括树状细胞、 巨喧细月包、B淋巴细月包和某些其它的单4亥细胞。另外， 一些细月包例如T淋巴 细胞，在静止状态下不显示II类MHC分子，但可以依据适当的活化作用辆 i秀导表达II类MHC分子。可以在体内或体外i秀导这种细胞对4元原肽的II类 MHC分子限制性呈递过禾呈其作用，这种细l包可以;陂归入天然存在的抗原呈递细胞类。可以通过与自身血浆、作为多形核细胞的IFN -yGM -CSF进4亍混 合细月包培养，i秀导细胞表达II类MHC分子(Rasdak, Immunol. 101(4): 521-30 (2000))。可以同时i秀导T细月包表达II类MHC分子并且，在与促细胞分裂剂 和异种APCs —起培养的时候，假定抗原呈递细胞官能性(Patel， J. Immunol. 163(10): 5201-10 (1999)).如下文中所进4于的更为详细的描述， 一种可以编码重要的抗原表 位的能够表达的核酸序列有可能被？I入这种细胞。在这些抗原表位的表达与 Ii抑制作用相结合的时候，重要的抗原表位被显示在与II类MHC分子有关 的^t原呈递细力包的表面上。天然存在的抗原呈递细胞流遍整个身体和全部周围淋巴组织。 周围淋巴组织《立于身体的乂又流体系统，即血液和淋巴周围。这种双流体系纟克 是相互接触的。淋巴由液体形成，所述液体/人血液车命送到组织内部和组织中 的间隙中。由此细胞间隙，淋巴流入薄壁的淋巴管中，在这里净皮'f曼慢地移到 大的中枢性聚集导管中。最终淋巴回到静脉，并在此重新进入血液。在血液 中，'淋巴细胞形成百分之20 - 30的有核细胞；在淋巴中它们形成百分比99 的有核细胞。抗原呈递细胞在这些流体系统之内循环穿过淋巴结和脾的卵泡 中心。在身体的淋巴结和脾的卵泡中心处高浓度的T淋巴细胞和B淋巴细胞 水平，能够促进细胞的相互作用和无性繁殖的扩增。其它的几乎没有II类MHC分子表达的重要细胞包括大多数的 恶性细胞和过滤性毒菌感染的细胞。尤其要注意的是，已经有报道证明，在 某些或所有细胞中，那些通常被认为是11类MHC阴性的肿瘤能表达低水平 的II类MHC分子。这包括，例如，乳癌、肺癌、或结肠癌。这种细胞可以 表达病理特异性抗原，但考虑到II类MHC分子的缺失或相对低的含量，来 自这种抗原的肽通过这种细胞的II类MHC呈递作用还没有达到有效程度， 在这种细胞中，有可能既诱导II类MHC分子表达又抑制Ii表达，(共同调节 Ii表达和II类MHC表达)。这种结合物的干预作用导致与II类MHC分子相 联系的细胞表面上显示这种与病理相关的包含抗原表位的肽。另一类重要的细胞既不是恶性的、过滤性毒菌感染的细胞也不 是天然存在的抗原呈递细胞。这种细胞的实施例包括成纤维细胞、角化细胞 和月几肉细月包。该细l包是Il类MHC分子阴性细月包，且不可归类为天然存在的 抗原呈递细胞。这种细胞与4妄种疫苗方法相结合在体内或非体内条4牛下都是 有效的。考虑体内环境下，靶向肌细胞用于呈递与II类MHC分子相关的抗
43原。II类MHC分子中编码重要的抗原表位和诱导物的可以表达的核酸序列 可以-陂注入到肌肉组织中。这种序列可以通过組织中的肌细月包吸收和表达。 在注射区域之内的一定比率的月几细胞最终在细胞表面表达与II类MHC分子 相联系的重要抗原表位。对通过这种呈递(例如，辅助性T细胞)产生的刺 激作用有感受能够的细胞能够与呈递细胞接触，作为刺激作用-感受态细月包在 淋巴中循环。如上所述，淋巴细胞形成循环淋巴中99%的有核细胞。；故刺-激 的抗原呈递细胞可能与T淋巴细胞和B淋巴细胞在脾的淋巴结处协作，在脾 的淋巴结处，细胞及其他因子的浓度能够促进相互作用并放大克隆选择。通 过分泌B淋巴细胞和它们的成熟后代、血浆细胞产生的抗体离开淋巴中的结 点并净皮传递到血液中。前面的部分通过有局限性的讨论来介绍用于Ii抑制的重要细月包 型。随后的讨论将会更加详细地研究这种介绍的细胞型和相关的方法。已经;正明Ii4中制治疗与肿瘤形成性疾病有关。这包4舌，例々。， 已经确定初期位置的癌症和未知初期位置的转移性癌症。前类癌症包:fe乳腺 癌、头部和颈部的恶性肿瘤、卯巢癌、睾丸癌及其他滋养层疾病、皮肤癌、 和恶性黑素瘤及其他有颜色的皮肤损害。 Ii抑制治疗还被证明可以用于能够过表达PAI- 1并已经被i秀导 表达II类MHC分子的细胞。可以在冠状动脉粥样硬化噬菌斑、颈动脉、肾 动乐&、 "!争月7^和癌症细月包中发iE见这种细月包。PAI-1的过表达与肿瘤4曼入、血管 异生和转移、及心肌梗塞、动脉粥样石更化、再狭窄、和thrombembolic疾病 有关(美国专利第6,224,865号;Gunther， J. Surg. Res. 103(1): 68-78 (2002); Harbeck， J. Clin. Oncol. 20(4): 1000-7 (2002》DeYoung, Circulation 104(16): 1972-1 and (2001); Rerolle， Nephrologie 22(1): 5-13 (2001))。在患有氺唐尿病的 病人动脉壁中，纤溶酶原激活物1型抑制剂(PAI - 1 )有所增加，加速临床 上观察到的患有糖尿病的病人体内动脉粥样硬化和喧菌斑的发展(Pandolfi, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21(8): 1378-82 (2001)).通过《吏用特异性抗 体、肽拮抗剂、反义和诱骗低聚核香酸能够抑制PAI - 1的活性(Rerolle, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 21(8): 1378-82 (2001)). Ii抑制治疗还被证明与传染性疾病有关。这包括病毒性疾病 (DNA和RNA病毒)、细菌性疾病(格兰氏阳性和革兰氏阴性)、分枝杆菌 疾病、螺、4t体疾病、立克次氏体病、支原体加衣原体疾病、真菌感染、原生 动物和蠕虫感染和外寄生物感染。递细胞，包括体内和非体内的应用。在 目前所公开的内容中，术语"靶向"有时用于描述直接对于抗原蛋白质内抗原 蛋白质或特定抗原表位的免疫反应。这种免疫反应部分特征在于T免疫调节 细胞，例如T辅助细胞或抑制性T细胞的活化作用，其中T免疫调节细胞根 据反应环境的变化可以是Thl、或Th2、或Th3细月包。例如，Thl反应是相 对肿瘤抗原CTL反应发展的辅助反应，其中，该肺瘤抗原反应导致肿瘤细胞 的死亡。然而Thl对过敏原的反应在功能上是一种抑制反应，免疫偏离对过 敏原的反应，使其远离导致致病性IgE抗体生产的Th2反应。另夕卜，目标方 案不只包4舌免疫反应的初始部分，而且包4舌那些下游效应因子反应，其中， 免疫反应是通过新型的或增力口量的11类MHC呈递4元原表位的呈递作用刺-激 发生的，下游效应因子反应通过T免疫调节细胞上的初期反应被诱导或^皮调 节。因此，例如，目标包括起始于这里所教导的目标方法的CTL -抗癌反应 或免疫;求蛋白4元病毒反应。目标包括免疫反应直接指向抗原的方案，无论抗原是指定的还 是未知的，也不论抗原是否无经过过度实验f尤无法辨i人。例如，目标可以祐_ 指向能够表达4艮多抗原的细胞，这里的每个抗原都可以促进免疫反应的产 生。细胞内参与免疫反应的特定抗原在人与人之间可能是不同的，取决于个 人的遗传组成。免疫反应对遗传因素的感受性在这里进4亍了很好的描述。因 il:匕，4吏用目标方法进4于有效的治疗或"^断目的时，细3包具体的4元原成分不必 也经常无法确定。目标过程包括体内或体外发生的过程。在体内，例如，免疫调 节型T细胞对通过11类MHC阳性细胞呈递的抗原的活化作用可以发生在非 肿瘤位置或透过肿瘤，其中，11类MHC阳性细胞或者是肿瘤细胞或者是树 状细胞。免疫反应效应因子部分的膨月长同样可以在体内或体外发生。就体外 反应来i兑，可以产生能够重新引入人体或者另一选择个体的产物，从而影响 治疗反应。这种产物的实施例包括树状细胞制剂、细胞毒性T细胞制剂、和 克隆来自体外革巴向培养的B细胞之后产生的抗体，例如B细胞杂交瘤生产之 后产生的抗体。为此，依据引入提供外周血单核细胞的个体所需的有治疗效果 的产物，最初的培养物可以被分馏富集，得到所需细胞，例如，树丰支状细胞 或T淋巴细胞。另外，在这里教导的輩巴向过程起作用之后，培养物可以被分 馏得到所需细胞，例如树枝状细胞或T淋巴细胞。或者在分离之后和本发明 乾向过程之前，或者在靶向过程其作用之后，可以使用已有方法分^g来自个
45体的细胞。而且，已有过程可以将这种产物引入能够提供外周血单核细胞的 个体中。为此，本发明关于把向的方法不限于外周血单核细胞，还包括所有 能够从个体获得的、包4套口咽或其他区域粘膜细胞的细胞产物，支气管或胃 灌洗所得的细胞，乂人任意器官例如肿瘤组织或正常组织，例如肝脏、胰腺、 前列腺、骨骼肌、脂肪、皮肤通过活体切片4企查或切除所得到的细胞。在所有情况下，目标是向天然存在的抗原呈递细胞引入一种重要
的抗原表位，该抗原表位对治疗的病理条件和Ii表达抑制剂具有特异性。肿 瘤或病毒基因转染的树枝状细胞能够引起强烈的抗肺瘤或抗病毒免疫反应。
在这种抗原基因转染的树枝状细胞中，Ii蛋白表达的抑制作用能够提高DNA 接种疫苗的功效。在包括天然存在的抗原呈递细胞的体内和非体内实施方案 的情况下，优选引入一种可表达的核酸序列和一种Ii抑制剂，其中，所述可 表达的抗原序列能够编码重要抗原表位，所述Ii抑制剂可以是一种反向基因 构建物或共聚物，例如反义或siRNA组合物。术语"可表达的核酸序列"包括能够编码有翻"^能力的RNA的 有转录能力的DNA构建物，和在引入之前被转录的有翻译能力的mRNA。 本领域技术人员熟知预告转录和翻译能力所需的分子信号。在本发明所有实施方案中，有可能在单一分子构建物中提供这两 种需要的元素(例如，使用具有足够能力接受能够编码抗原表位和Ii抑制剂 的病毒载体传递系统)。由于例如，当需要II类MHC分子隐性细l包向II类 MHC分子阳性细月包转变时，其他的序列也可以被包括在这种单一分子构建 物中。在这种情况下，还可以包4舌一种可表达的核酸序列，该核酸序列编码i 能够影响转变过程的蛋白。这种蛋白包括，例如，CIITA和这里描述的干扰 素y。作为选择，可以4吏用单独表达的构建物来携带每种元素。在《吏用单独 构建物的情况下，以独立的方式传递，单一抗原呈递细胞吸收每种构建物的 可能性是统计学上的概率问题。而且，相对于有害免疫反应产生的病毒蛋白 质的合成，在单一病毒颗粒中包裏一种以上的构建物，能够最大化Ii抑制作 用治疗有效性感应的效果，并且当具体指明时，具有Ii类MHC感应和/或所 需蛋白抗原合成感应的效果。这种抗病毒免疫反应能够，例如，限制治疗性 干扰作用可能具有的频率。因此，用于在能够抑制Ii蛋白质表达的II类MHC分子阳性细 胞表面上显示一种重要的抗原表位的方法可能包括a)提供一种细力包，这种 细胞或者是II类MHC分子阳性的或者是能够被诱导在它的细胞表面上表达II类MHC分子的细月包，而且其中该细J包表达Ii;和向步骤a)的细胞中引入 一种重要的抗原表位和一种Ii抑制剂。这种Ii的抑制剂可以是任意Ii抑制剂， 且可以是本发明的反向基因构建物或共聚物，例如一种siRNA或反义《且合 物。重要的抗原表位可以在Ii抑制剂的引入之前、之后或同时被引入。在这 种需要II类MHC分子阴性细胞转变为II类MHC分子阳性细胞的方法中， 尽管不严格要求，但是可以当抑制Ii和/或重要的抗原表位时，可以引入编码 影响转变蛋白质的可以表达的核酸序列。也需要考虑通过非病毒性给药系统的引入。使用非病毒性给药 系统，未复合的DNA、 DNA-脂质体复合物、DNA-蛋白质复合物和DNA-包衣的金颗粒可以被送到细胞中。其中每一种方法分别提供了用于特定病理 的控制筛选的优缺点。通过利用复合DNA(例如，DNA-脂质体复合物、DNA -蛋白质复合物、DNA-包衣的金颗粒、和聚交酯乙交酯颗粒中的微囊化作用) 可能能^f呆i正送到单一细"包、两个编码核酸序列的抗原表位和编石马Ii表达4卬制 剂的核酸序列中。即使通过不同的分子种类编码，但由于它们是"被包裹的" (例如，或者装入脂质体胶嚢中，或者包衣在金颗粒上)，两个种类可能能 被传给单一细胞。 DNA包衣的金颗粒通常使用所谓的"基因枪"工艺通过冲击法 供给。使用这种技术，金颗粒可以被射入皮肤或肌肉组织中，并用于穿透细 胞。被穿透的细胞已经显示了能够表达以这种方式被引进的核酸序列。树状 细胞是天然存在的抗原呈递细胞，能够使用这种技术有效地被转染。例如， 在4皮引入单一树枝状细胞的时候，这种表达构建物可以在与II类MHC分子 有关的^L原呈递细J包表面上显示重要的抗原表〗立。抗原表位/11类MHC分子 复合物在抗原呈递细胞表面上的显示将会刺激其他的免疫细^包提供增加免 疫反应。做为选择，在提出的病理病况已经有确定的解剖位置(例如，原 发瘤或某些肿瘤疾病的转移)的时候，可以表示出向确定的解剖学^f立置的直 接注射。这种位置可能被富集在抗原呈递细胞例如树枝状细胞中。肿瘤是这 种引入位置的实施例。用于实现向细胞中引入有关可以表达的核酸构建物的 方法是'除当的。在向确定的肺瘤位置引入这种构建物的时候，优选包括一种 编码刺激II类MHC分子表达蛋白质的附加的可以表达核酸序列。这种第三 成分的加入对于细胞本身是有意的。如果抑制Ii表达的构建物和II类MHC 分子生产的可以表达的谦导物被显示病变的细胞(例如，肿瘤细胞)吸收， 该细胞便会在它的与II类MHC分子有关的细胞表面上显示病理特定的抗原表位。这种细胞可能同时刺激T辅助细胞和B淋巴细胞。因此，这三种可以 表达因素的直接注射与针对定位病理的治疗的结合可被看作一种结合治疗，除了利用可以表达的核酸序列来诱导II类MHC分子生产之外， 本领域技术人员可以识别这种和相关环境中核移植过程的适用性(Wolf, Arch. Med. Res. 32(6): 609-13 (2001); Wakayama， Science 292(5517): 740-3 (2001)).另外， 一种抗原呈递细月包可以来源于那些已经^皮i秀导除去区别,人而 表达月中瘤胚胎抗原的体细胞(Rohrer， J. Immunol. 162(11): 6880-92 (1999))。 这种细月包可以用来i秀导重要的抗原表位上的免疫攻击。在体内完全分化的细 月包可以^皮i秀导除去区别从而达到成熟形式影响器官再生(Abbate, Am.丄 Physiol. 277(3 Pt 2): F454-63 (1999))。为了刺激对异常细月包的免疫-文击，这 些细胞还可以起到抗原呈递细胞的作用(Fu， Lancet 358(9287): 1067-8 (2001))。在本发明另一实施方案中，在体内靶向抗原呈递细胞，通过皮 下注射一种细胞因子(例如，GM - CSF)刺激正常组织。这种皮下"引发"吸 引树枝状细胞到此区域。引发注射之后注射能够编码重要的抗原表位的可以 表达的核酸序列，及Ii合成的抑制剂(例如，siRNA)。新生细胞是病变-特 异性肽的发生器，《旦通常不在与II类MHC分子有关的细胞表面上呈递这种 特异性肽。在这种细胞中，有可能同时i秀导II类MHC分子表达和抑制Ii表 达。例如，II类MHC分子的表达可以通过引入II类MHC分子阴性细月包， 一种编石马刺激II类MHC分子生产的蛋白质的cDNA来i秀导。这种蛋白质包 括，例如CIITA或千扰素y。这种结合干预引起病变特异性、包含抗原表位 的肽显示在与II类MHC分子有关的细月包表面上。如上所述，可以表达的核 酸序列的引入是实i见这些目标的优选的方法。正如以上的讨i仑，在病变表现一种确定的初期位置(例如一种 肿瘤)的地方用直接注射。任选地， 一种编码重要的抗原表位的可以表达的 核酸序列可以被包括在注射材料中，靶向在该地区的重要的抗原表位。对于 病变细"包，传递目标是Ii抑制因子和II类MHC分子诱导物。随后，与肿瘤内注射结合的特异性方案以确定的治疗方案为基 础，例i口包^"编码核酸序列的细月包因子或细月包因子的瘤内注射。这种方案在 许多出片反物中进行了描述，这些出版物包4舌例如Schultz， J.， Cancer Gene Ther. 7(12): 1557-650 (2000); Mastrangelo, M. J.， Cancer Gene Ther. 6(5): 409-22 (1999); Toda, M.， Mol. Ther. 2(4): 324-9 (2000); Fujii， S., Cancer GeneThen 7(9): 1220-30 (2000); Narvaiza, LI J. Immunol. 164(6): 3112-22 (2000); AVright, P.， Cancer Biother. Radiopharm. 14(1): 49-57 (1999); Cancer Res. 58(8): 1677-83 (1998); Staba， M. J., Gene Ther. 5(3): 292-300 (1998);美国专利第 5,833,975号；美国专利第6,265,189 Bl号；Griffith, T.S., J. Natl. Cancer Inst. 93(13): 998-1007 (2001); Siemens, D.R., J. Natl. Cancer Inst. 92(5): 403-12
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发明者徐民桢, 罗伯特·汉弗莱斯 申请人:抗原表达公司