专利名称：：位点特异性丝氨酸重组酶和它们的使用方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域。具体而言，本发明涉及用于在细胞基因组中进行多核苷酸的位点特异性整合、删除、倒位、交换和易位的组合物和方法。本发明也涉及酶、多核苷酸、多肽和载体构建物。
背景技术：
：许多噬菌体和整合型质粒编码位点特异性重组系统，这使得能够将它们的基因组稳定地整合入它们宿主的基因组中，并将它们的基因组从宿主基因组切除。在这些系统中，对于重组反应的最小要求是重组酶和两个重组位点，其中重组酶催化重组事件(Sadowski(1986)J.Bacteriol.165:341-347;Sadowski(1993)FASEBJ.7:760-767)。对于噬菌体整合系统而言，这些是指附着(a/0位点，来自噬菌体DNA的Wrt>元件以及在细菌基因组中存在的加氾元件。这两个附着位点可能共有少至几个碱基对的序列同一性。重组酶蛋白与两个必d立点结合，并催化DNA链的保守性和互换性交换，这导致环状噬菌体或质粒DNA整合入宿主DNA。也可能需要其他噬菌体或宿主因子，诸如DNA结合蛋白IHF、整合宿主因子，以获得有效率的反应(Friedman(1988)Cell55:545-554;Finkel&Johnson(1992)Mol.Microbiol.6:3257-3265)。在噬菌体生长循环的裂解阶段，噬菌体整合酶，与其他宿主和/或噬菌体因子联合起来，也将噬菌体基因组从细菌基因组切割下来。已经开发出若千方法，从而使得能对哺乳动物基因组进行操作，以便阐明特定的感兴趣基因的相关性和功能。在这些方法中，转基因小鼠株和基因靶向技术的开发已经证明是特别有用的(Brandon,E.P.，Idzerda，R.L.andMcKnight,G.S.(1995)历o/,5,625-34;Brandon,E.P.，Idzerda，R.L.andMcKnight,G,S.(1995)Cmat5!o/，5,758-65)。伴随着位点特异性重组酶的表征和应用，这些技术已经取得了新的进步(Kilby,N.J"Snaith,M.R.andMurray,J.A.(1993)7Ve"cfeGe""，9,413-21)。位点特异性重组酶可以分为两个主要家族。第一个家族(Int家族或酪氨酸重组酶家族)包括这些酶，它们催化或者位于相同DNA分子中的位点之间的重组(分子内重组，导致分离、切除或倒位)或位于不同DNA分子中的位点之间的重组(分子间重组，导致整合)(Sauer，B.(1993)Mer/o^￡"z_ywo/,225,890-900;Dymecki,S,M.(1996)/VocA^"^o^Sc,'93,6191-6;Abremski,K.andHoess，R.(1984)J5/o/C/^附，259，1509-14;Nash,H.A.(1996)in^^c/2eWc//flco//"wc/5""/加o"e〃。ce〃w/orflra/mo/ecw/crred.F.C.Neidhart，R.I.Curtis,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik，W.S.Rezaikoff，M.Riley,M.SchaechterandH.E.Umbager(A.S.M.Press,WashingtonD.C.),pp.2363-7)。后一特性已被开发利用，使得能将特异性序列靶向插入到精确的位置(Sauer,B.andHenderson,N.(1990)7TeWewAo/og/"，2，441-9;Fukushige，S.andSauer,B.(1992)Prac.A^f".爿c。dSc/.USA,89，7905-9)。已被用于操作哺乳动物基因组的重组酶主要是Cre蛋白和Flp蛋白，它们属于Int家族(Kilby,N.J.，Snaith,M.R.andMurray,丄A.(1993)7VemfeGe/iW,9,413-21)。这些酶的目标序列，对于Cre酶而言称为loxP位点，对于Flp酶而言称为FRT，由短的反向重复组成，蛋白与反向重复结合。在基因组的长距离(高达70kb)上，重组过程是可操作的。通过使用这些酶，有若干作者已经报道了在鼠模型中的位点特异性和组织特异性DNA重组(DiSanto，J.P.,Muller，W.，Guy,G.D.，Fischer,A.andRajewsky，K.(1995)/VocA^/y4cfldUSA,92，377-81;Gu，H.，Marth,J.D.,Orban,P.C，Mossmann，H.andRajewsky,K.(1994)5W潔e,265,103-6;Kuhn，R.，Schwenk,F.，Aguet，M.andRajewsky,K.(1995)Scie"ce，269,1427-9;Orban，P.C，Chui,D.andMarth,J.D.(1992)/Voc.Ato/.^cadUSA,89，6861-5),植物和动物中的染色体异位(Deursen,J.v.,Fomerod,M.,Rees，B.v.andGrosveld，G.(1995)iVoc.Ato/.爿o^.SW.USA，92,7376-80;Medbeny,S.L.,Dale,E.,Qin,M.andOw,D.W.(1995)M/cZez'cJci^yJm，23，485-卯；Osbome，B,L,Wirtz，U.andBaker，B.(1995)PZa"f7，687-701)，特定基因的耙向诱导(Pichel,J.G.,Lakso,M.andWestphal，H.(1993)O"coge"e，8,3333-42)。Cre-loxP系统已经与诱导型启动子，如干扰素Y诱导型启动子联合应用，用于促进在肝脏中高效率地进行基因敲除，但使得基因敲除在其他组织中处于较小程度(Kuhn，R.,Schwenk,F.，Aguet,M.andRajewsky,K.(1995)Sc!'e"ce，269,1427-9)。然而，位点特异性重组系统在相同的基因组中仅仅使诱导数量减少的重组事件成为可能。鉴于每一重组反应将处于基因组的交换位点处的目标序列交给重组酶处理，并且因为重组酶(例如Cre和Flp)能够催化分子间重组，所以整个过程可能导致不期望的染色体重排。重组酶的第二个家族统称为解离酶/转化酶家族或丝氨酸家族(Grindley，N.D.F.(1994)于iVwc/e/cf<^am/她/ec"/ar_Bz'o/ogy，ed.F.EcksteinandD.M.J.Lilley(Springer-Verlag,Berlin),pp.236-67中；(Smith,M.C.andThorpe,H.M.(2000)Mol.Microbiol.,44,299-307))。这些位点特异性重组酶，其包括催化分子内和分子间反应的酶，比起Int重组酶家族可能具有优势。催化噬菌体整合的丝氨酸重组酶(整合酶)特别适合用作基因工程的工具。到目前为止，在哺乳动物中，已经研究了三种丝氨酸重组酶OC31、R4和TP901-l(Groth，A.C.andCalos，M.P.(2004)丄Mol.Biol.335,667-678)。观察到这些重组酶是自主的，具有简单的a"序列并有能力在哺乳动物细胞中发挥功能。因为除了a"P或W氾之外，观察到在任何位点的组合之间鲜有或没有重组，整合是单向性的，并且具有高的整合频率。比起利用了重组酶Int家族的成员的现有重组系统，丝氨酸重组酶提供了明显的优势。这些酶具有众多的应用。一个途径是将加/位点置于生物体的基因组中，并用作重组的靶标。申请人:己经鉴定了新型丝氨酸重组酶，该酶展示了在各种哺乳动物细胞和在植物细胞中具有强力活性，也展示了将多核苷酸稳定整合入宿主细胞基因组或从宿主细胞基因组切除多核苷酸的能力。发明概述本发明提供在真核细胞中获得稳定的位点特异性重组的方法和组合物。与之前描述的位点特异性重组的方法相反地，本重组酶和它们的使用方法提供稳定的、不可逆的位点特异性重组。本发明组合物提供重组酶多肽，该重组酶多肽介导第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组。在一些实施方式中，核酸还包括重组酶多肽识别的重组位点。本发明涉及提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞，其中该第二重组位点能充当与第一重组位点进行重组的底物。将第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致在重组位点之间产生重组。重组位点之一或两者能在真核细胞的染色体中存在。在一些实施方式中，重组位点的其中之一存在于染色体中，而另一重组位点则包含在欲被整合入该染色体的核酸中。本发明也提供了含有原核重组酶多肽或编码原核重组酶的核酸的真核细胞。在这些实施方式中，重组酶能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，其中第二重组位点充当与第一重组位点发生重组的底物。在优选的实施方式中，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌("Wen'。mo"oc^ogert^)噬菌体、化脓性链球菌(&r印tococow/少ogeww)噬菌体、枯草芽孢杆菌(&c/〃m■ywZ^/fe)噬菌体、结核分枝杆菌(Afyco6a"en'ww/w6e"w/ow^)噬菌体和耻垢分枝杆菌(M少co6o"en'MWSweg/na他)噬菌体。更优选地，重组酶选自Al18重组酶、SF370.1重组酶、SP(k2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。在其他实施方式中，本发明提供获得具有稳定整合的多核苷酸序列的真核细胞的方法。这些方法涉及将核酸引入真核细胞，该真核细胞含有第一重组位点——其中所述核酸包含感兴趣的转基因，和第二重组位点——其充当与第一重组位点重组的底物。第一重组位点和第二重组位点与原核重组酶多肽接触。重组酶多肽催化第一重组位点和第二重组位点之间的重组，导致核酸整合在第一重组位点。噬菌体重组酶在活细胞中特异性地且有效地指导DNA序列之间的重组的能力，使得它们在多种基因工程应用中具有潜在的用处。这样的应用包括多核苷酸序列的整合、切除、倒位、易位和盒式交换。附图简述图1描述了瞬时分子内重组试验(TransientIntramolecularRecombinationAssay(TIRA))的示意图，用于测定在目标或试验噬菌体上重组酶检测aP和加氾位点之间的重组的能力，如实施例所述。图2示出了在人胚胎肾(humanembryonickidney(HEK293》细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图3示出了在小鼠NIH3T3细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图4示出了在中国仓鼠卵(CHO)细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图5示出了在人HeLa细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图6示出了在大鼠骨髓基质细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图7示出了在小鼠神经干细胞中进行的各种重组酶的TIRA结果。图8示出了在烟草BY2细胞中进行的Al18重组酶的TIRA结果。图9描述了将含有加P或加B序列的质粒DNA稳定整合入含加B或aP位点的HEK293染色体的示意图。图10示出了在将含有加P或加B序列的质粒DNA稳定整合入含加B或加P位点的HEK293细胞染色体之后，对加L和a欣位点的PCR扩增结果。图11描述了由重组酶引起的稳定整合的STOP序列的切除和荧光素酶活性的激活的示意图。图12示出了由重组酶引起的稳定整合的STOP序列的切除和荧光素酶活性的激活的结果。图13描述了将含有aP或加氾重组位点的质粒插入或整合入HEK293细胞中存在的天然假a"B或假aWP位点的示意图。图14示出了在HEK293细胞中鉴定到的SF370.1和SPpc2重组酶的天然假a/氾位点的核苷酸序列。优选实施方式的描述定义在本公开中，使用了许多术语和縮写。下面提供了定义，应该有助于理解本发明的范围和实践。在具体的实施方案中，术语"大约"或"近似地"是指在一个给定的值或范围的20%内、优选10%内、更优选5%内和甚至更优选1%范围内。本文所用的"重组酶(Recombinase)"指能够促进确定位点之间的位点特异性重组的一组酶，其中所述位点在单个DNA分子上物理分开，或其中所述位点驻留在分开的DNA分子上。确定的重组位点的DNA序列不必是相同的。重组的起始依靠蛋白质-DNA相互作用，在该组内，有大量的蛋白质，它们催化噬菌体整合和切除(例如X整合酶，OC31)、环状质粒的分离(例如Tn3、yS、Cre、Flp)、替代基因表达的DNA倒位(例如Hin、Gin、Pin)、发育期间基因的装配(例如Anabaena固氮基因)、以及转座(例如S607转座子)。基于进化和机械论相关性，大部分位点特异性重组酶落入这两个家族之一中。它们是X整合酶家族或酪氨酸重组酶(例如Cre、Flp、XerD),和解离酶/整合酶家族或丝氨酸重组酶家族(例如，(DC31、TP901-1、Tn3、丫5)。"重组附着位点(Recombinationattachmentsite)"是被本文所述的重组酶识别的特异性多核苷酸序列。典型地，牵涉到两种不同的位点(称为"互补位点(complementarysites)"),—种存在于目标核酸中(例如，真核生物或原核生物的染色体或附加体)，另一种存在于待被整合在所述目标重组位点上的核酸中。术语"抓B"和"加P"分别指来源于细菌目标和噬菌体供体的附着(或重组)位点，它们被用于本文，尽管特定酶的重组位点可能有不同的名称。重组位点典型地包括被核心区域或间隔区域隔开的左右臂。因此，加氾重组位点由BOB'组成，其中B和B，分别是左臂和右臂，O是核心区域。类似地，加P是POP'，其中P和P'是臂，O还是核心区域。一旦在加氾和W/P位点之间发生重组，以及在目标上伴随着发生核酸整合之后，整合的DNA侧翼的重组位点称为"cmL"和"fl"R"。通过使用上面的术语，cwL和加汲位点因此分别由BOP'和POB'组成。在本文的一些表述中，"O"被省略，例如加氾和加/P分别以BB'和PP'指代。术语"基本上无(substantiallyfree)"是指当组合物中按重量计约75%的蛋白、DNA、载体(取决于A和B所属的物质种类)是"A"时，包含"A"(其中"A"是单一的蛋白、DNA分子、载体、重组宿主细胞等)的该组合物基本上无"B"(其中"B"包括一种或多种污染蛋白、DNA分子、载体等)。优选地，按组合物中A+B物质的重量计算，"A"占至少约90。/。，最优选地按重量计算占至少约99%。而且，优选地，基本上无污染的组合物仅仅包含单一分子量的物质，该物质具有感兴趣的物质活性或特征。对于本发明的目的而言，术语"分离的"是指已从其原始环境(其自然存在的环境)中移出的生物物质(核酸或蛋白质)。例如，以自然状态存在于植物或动物中的多核苷酸不是分离的，然而，与它自然存在时的相邻核酸分离丌的同样的多核苷酸则被认为是"分离的"。术语"纯化的"并不要求该物质以表现出绝对纯、不存在其他化合物的形式存在。它只是一个相对的定义。在将起始材料或天然材料纯化至少一个数量级、优选2个或3个数量级，优选4个或5个数量级之后，多核苷酸便是处于"纯化的"状态。"核酸"是由共价连接的称之为核苷酸的亚基组成的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)和多脱氧核糖核酸(DNA)，两者都可以是单链或双链的。DNA包括但是不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。DNA可以是线性的、环状的或超螺旋的。"核酸分子"是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；"RNA分子")，或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；"DNA分子")的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫酯，其或者为单链形式或者为双链螺旋。可以是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋体。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指该分子的一级和二级结构，并不将之限于任何特定的三级结构形式。因此，该术语包括双链DNA，尤其存在于线性或环状DNA分子(例如限制性片段)、质粒和染色体中。在论述特定的双链DNA分子的结构时，本文中序列可以根据常规惯例进行描述，仅给出沿着DNA的非转录链(即，与mRNA具有序列对应性的链)从5'至3'方向的序列。"重组DNA分子"是指经过分子生物学操作的DNA分子。术语"片段"将被理解为是指长度比参考核酸短的核苷酸序列，并且在共同部分上包含与参考核酸相同的核苷酸序列。如果合适的话，根据本发明的这样的核酸片段可以被包含在更大的多核苷酸中，该片段是该更大的多核苷酸的组成成分。这样的片段包括长度在本发明的核酸的至少6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000或1500个连续核苷酸范围内的寡核苷酸，或可选地由这样的寡核苷酸组成。如本文中使用地，"分离的核酸片段"是指单链或双链的RNA或DNA聚合物，可选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以包括cDNA、基因组DNA或合成的DNA中的一个或多个片段。"基因"是指编码多肽的核苷酸的装配物，包括cDNA和基因组DNA核酸。"基因"也指表达特定蛋白或多肽的核酸片段，包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。"天然基因"是指天然发现的具有它自己的调控序列的基因。"嵌合基因"是指不是天然基因的任何基因，其包含在天然条件下不在一起的调控序列和/或编码序列。因此，嵌合基因可以包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源但以与天然发现的不同的方式排列的调控序列和编码序列。嵌合基因可以包括不同来源的编码序列，和/或不同来源的调控序列。"内源基因"是指在生物体的基因组中的天然位置的天然基因。"外来"基因或"异源"基因是指在正常情况下不在宿主生物体中的基因，而是通过基因转移导入宿主生物体的基因。外來基因可以包括插入到非天然生物中的天然基因或嵌合基因。"转基因"是通过转化程序被导入到基因组中的基因。"异源"DNA是指不是天然位于细胞中或不是天然位于细胞染色体位点中的DNA。优选地，异源DNA包括对该细胞而言为外来的基因。术语"基因组"包括染色体以及线粒体、叶绿体和病毒DNA或RNA。当在合适的温度和溶液离子强度条件下，单链形式的核酸分子能够与其他核酸分子退火，那么该核酸分子便与另一核酸分子如cDNA、基因组DNA或RNA是可杂交的(参见Sambrooketal.，1989下文)。杂交条件和洗涤条件是众所周知的，并在Sambrook,J.，Fritsch,E.F.禾口Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(1989)中示例性说明，特别是在其中的第11章和表ll.l(该文献整体并入本文作为参考)。温度和离子强度条件决定了杂交的"严格性"。可以调整严格性条件以筛选中等程度类似的片段例如来自关系远的生物的同源序列，至高度相似的片段例如来自关系近的生物的同样功能的酶的基因。对于同源核酸的初筛，可以使用低严格性的杂交条件，对应于55'C的Tm,例如5xSSC、0.I%SDS、0.25%牛奶，无甲酰胺；或30%甲酰胺、5xSSC、0.5%SDS)。中度严格性杂交条件对应于较高的Tm，例如40%甲酰胺、以及5x或6xSCC。高度严格性杂交条件对应于最高的Tm，例如50%甲酰胺、5x或6xSCC。杂交要求两条核酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间还是可能会发生错配。术语"互补"被用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺嘌呤与胸腺嘧啶互补，胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括与公开于此或使用于此的全序列以及那些基本上类似的核酸序列互补的分离的核酸片段。在本发明的特定实施方案中，通过使用包括Tm为55'C的杂交步骤的杂交条件并利用上述的条件，检测多核苷酸。在优选的实施方案中，Tm为60'C，在更优选的实施方案中，Tm为63'C，在更为优选的实施方案中，Tm为65'C。杂交后的洗涤也决定严格性条件。一组优选的条件使用一系列的洗涤步骤:以6xSSC、0.5%SDS室温中进行15分钟起始，然后2xSSC、0.5%SDS在45'C进行30分钟，重复洗涤；然后0.2xSSC、0.5。/。SDS在5(rC进行30分钟，重复两次。更优选的一组严格性条件使用更高的温度，其中洗涤步骤与上述步骤相同，除了在0.2xSSC、0.5%SDS中进行最后两次30分钟洗涤的温度增加到60'C。另一组优选的高严格性条件是在65'C，在0.1xSSC，0.1%SDS中进行最后2次洗涤。杂交要求两条核酸含有互补序列，尽管取决于杂交的严格性，碱基之间还是可能会错配。使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补程度，这些是本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越大，具有那些序列的核酸杂交体的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按照下列次序降低RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交体，已经推导出计算Tm的公式(参见Sambrooketal.,上文，9.50-0.51)。对于较短核酸即寡核苷酸的杂交，错配的位置变得更加重要，寡核苷酸的长度决定其特异性(参见Sambrooketal.，上文，11.7-11.8)。在本发明特定的实施方案中，利用包括小于500mM盐和至少37'C的杂交歩骤以及在2xSSPE和至少华氏温度63度的洗涤步骤的杂交条件，来检测多核苷酸。在优选的实施方案中，杂交条件包括小于200mM盐和至少华氏温度37度的杂交歩骤。在更优选的实施方案中，杂交条件包括2xSSPE和华氏温度63度的杂交和洗涤步骤。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度为至少约IO个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少30个核苷酸。而且，技术人员将认识到，温度和洗涤溶液的盐浓度可以根据各种因素例如探针长度作必要的调整。术语"探针"是指单链核酸分子，其可以与互补的单链目标核酸进行碱基配对，形成双链分子。如在此所使用，术语"寡核苷酸"是指通常至少18个核苷酸的核酸，其可以与基因组DNA分子、eDNA分子、质粒DNA或mRNA分子杂交。寡核苷酸可以被标记，例如用3卞-核苷酸或采用已经与标记物如生物素共价偶联的核苷酸进行标记。标记的寡核苷酸可以用作探针来检测核酸的存在。寡核苷酸(其中之一或两者可以被标记)可以用作PCR引物，用于克隆全长核酸或核酸片段，或者用于检测核酸的存在。寡核苷酸也可以用于与DNA分子形成三螺旋。一般而言，寡核苷酸通过合成制得，优选在核酸合成仪上合成。因此，寡核苷酸可以用非天然存在的磷酸酯类似键例如硫酯键等制备。"引物"是指在合适的条件下与目标核酸序列杂交、从而产生可以充当DNA合成起点的双链核酸区域的寡核苷酸。这样的引物可以用于聚合酶链式反应。"聚合酶链式反应"縮写为PCR，是指酶促扩增特定核酸序列的体外方法。PCR涉及一系列反复的温度循环，每一循环包括三个阶段对模板核酸变性以分开目标分子的链，将单链PCR寡核苷酸引物与模板核酸退火，用DNA聚合酶延伸退火的引物。PCR提供了检测目标分子存在与否的手段，并且在定量或半定量条件下，可以确定目标分子在原始核酸库中的相对数量。"逆转录-聚合酶链式反应"的缩写是RT-PCR，是指由RNA分子或多个RNA分子酶法产生目标cDNA分子或多个分子、然后如上所述酶法扩增目标cDNA分子或多个分子内的特定核酸序列或多个序列的体外方法。RT-PCR也提供了检测目标分子存在与否的手段，并且在定量或半定量条件下，可以确定目标分子在起始核酸库中的相对数量。"丌放阅读框"缩写为ORF，是指一定长度的核酸序列，其是DNA、cDNA或者RNA，包括翻译起始信号或起始密码子，例如ATG或AUG，和终止密码子，并且潜在地能够翻译成多肽序列。术语"头对头"在此被用于描述两条多核苷酸序列彼此之间的定向。当一条多核苷酸的编码链的5'端与另一条多核苷酸的编码链的5'端相邻时，这两条多核苷酸以头对头的方向定位，因此，各条多核苷酸的转录方向以远离另一条多核苷酸的5'端的方式进行。术语"头对头"可以縮写为(5')-对-(5')，也可以用符号0~~0或(3'—5'5'—3')表示。术语"尾对尾"在此被用于描述两条多核苷酸序列彼此之间的定向。当一条多核苷酸的编码链的3'端与另一条多核苷酸的编码链的3'端相邻时，这两条多核苷酸以尾对尾的方向定位，因此，各条多核苷酸的转录方向朝着另一条多核苷酸的方向进行。术语"尾对尾"可以縮写为(3')-对-(3')，也可以用符号(——)或(5'—3'3'—5')表示。术语"头对尾"在此被用于描述两条多核苷酸序列彼此之间的相对定向。当一条多核苷酸的编码链的5'端与另一条多核苷酸的编码链的3'端相邻时，这两条多核苷酸以头对尾的方向定位，因此，各条多核苷酸的转录方向以与另一条多核苷酸相同的方向进行。术语"头对尾"可以缩写为(5')-对-(3'),也可以用符号(——)或(5'—3'5'—3')表示。术语"下游"是指位于参考核苷酸序列3'端的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列通常涉及转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。术语"上游"是指位于参考核苷酸序列5'端的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸通常涉及位于编码序列或转录起始点的5'侧的序列。例如，大部分的启动子位于转录起始位点的上游。术语"限制性核酸内切酶"和"限制性酶"是指结合并切割双链DNA内的特定核苷酸序列的酶。"同源重组"是指将外来DNA序列插入另一DNA分子，例如将载体插入染色体。优选地，载体耙向于特定的染色体位点进行同源重组。对于特异性的同源重组，载体将含有与染色体的序列同源的足够长的区域，以允许载体进行互补性结合并整合入染色体。较长的同源区域和较高的序列相似性程度，可以提高同源重组的效率。本领域己知的若干方法可以用于增殖本发明的多核苷酸。一旦建立合适的宿主系统和生长条件，可以定量增殖和制备重组表达载体。如在此所描述，可以使用的表达载体包括但是不限于下述载体或它们的衍生物人或动物病毒例如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒例如杆状病毒；酵母载体噬菌体载体(例如X噬菌体载体)以及质粒和粘粒DNA载体，以这些为例。"载体"是指用于克隆核酸和/或将核酸转移入宿主细胞的任何工具。载体可以是另一DNA片段可以连接到其上从而使得该被连接的片段可被复制的复制子。"复制子"是指作为在体内的自主DNA复制单元而发挥功能，即能够在它自己的控制下进行复制的任何遗传元件(例如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语"载体"包括用于体外、离体或体内将核酸导入细胞的病毒和非病毒工具。本领域已知的大量载体可以被用于操作核酸、将应答元件和启动子整合入基因等。可能的载体包括例如质粒或修饰的病毒，包括例如细菌噬菌体，如X衍生物，或质粒如pBR322或pUC质粒衍生物，或Bluescript载体。例如，通过将合适的DNA片段连接入具有互补粘性末端的选择载体，可以将对应于应答元件和启动子的DNA片段插入合适的载体中。可选择地，DNA分子的末端可以通过酶法修饰，或者可以通过将核苷酸序列(接头)连接到该DNA末端产生任何位点。这样的载体可以进行工程改造，以含有选择性标记基因，用于选择已经将该标记整合入细胞基因组的细胞。这样的标记允许鉴定和/或选择整合并表达由该标记编码的蛋白的宿主细胞。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经在细胞以及活的动物对象中用于各种各样的基因传递应用中。可以使用的病毒载体包括但不限于逆转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、牛痘病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、腺病毒、双生病毒和花椰菜花叶病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电荷脂质(细胞转染剂(cytofectins))、DNA-蛋白质复合体和生物聚合物。除了核酸外，载体还可以包括一个或多个调控区域，和/或选择性标记，这些标记可用于选择、测定和监控核酸转移结果(转移到哪些组织，表达的持续时间等)。术语"质粒"是指染色体外元件，它们常常携带不是作为细胞的中心代谢的一部分的基因，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这样的元件可以是来自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性、环状或超螺旋的，单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被连接入或重组入独特的结构中，该结构能够将针对所选的基因产物的启动子片段和DNA序列以及合适的3'端非翻译序列导入细胞。"克隆载体"是"复制子"，为核酸的单元长度，优选是DNA，它按顺序复制，并包含复制起点，例如质粒、噬菌体或粘粒，其上可以连接另一核酸片段从而复制该被连接的片段。克隆载体可以具有在一种细胞类型中复制并在另一细胞类型中表达的能力("穿梭载体")。载体可以通过本领域已知的方法导入期望的宿主细胞，例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白(参见例如Wuetal.,1992，J.Biol.Chem.267:963-967;Wu和Wu，1988,J.Biol.Chem.263:14621-14624;和Hartmutetal"1990年3月15日提交的加拿大专利申请2,012,311)。本发明的多核苷酸也可以通过脂转染体内导入。在过去10年中，使用脂质体体外包囊和转染核酸一直在增加。设计用来限制脂质体介导的转染所遇到的困难和危险的合成阳离子脂质，可以用于制备脂质体，用于体内转染编码标记的基因(Felgneretal.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413;Mackey，etal.，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:8027-8031;和Ulmeretal.，1993,Science259:1745-1748)。使用阳离子脂质可以促进带负电荷的核酸的包囊，还可以促进与带负电的细胞膜的融合(FelgnerandRingold，1989，Science337:387-388)。国际专利出版物W095/18863和W096/17823以及在美国专利5,459,127中描述了可用于转移核酸的特别有用的脂质化合物和组合物。利用脂转染将外源基因体内导入特定的器官具有某些实践优点。脂质体对特定细胞的分子靶向代表了一个方面的益处。明显的是，针对特定的细胞类型进行转染在具有细胞异质性的组织例如胰腺、肝脏、肾脏和脑中将是特别优选的。脂质可以用化学的方法偶联到其他分子以用于靶向的目的(Mackey,eta1.，1988,上文)。被靶向的肽例如激素或神经递质，以及蛋白质例如抗体，或非肽分子可以通过化学方法偶联到脂质体。其他分子也可用于帮助进行核酸的体内转染，例如阳离子寡肽(例如W095/21931)、衍生自DNA结合蛋白的肽(例如WO96/25508)或阳离子聚合物(例如W095/21931)。将载体作为裸DNA质粒体进行内导入也是可能的(参见美国专利5,693,622、5,589,466和5,580,859)。也可以使用受体介导的DNA传递方法(Curieletal.,1992,Hum.GeneTher.3:147-154;禾卩Wu和Wu,1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432)。术语"转染"是指细胞摄取外源或异源RNA或DNA。当外源或异源RNA或DNA已被引入细胞内时，该细胞便被这样的RNA或DNA"转染"。当转染的RNA或DNA影响表型变化时，该细胞便被外源或异源RNA或DNA"转化"。转化RNA或DNA可以被整合入(共价连接入)构成细胞基因组的染色体DNA。"转化"是指将核酸片段转移入宿主生物的基因组，产生遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物称为"转基因"或"重组"或"转化的"生物。术语"遗传区域"将指包含编码多肽的基因的核酸分子区域或核苷酸序列。此外，包含本发明的多核苷酸的重组载体可以包括一个或多个用于在细胞宿主中复制的起点(在该细胞宿主中谋求多核苷酸的扩增或表达)、标记或选择性标记。术语"选择性标记"是指鉴定性因子，通常是抗生素或化学品抗性基因、比色标记、酶、荧光标记和类似物，其中抗性基因能够基于标记基因的效应，即对抗生素的抗性、对除草剂的抗性进行选择，其中，所述效应被用于追踪感兴趣的核酸的遗传性，和/或鉴定遗传有感兴趣的核酸的细胞或生物。本
技术领域：
已知并被使用的选择性标记基因的例子包括提供对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺胺和类似物的抗性的基因；用作表型标记的基因，即花色素苷调控基因、异戊烯转移酶基因和类似物。术语"报道基因"是指编码能够基于该报道基因的效应而被鉴定的鉴定性因子的核酸，其中所述效应被用于追踪感兴趣的核酸的遗传性，鉴定遗传有感兴趣的核酸的细胞或生物，和/或测定基因表达诱导或转录。本
技术领域：
已知并被使用的报道基因的例子包括荧光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、P-半乳糖苷酶(LacZ)、P-葡糖醛酸酶(Gus)和类似物。选择性标记基因也可以考虑用作报道基因。"启动子"是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可以整体源自天然基因，或由源自天然发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员应该理解的是，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段，或应答于不同的环境或生理条件进行表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数的时间被表达的启动子通常称为"组成型启动子"。导致基因在特定的细胞类型中被表达的启动子通常称为"细胞特异性启动子"或"组织特异性启动子"。导致基因在特定的发育或细胞分化阶段被表达的启动子通常称为"发育特异性启动子"或"细胞分化特异性启动子"。在将细胞暴露于诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光或类似物，或用这些物质对细胞进行处理之后，被诱导并导致基因被表达的启动子通常被称为"诱导型启动子"或"调控型启动子"。还应该认识的是，因为在大多数情况下，调控序列的准确界限还没有完全限定，所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。"启动子序列"是能够结合细胞中RNA聚合酶，并启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调控区域。为了定义本发明的目的，启动子序列的范围被界定为其3'端至转录起始位点，并向上游(5'方向)延伸，包括以高于背景的可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内，将发现转录起始位点(该位点例如可以通过用核酸酶Sl作图方便地确定)和负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合结构域(共有序列)。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后mRNA进行反式RNA剪接(如果该编码序列含有内含子的话)，并翻译成由该编码序列编码的蛋白时，该编码序列便在细胞中处于转录和翻译控制序列的"控制之下"。"转录和翻译控制序列"是DNA调控序列，例如启动子、增强子、终止子、和类似物，其使得编码序列能够在宿主细胞中表达。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是控制序列。术语"应答元件"是指一个或多个顺式作用DNA元件，其赋予启动子通过与第一嵌合基因的DNA结合结构域的相互作用介导的应答性。该DNA元件可以在其序列中具有回文结构(精确的或不精确的)，或由被可变数目的核苷酸隔开的序列基序或半位点组成。半位点可以是相似的或相同的，并以同向重复或反向重复排列，或以单个半位点或相邻半位点串联形成的多聚体排列。取决于应答元件将要被整合入的细胞或生物的属性，该应答元件可以包含分离自不同生物的最小的启动子。在配体存在或不存在的情况下，第一杂合蛋白的DNA结合结构域结合应答元件的DNA序列，从而在该应答元件的调控下启动或抑制下游基因的转录。天然蜕皮激素受体的应答元件的DNA序列的例子包括RRGG/TTCANTGAC/ACYY(参见CherbasL.，et.al.,(1991),Ge"esDev.5，120-131);AGGTCAN(n)AGGTCA，其中N。)可以是一个或多个间隔核苷酸(参见D'AvinoPP.，et.al.，(1995)，M/.Ce//.^mafocW"o/,113,1-9);和GGGTTGAATGAATTT(参见AntoniewskiC.，et.al.,(1994).Mol.CellBiol.14，4465-4474)。术语"可操作性连接"是指核酸序列连接在单个核酸片段上，从而一条核酸序列的功能受到其他核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制之下)，则启动子可操作性地与编码序列连接。编码序列可以以有义或反义方向与调控序列可操作性地连接。如本文中所用，术语"表达"是指来自核酸或多核苷酸的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可以指mRNA翻译成蛋白或多肽。术语"盒"、"表达盒"和"基因表达盒"是指可以在特定的限制性位点或通过同源重组插入核酸或多核苷酸的DNA片段。DNA片段包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸，该盒和限制性位点经过设计以确保能够将该盒插入正确的转录和翻译阅读框。"转化盒"是指包含编码感兴趣的多肽的多核苷酸并且除了所述多核苷酸外还具有帮助转化特定宿主细胞的元件的特定载体。本发明的盒、表达盒、基因表达盒和转化盒也可以包含增强编码感兴趣的多肽的多核苷酸在宿主细胞中的表达的元件。这些元件可以包括但不限于启动子、最小启动子、增强子、应答元件、终止子序列、多腺苷酸化序列和类似元件。术语"调节"是指诱导、减少或抑制核酸或基因表达，分别导致蛋白或多肽生产的诱导、减少或抑制。本发明的质粒或载体还可以包含适于驱使基因在宿主细胞中表达的至少一个启动子。术i吾"表达载体"是指被设计成使得插入的核酸序列在转化入宿主后能够表达的载体、质粒或媒介。克隆的基因，即，插入的核酸序列，通常被置于控制元件例如启动子、最小启动子、增强子或类似控制元件的控制之下。启动控制区域或启动子可用于驱使核酸在期望的宿主细胞中表达，它们数量众多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，能够驱动这些基因的任何启动子都适合于本发明，包括但不限于病毒启动子、细菌启动子、动物启动子、哺乳动物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、光调控启动子Crc7、04￡4、G力ZJ0、^Z)7/八尸GA:、尸//05、04尸D/Z、」DC/、77尸/、t//L43、￡￡t/2、￡W6>、7TV、碱性磷酸酶启动子(用于在酵母属(Sflcctorow少c")中的表达)启动子(用于在毕赤酵母(尸/c/7/fl)中的表达)p-内酰胺酶、/flc、。ra、/e/、冲、化、//V77、toc和加启动子(用于在大肠杆菌(￡^&17'^&^//)中的表达)；光调控的、种子特异性的、花粉特异性的、子房特异性的、发病机理或疾病相关的、花椰菜花叶病毒35S、CMV35S最小、木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)、叶绿素a/b结合蛋白、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶、芽枝特异性的、根特异性的、几丁质酶、应激诱导型的、水稻东格鲁杆状病毒、植物超级启动子(plantsuper-promoter)、马铃薯亮氨酸氨肽酶、硝酸盐还原酶、甘露氨酸合成酶、胭脂氨酸合成酶、泛蛋白、玉米醇溶蛋白和花色苷启动子(用于在植物细胞中的表达)；本领域已知的动物和哺乳动物启动子包括但不限于SV40早期(SV40e)启动子区域、包含在劳斯肉瘤病毒(RSV)的3'长末端重复(LTR)中的启动子、腺病毒(Ad)的E1A或主要晚期启动子(MLP)基因的启动子、巨细胞病毒(CMV)早期启动子、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)启动子、杆状病毒IE1启动子、延伸因子la(EFl)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛蛋白(Ubc)启动子、白蛋白启动子、小鼠金属硫蛋白的调控序列L启动子和转录控制区、遍在启动子(HPRT、波形蛋白、a-肌动蛋白、微管蛋白和类似物)、中间纤维的启动子(结蛋白、神经纤丝蛋白、角蛋白、GFAP和类似物)、治疗性基因的启动子(MDR、CFTR或VIII类因子和类似物的启动子)、发病或疾病相关启动子，以及显示出组织特异性并已用于转基因动物的启动子，例如在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰腺P细胞中具有活性的胰岛素基因控制区；在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区域；在肝脏中具有活性的白蛋白基因、ApoAI和ApoAII控制区；在肝脏中具有活性的a-甲胎蛋白基因控制区；在肝脏中具有活性的a1-抗胰蛋白酶基因控制区；在骨髓细胞中具有活性的P-球蛋白基因控制区；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓磷脂碱蛋白基因控制区；在骨骼肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，以及在下丘脑中具有活性的促性腺激素释放激素基因控制区，丙酮酸激酶启动子，绒毛蛋白启动子，脂肪酸结合肠蛋白的启动子，平滑肌细胞Ct-肌动蛋白的启动子和类似物。此外，通过加入增强子或调控序列和类似物，这些表达序列可以被修饰。可以用于本发明的实施方案的增强子包括但不限于SV40增强子、巨细胞病毒(CMV)增强子、延伸因子l(EFl)增强子、酵母增强子、病毒基因增强子和类似物。终止控制区，即，终止子或多腺苷酸化序列，也可以来自对于优选的宿主而言为天然的各种基因。可选地，终止位点并非必需，然而，最优选的情况是包括终止位点。在本发明优选的实施方案中，终止控制区域可以包括或来自合成序列、合成的多腺苷酸化信号、SV40晚期多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、牛生长激素(BGH)多腺苷酸化信号、病毒终止子序列或类似物。术语"3'非编码序列"或"3'非翻译区(UTR)"是指位于编码序列下游(3')的DNA序歹ij,并且可以包含多腺苷酸化[多(A)]识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号通常是通过以将多腺苷酸序列段加入到mRNA前体的3'末端为特征。"调控区域"是指调控第二核酸序列的表达的核酸序歹ij。调控区域可以包括在自然情况下负责表达特定核酸的序列(同源区域)，或可以包括负责表达不同的蛋白或甚至合成蛋白的不同来源的序列(异源区域)。特别地，序列可以是以特异性或非特异性方式和以诱导型或非诱导型方式刺激或抑制基因转录的原核、真核或病毒基因序列或衍生的序列。调控区域包括复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列和指导多肽进入目标细胞的分泌途径的信号序列。"异源来源"的调控区域是与被表达的核酸并不天然连接的调控区域。异源调控区域包括来自不同种的调控区域、来自不同基因的调节区域、杂合调控序列和在天然情况下并不存在而是由本领域普通技术人员设计出的调控区域。"RNA转录物"是指经RNA聚合酶催化由DNA序列转录而得的产物。当RNA转录物是DNA序列的精确互补的拷贝时，它被称为初级转录物，或者它可以是对初级转录物进行转录后加工所产生的RNA序列，这被称为成熟RNA。"信使RNA(mRNA)"是指无内含子、并可以被细胞翻译成蛋白的RNA。"cDNA"是指与mRNA互补并源自mRNA的双链DNA。"有义"RNA是指包括mRNA并因此可以被细胞翻译成蛋白的RNA转录物。"反义RNA"是指与目标初级转录物或mRNA的全部或部分互补并且阻断目标基因表达的RNA转录物。反义RNA的互补性可以在特定的基因转录物的任何部分，即，在5'非编码序列、3'非编码序列或编码序列。"功能RNA"是指反义RNA、核酶RNA或不被翻译但对细胞过程有影响的其他RNA。"多肽"是由共价连接的氨基酸残基组成的聚合化合物。氨基酸具有下述通用结构H根据侧链R，氨基酸被分为七组(l)脂肪族侧链，(2)含有羟基(OR)基团的侧链，(3)含有硫原子的侧链，(4)含有酸性基团或酰胺基团的侧链，(5)含有碱性基团的侧链，(6)含有芳香环的侧链，和(7)脯氨酸，一种侧链与氨基基团稠合的亚氨酸。本发明的多肽优选包含至少大约14个氨基酸。"蛋白质"是在活细胞中发挥结构或功能作用的多肽。"分离的多肽"或"分离的蛋白"是基本上没有那些在其天然状态下通常与其相随的化合物(例如，其他蛋白或多肽、核酸、碳水化合物、脂类)的多肽或蛋白。"分离的"并不旨在排除与其他化合物形成的人工或合成的混合物，或并不排除存在有不干扰生物活性以及例如因不彻底的纯化、加入稳定剂或混合形成药学上可接受的制剂而可能存在的杂质。多肽或蛋白的"变体"是源自多肽或蛋白并保留该多肽或蛋白的至少一种生物学特性的任何类似物、片段、衍生物或突变体。多肽或蛋白的不同变体可以存在于自然界中。这些变体可以是由编码蛋白的结构基因的核苷酸序列中的差异表征的等位基因突变体，或可以涉及差异性剪接或翻译后修饰。技术人员可以制备具有单个或多个氨基酸置换、删除、添加或替代的变体。这些变体可以包括(a)其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸置换的变体；(b)其中一个或多个氨基酸被加入到多肽或蛋白的变体；(c)其中一个或多个氨基酸包括取代基团的变体；和(d)其中多肽或蛋白与另一多肽例如血清白蛋白融合的变体；等等。获得这些变体的技术是本领域普通技术人员所知晓的，包括遗传技术(抑制、剔除、突变等)、化学技术和酶技术。"异源蛋白"是指并非细胞天然产生的蛋白。"成熟蛋白"是指翻译后加工得到的多肽，艮P，初级翻译产物中存在的任何前肽或肽原己从其中被去除的一种多肽。"前体"蛋白是指mRNA的初级翻译产物;即，前肽和肽原依然存在。前肽和肽原可以是但不限于胞内定位信号。术语"信号肽"是指分泌的成熟蛋白前面的氨基端多肽。信号肽与成熟蛋白割裂开，因此成熟蛋白中没有信号肽。信号肽具有将分泌的蛋白引导并转运通过细胞膜的功能。信号肽也称作信号蛋白。"信号序列"被包括在将被表达在细胞表面的蛋白的编码序列的开始位置。该序列编码成熟多肽的N-端的信号肽，信号肽指导宿主细胞转运多肽。术语"转运信号序列"在此用来指代这类信号序列。可以发现转运信号序列与真核和原核细胞中天然的各种蛋白相联系，并常常在两类生物中具有功能。如在此所使用，术语"同源"所有的语法形式和拼写变化形式是指拥有"共同进化起源"的蛋白之间的关系，包括来自超家族(例如免疫球蛋白超家族)的蛋白和来自不同种的同源蛋白(例如肌球蛋白轻链等)(Reecketal.,1987，Cell50:667.)。这样的蛋白(和它们的编码基因)具有序列同源性，正如它们高度的序列相似性所反映。然而，在通常的用法和本申请中，当用副词例如"高度的"来修饰术语"同源"时，该术语可以指序列相似性而不是共同的进化起源。因此，术语"序列相似性"所有的语法形式是指可以或不必享有共同进化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度(参见Reecketal.,1987，Cell50:667)。在特定的实施方案中，当在限定长度的DNA序列范围内，有至少大约50%(优选至少大约75%、最优选地至少大约卯或95%)的核苷酸匹配时，这两个DNA序列"实质上同源"或"实质上相似"。通过使用可从序列数据库中获取的标准软件进行序列比较，或在例如针对特定系统所限定的严格条件下进行的Southern杂交试验中，可以鉴定基本上同源的序列。限定合适的杂交条件是在本领域的技术范围之内。参见Sambrooketal.,1989，上文。如本文所使用地，术语"实质上相似"是指这样的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化导致一个或多个氨基酸的置换，但是并不影响由该DNA序列编码的蛋白的功能特性。"实质上相似"同样指这样的核酸片段，其中一个或多个核苷酸碱基的变化并不影响该核酸片段通过反义或共抑制技术介导改变基因表达的能力。"实质上相似"也指对本发明的核酸片段进行的修饰，例如删除或插入一个或多个核苷酸碱基，这并不实质上影响到所得转录物的功能特性。因此可以理解的是，本发明所包含的不仅仅是这些特定的示例性序列。各种提议的修饰都完全在本领域的常规技术的范围内，测定被编码的产物的生物学活性的保留也是如此。此外，技术人员认识到本发明所包含的实质上相似的序列也由它们在严格条件(0.1xSSC，0.1%SDS，65。C和用2xSSC，0.1。/oSDS洗涤，再用O.lxSSC，0.1%SDS洗涤)下与在此示例的序列的杂交能力来限定。本发明的实质上相似的核酸片段是那些其DNA序列与在此报告的核酸片段的DNA序列具有至少70%同一性的核酸片段。本发明的优选的实质上相似的核酸片段是那些其DNA序列与在此报告的核酸片段的DNA序列具有至少80%同一性的核酸片段。更优选的核酸片段与在此报告的核酸片段的DNA序列具有至少90%同一性。甚至更优选的是与在此报告的核酸片段的DNA序列具有至少95%同一性的核酸片段。当大约40%以上的氨基酸相同，或60%以上氨基酸相似(功能上相同)时，这两个氨基酸序列是"实质上同源"或"实质上相似"。优选地，通过使用例如GCG(GeneticsComputerGroup,ProgramManualfortheGCGPackage,Version7，Madison,Wisconsin)堆积程序进行比对，鉴定相似或同源的序列。术语"对应于"用于本文是指相似的或同源的序列，无论该确切的位置与同其进行相似性或同源性测量的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列比对可以包括空位。因此，术语"对应于"是指序列相似性，而不是氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。氨基酸或核苷酸序列的"头'质部分"包括多肽足够的氨基酸序列或基因足够的核苷酸序列，从而足以推测性地鉴定那个多肽或基因，这通过本领域技术人员对序列进行手工评价来进行，或者通过使用算法诸如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool;Altschul,S.F.,etal.,(1993)Mo/.5/o/.215:403-410;也参见www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行计算机自动化序列比较和鉴定来进行。一般而言，为了推测性地鉴定与己知的蛋白或基因同源的多肽或核酸序列，IO个或更多个连续氨基酸或30个或更多个核苷酸的序列是必需的。而且，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可以用于序列依赖性的基因鉴定方法(例如Southern杂交)和基因分离方法(例如细菌菌落或噬菌体噬菌斑的原位杂交)。此外，12-15个碱基的短的寡核苷酸可以用作PCR的扩增引物，以便获得包含所述引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的"实质部分"包含足够的序列，足以特异性地鉴定和/或分离包含该序列的核酸片段。如本领域所知道的，术语"同一性百分比"是指两条或更多多肽序列之间或两条或更多多核苷酸序列之间的关系，J下如通过比较序列所确定的。在该
技术领域：
，"同一性"也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这种情况时，可以通过这些序列的链之间的匹配来测定。"同一性"和"相似性"可以用已知的方法容易地计算，包括但不限于描述于下述文献中的方法Co7w戸to"o加/Mj/ecM/ar5/o/ogy(Lesk，A.M.■，ed.)OxfordUniversityPress,NewYork(1988);5/ocom;wri"gv/"y^77H。toawe/Ge"owe/Vq/e"s(SmithjD.W.,ed.)AcademicPress,NewYork(1993);Coff^Wero/Se《wewceDWa,户aW/(Griffin,A.M.禾卩Griffin,H.G.，■eds.)HumanaPress,NewJersey(1994);SegKe"ce爿"fli[ys/51Afo/ecw/ar(vonHeinje，G.,ed.)AcademicPress(1987);禾卩5"e《we"ce^""—j/v/wer(Gribskov，M.禾口Devereux，J.，eds.)StocktonPress,NewYork(1991)。测定同一性的优选方法被设计以便得到测试序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似性的方法编入公开可获得的计算机程序中。可以应用LASERGENEbioinformaticscomputingsuite的Megalign程序(DNASTARInc.,Madison,WI)进行序列比对并计算同一性百分比。可以应用带有默认参数(GAPPENALTY=10、GAPLENGTHPENALTY-IO)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)进行多序列比对。使用Clustal方法的配对比对的默认参数可以被选择KTUPLE1，GAPPENALTY=3，WINDOW=5禾口DIAGONALSSAVED=5。术语"序列分析软件"是指可用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。"序列分析软件"可以通过商业途经获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于GCG程序组(WisconsinPackageVersion9.0，GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschuletal"JAfo/.￡/o/.215:403-410(1990)和DNASTAR(DNASTAR,Inc.1228S.ParkSt.Madison,WI53715USA)。在本申请的上下文中，应该理解，当序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于所参考的程序的"默认值"，除非另外指出。如本文中所使用的，"默认值"指当第一次预置时软件最初加载的任何一组值或参数。"合成基因"可以由使用本领域技术人员已知的程序化学合成的寡核苷酸构建模块装配而成。这些构建模块被连接起來并退火，从而形成基因片段，然后将基因片段酶法装配以构建整个基因。"化学合成"，当涉及DNA序列时，是指核苷酸组分在体外被装配。使用充分建立的程序可以完成DNA的人工化学合成，或者使用许多商业上可得的机器中的一种可以进行自动化化学合i。因此，基于为了反映出宿主细胞的密码子偏爱性的核苷酸序列优化，基因可以被修改以获得最佳的基因表达。如果使密码子使用偏向于宿主所喜好的那些密码子，技术人员将有可能成功地进行基因表达。基于对来自序列信息可获得的宿主细胞的基因的调查，可以确定优选的密码子。本发明本发明提供用于在真核细胞中获得位点特异性重组的组合物和方法。更具体地，本发明利用原核重组酶，诸如单向性的噬菌体重组酶，原因是它们能够催化两互补重组位点之间的重组，但是不能催化由该重组形成的杂合位点之间的重组。本发明鉴定了新型重组酶，每一个重组酶仅仅介导细菌附着位点(a"B)和噬菌体附着位点(加P)之间的重组。重组酶不能介导加L和加R杂合位点之间的重组，该杂合位点在加氾和WfP之间形成重组之时形成。因为重组酶诸如这些重组酶不能单独催化倒位反应，所以a"B和"WP重组是稳定的。该特性是这样的，其使得本发明的组合物和方法与现用于真核细胞的其他重组系统区别开来，诸如Cre-lox或FLP-FRT系统，在这系统中，重组反应是可逆的。本发明重组系统的运用为在真核细胞中指导稳定转基因和染色体重排提供了新的机会。本发明的方法涉及将真核细胞中存在的一对重组附着位点flWB和aP与相应的重组酶接触。重组酶然后介导重组附着位点之间的重组。取决于重组附着位点的相对位置，重组的结果是，可能发生许多事件中的任一事件。例如，如果重组附着位点存在于不同的核酸分子上，重组可能导致一个核酸分子整合入第二个分子中。因此，我们能够将含有一个重组位点的质粒整合入包含相应的重组位点的真核细胞染色体中。因为在本发明方法中使用的重组酶不能催化逆反应，所以整合是稳定的。这样的方法例如可用于获得在质粒中存在的转基因向真核染色体的稳定整合。重组附着位点也可以在相同的核酸分子中存在。在这种情况下，获得的产物典型地依赖于附着位点的相对方向。例如，在平行或直接方向上的位点之间的重组，一般将导致位于重组附着位点之间的任何DNA的切除。反之，相反方向的附着位点之间的重组能够导致间插DNA的倒位。同样地，获得的重排核酸是稳定的，原因是在不存在其他因子或许多因子时，重组是不可逆的，所述因子通常由特定的噬菌体编码和/或由噬菌体的宿主细胞编码，重组酶由噬菌体的宿主细胞衍生而得，其通常未见于真核细胞。本方法有用的一个应用例子涉及在重组附着位点之间安置启动子。如果启动子最初处于与待被启动子表达的编码序列相反的方向，启动子侧翼的重组位点在反方向上，通过接触重组附着位点将导致启动子倒位，从而将启动子置于正确的方向，以驱动编码序列的表达。类似地，如果启动子最初处于用于表达的JH确方向，重组附着位点在相同方向上，通过将重组附着位点与重组酶接触，能够导致启动子片段切除，从而终止编码序列的表达。本发明的方法也可用于获得染色体的易位。例如，在这些实施方式中，一个重组附着位点置于染色体上，第二重组附着位点置于第二染色体上，第二重组附着位点充当与第一重组附着位点重组的底物。一旦重组附着位点与重组酶接触之后，重组发生，从而导致两染色体臂的交换。例如，可以构建生物体的两个菌株，其中一个菌株包含第一重组附着位点，第二个菌株含有第二重组附着位点。两个菌株然后可以杂交，以获得包含两个重组附着位点的子代菌株。一旦将附着位点与重组酶接触，发生染色体臂交换。重组酶〖00119]在引入耙向载体之前、同时或之后，本发明实践中使用的重组酶可以被引入目标细胞。例如使用脂质体、包被颗粒或显微注射，重组酶可以作为蛋白质直接引入细胞中。作为选择，使用合适的表达载体，编码重组酶的多核苷酸——或者DNA或信使RNA可以引入细胞中。上述的靶向载体组分可用于构建含有编码感兴趣重组酶的序列的表达盒。然而，重组酶的表达可以用其他方式调节，例如将重组酶的表达置于可调节启动子(即，其表达可以被选择性诱导或抑制的启动子)的控制之下。如前所述，在本发明实践中使用的重组酶可以重组产生或纯化。具有期望的重组酶活性的多肽可以被纯化至期望的纯度，这通过蛋白质硫酸铵沉淀、纯化领域已知的方法进行，包括但不限于大小分级、亲合层析、HPLC、离子交换层析、肝素琼脂糖亲合层析(例如，Thorpe&Smith,Proc.Nat.Acad.Sci.95:5505-5510，1998)。本发明的重组酶多肽和编码重组酶多肽的核酸描述在实施例1中，并可以使用本领域技术人员知道的常规方法获得。在优选的实施方式中，重组酶是分离的多核苷酸序列，其包括与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7禾卩SEQIDNO:9的核酸序列具有至少90%同一性的核酸，其中所述核酸具有重组酶活性。更优选地，重组酶是分离的多核苷酸序列，包括选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸序列。甚至更优选地，重组酶是分离的多核苷酸序列，包括编码选自SP|3c2重组酶、SF370.1重组酶、Bxbl重组酶、A118重组酶和(])Rvl重组酶的核酸序列。重组酶可以被引入含有重组附着位点的真核细胞，在该重组附着位点，重组是任何合适的方法所期望的。例如通过显微注射或其他方法将功能蛋白质引入细胞的方法是本领域已知的。纯化的重组酶蛋白质的引入确保蛋白质及其功能的瞬时存在，这常常是优选的实施方式。作为选择，编码重组酶的基因可以包含在用于转化细胞的表达载体中，在该细胞中，所述编码重组酶的多核苷酸被可操纵性地连接至介导多核苷酸在真核细胞中表达的启动子。通过编码重组酶多肽的信使RNA，重组酶多肽也可以引入真核细胞。一般优选地，重组酶仅仅在这样的时间段存在，即将核酸片段插入正被修饰的基因组所必需的时间。因此，与大部分表达载体有关的持久性的缺乏并不预期是有害的。在导入感兴趣的外源多核苷酸之前、之后或同时，可以将重组酶引入细胞。在一个实施方式中，重组酶基因在载有待被插入的多核苷酸的载体内存在；重组酶基因甚至可以包含在多核苷酸内。在其他实施方式中，重组酶基因被导入转基因真核生物，例如转基因植物、动物、真菌或类似生物中，其然后与含有相应的重组位点的生物杂交。可以制备转基因细胞或动物，其以组成型方式表达重组酶或在细胞特异性、组织特异性、发育特异性、细胞器特异性或小分子可诱导的或可抑制启动子下在表达重组酶。重组酶作为可以与其他肽、蛋白质、核酸定位信号肽、信号肽或细胞器-特异信号肽(例如，线粒体或叶绿体转运肽，以帮助在线粒体或叶绿体中产生重组)形成融合蛋白的方式表达o在本发明的实施方式中，重组附着位点包含分离的多核苷酸序列，该分离的多核苷酸序列包含与选自SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的核酸序列具有至少卯％同一性的核酸。优选地，附着位点是分离的多核苷酸序列，包含选自SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的核酸序列。载体/构建物本发明考虑的耙向构建物可以含有其他核酸片段，诸如控制序列、标记序列、选择序列和类似物，如下所述。本发明也提供将感兴趣的多核苷酸(或核酸序列(许多核酸序列))靶向插入基因组的方法，该方法例如如下进行(i)提供重组酶，其中所述重组酶能够促进第一重组位点和第二重组位点之间的重组；(ii)提供具有第一重组序列和感兴趣多核苷酸的靶向构建物(iii)将重组酶和靶向构建物引入细胞中，该细胞的核酸中含有第二重组位点，其中所述引入歩骤在在允许重组酶促进第一重组位点和第二重组位点之间的重组事件的条件下进行。本发明也涉及用于将多核苷酸序列以位点特异性的方式整合入分离的真核细胞的基因组的载体，所述载体包含感兴趣的多核苷酸和第二重组fl/氾或flP位点，其中所述第二重组加氾或加/P位点包含与所述分离的真核细胞的基因组中的第一重组fl"P或加氾位点或假fl"P或假a"B位点重组的多核苷酸序列，所述重组在位点特异性重组酶存在下发生，所述位点特异性重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶、耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组位点是a/氾或假a"B时，第二重组位点是加/P，当第一重组位点是aP或假加fP时，第二重组位点是artB。优选地，重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP|3c2重组酶、4>Rvl重组酶和Bxbl重组酶。感兴趣的多核苷酸可以包括但不限于编码多肽产物的表达盒。寻靶构建物可以是环状的或线性的，也可以含有选择性标记，复制起点和其他元件。各种表达载体适合用于本发明的实践，不但适合用于原核生物也适合用于真核生物。总之，靶向构建物将具有一个或多个下述特征启动子、启动子-增强子序列、选择标记序列、复制起点、可诱导元件序列、表位-标记序列和类似物。启动子和启动子-增强子序列是RNA聚合酶与之结合并^g始转录的DNA序列。通过指定哪一条链将被转录，启动子决定转录子的极性。细菌启动子由共有序列、与转录起始相对的-35和-10核苷酸组成，它们被特异性的a因子和RNA聚合酶结合。真核启动子更复杂。在表达载体中使用的大部分启动子由RNA聚合酶II转录。通用转录因子(Generaltranscriptionfactors(GTFS))首先结合起点附近的特异性序列，然后募集RNA聚合酶II的结合。除了这些最基本的启动子元件之外，小序列元件被调节给定启动子活性的模块DNA-结合/反式作用蛋白质(例如AP-1、SP-1)特异性识别。病毒启动子发挥与细菌或真核启动子相同的功能，或者提供特异性反式RNA聚合酶(噬菌体T7)，或募集细胞因子或RNA聚合酶(SV40、RSV、CMV)。优选病毒启动子，因为它们通常是特别强的启动子。此外，启动子可以是或者组成型的或者可调节的(即，可诱导的或可抑制的)。可诱导元件是这样的DNA序列元件，其与启动子一起发挥作用并结合抑制物(例如，在大肠杆菌中的lacO/LACIq抑制物系统)或诱导物(例如，在酵母中的gall/GAL4诱导物系统)。在任一情况下，转录实质上是"关闭的"，直到启动子被抑制或被诱导，在这时转录被"开启"。组成型启动子的例子包括噬菌体X的int启动子、pBR322的|3-内酰胺酶基因序列的bla启动子、pPR325的氯霉素乙酰转移酶基因序列的CAT启动子和类似启动子。诱导型原核启动子的例子包括噬菌体的主要右和左启动子(P.sub丄和P.sub.R)，大肠杆菌(￡co/,')的trp、reca、lacZ、AraC和gal启动子，枯草芽孢杆菌的a-淀粉酶(UlmanenEttat.,J.Bacterid.162:176-182，1985)和cj-28-特异性启动子(Gilmanetal.，Genes叫uence32:11-20(1984))，杆菌的噬菌体的启动子(Gryczan，In:TheMolecularBiologyoftheBacilli,AcademicPress,Inc.,NY(1982))，链霉菌启动子(Wardetat.,Mol.Gen.Genet.203:468-478，1986)，和类似启动子。Glick(J.Ind.Microtiot.277-282,1987):Cenatiempo(Biochimie68:505-516，1986);和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18:415-442,1984)综述了示例性的原核启动子。优选的真核启动子包括但是不限于下述；小鼠金属硫蛋白I基因序列的启动子(Hameretal.,J.Mol.Appl.Gen.1:273-288,1982);疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell31:355-365,1982);SV40早期启动子(Benoistetal.,Nature(London)290:304-310,1981);酵母gall基因序列启动子(Johnstonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)79:6971-6975，1982);Silveretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:5951-59SS，1984)，CMV启动子、EF-1启动子蜕皮^C素-应答性启动子(许多启动子)、四环素-应答性启动子，和类似启动子。选择在本发明中使用的示例性启动子，以便它们在它们被引入的细胞类型(和/或动物或植物)中具有功能。选择标记在表达载体中是有价值的元件，因为它们提供了仅仅选择那些含有载体的细胞的生长工具。这样的标记有两种类型耐药性标记和营养缺陷型标记。耐药性标记使得细胞能够对外源加入的药物解毒，否则会杀死细胞。当生长在缺少必要组分的培养基中时，营养缺陷型标记使得细胞能够合成必要组分(通常是氨基酸)。常见的选择性标记基因包括那些对抗生素诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、博来霉素、链霉素、潮霉素、新霉素、Zeocin.TM.和类似物具有抗性的基因。选择性营养缺陷型基因包括例如hisD，其允许在组氨醇存在时，能够在无组氨酸的培养基中生长。在表达载体中有用的一个其他元件是复制起点。复制起点是含有多短重复序列的独特DNA片段，它们被多聚起点-结合蛋白识别并在起点装配DNA复制酶中发挥关键作用。用于本文中使用的表达载体的合适的复制起点包括大肠杆菌oriC，colEl质粒起点，和ARS(两者都用于酵母系统)，sfl、SV40、EBVoriP(用于哺乳动物系统)和类似起点。表位标记是被表位特异性抗体识别的短肽序列。通过使用结合到层析树脂的抗体，包含重组蛋白和表位标记的融合蛋白可以被简单而容易地纯化。表位标记的存在还允许重组蛋白在随后的试验，例如Western印迹中得以检测，而不必产生对重组蛋白本身具有特异性的抗体。通常使用的表位标记的例子包括V5、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、血凝(HA)、肽Phe-His-His-Thr-Thr、几丁质结合结构域和类似物。在表达载体中有用的其他元件是多克隆位点或多接头。编码一系列限制性核酸内切酶识别位点的合成DNA被插入质粒载体，例如启动子元件的下游。对这些位点进行改造，以将DNA方便地克隆入载体的特异性位点。可以将前述元件组合起来，产生适合用于本发明方法的表达载体。根据本说明书的教导，本领域技术人员将能够选择并组合适合用于它们特定系统的元件。适合的原核载体包括质粒，诸如能够在大肠杆菌中复制的质粒(例如，pBR322、ColEl、pSC101、PACYC184、itVX、PRSET、pBAD(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)禾口类j以物)。Sambrook(cf."MolecularCloning:ALaboratoryManual,"secondedition,editedbySambrook,Fritsch,&Maniatis，ColdSpringHarborLaboratory,(1989))公开了这样的质粒。杆菌质粒包括pC194、pC221、pT127和类似物，并且被Gryczan(In:TheMolecularBiologyoftheBacilli,AcademicPress,NY(1982),pp.307-329)公开。合适的链霉菌质粒包括plil01(Kendalletal"J.Bacteriol.169:4177-4183,1987)和链霉菌U筮菌体诸女卩OC31(Chateretal"In:SixthInternationalSymposiumonActinomycetalesBiology,AkademiaiKaido,Budapest,Hungary(1986),pp.45-54)。Johnetal.(Rev.InfectDis.8:693-704，1986)和Izaki(Jpn.J.Bacteriol,33:729-742,1978)综述了假单胞菌质粒。合适的真核质粒包括例如BPV、EBV、牛痘、SV40、2-微米环、pcDNA3.1、pcDNA3.1/GS、pDual、pYES2/GS、pMT、pIND、p腸(Spl)、pVgRXR(Invitrogen)和类似物或它们的衍生物。这样的质粒是本领域熟知的(Botsteinetal.，MiamiWntr.SyTnp.19:265-274,1982;Broach,In:"TheMolecularBiologyoftheYeastSaccharomyces:LifeCycleandInheritance",ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，p.445-470，1981;Broach,Cell28:203-204，1982;Dilonetal.，J.Clin.Hematol.Oncol.10:39-48，1980;Maniatis,In:CellBiology:AComprehensiveTreatise,Vol.3，GeneSequenceExpression,AcademicPress,NY，pp.563-608,1980)。根据本说明书的教导，本文所述的寻靶盒(targetingcassette)可以用分子生物学领域已知的方法学构建(参见例如Ausubel或Maniatis)。如上所述，通过向合适的载体骨架插入重组附着位点、可操纵性连接至感兴趣启动子的感兴趣的多核苷酸编码序列；和任选地编码阳性选择标记的序列，装配寻靶构建物。获得多核苷酸，包括合适的调节序列(例如，启动子)的优选方法是PCR。在MacPhersonetal.,PCR:APRACTICALAPPROACH,(IRLPressatOxfordUniversityPress,(1991))中教导了PCR的通用程序。每一应用反应的PCR条件可以根据经验來决定。许多参数影响反应的成功。在这些参数中有退火温度和时间、延伸时间、Mg21nATP浓度、pH、以及引物、模板和脱氧核糖核苷酸的相对浓度。扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳，然后用溴化乙啶染色和紫外线照射，检测获得的片段。本发明的表达盒、寻耙构建物、载体、重组酶和重组酶-编码序列可以配制入试剂盒。这样的试剂盒的组分可以包括但是不限于容器、说明书、溶液、缓冲液、一次性用品和硬件。方法本发明涉及用于位点特异性重组的方法，包括提供第一重组位点和第二重组位点；将所述第一重组位点和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，从而在重组位点之间产生重组，其中重组酶多肽能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的重组，第一重组位点是"WP或a/氾，第二重组位点是或加/P，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌嗜菌重组酶、耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是W/B时，第二重组附着位点是加rP，当第一重组附着位点是a"P时，第二重组附着位点是a"B。在另一个实施方式中，位点特异性重组导致剔除或切除。在哺乳动物遗传学中最常见的应用是在确定发育阶段的失活或激活。待被从染色体或附加DNA剔除或切除的DNA或基因的侧翼是第一重组和第二重组位点的串连(直接)重复。由于重组酶的导入而引发的位点之间的重组，导致DNA的剔除和基因失活。在另一类型的应用中，重组酶能够介导转录终止信号(存在于启动子和基因之间)从基因组中切除，从而将启动子元件连接至转基因的开放阅读框，并激活基因表达。通过使用组成型或诱导型启动子，或通过引入重组酶-表达病毒载体，重组酶能够得以表达。在其他实施方式中，位点特异性重组导致倒位。以相反方向插入同样的DNA分子的第一重组位点和第二重组位点之间的重组(分子内重组)导致间插DNA部分或片段的倒位。在进一步的实施方式中，位点特异性重组导致DNA的交换。首先在染色体的感兴趣位置产生盒式接纳体。盒式接纳体含有感兴趣的DNA，常常是选择标记基因，在任意一边的侧翼是第一重组位点(例如加氾)。第二，含有在任意一边的侧翼是重组位点(例如aWP)的置换DNA盒(replacementDNAcassette)的交换载体与重组表达质粒或重组酶蛋白一起导入细胞。同源重组识别位点之间的双杂交，导致在第一重组位点与交换载体携带的重组位点之间发生DNA置换。在另一例子中，第一重组位点是加fP,和第二重组位点是W氾。该程序常常被称为重组酶-介导的盒式交换。在其他实施方式中，位点特异性重组导致染色体易位。对于染色体易位，第一重组位点被引入第一染色体，第二重组位点被引入第二染色体。供应细胞以重组酶，导致染色体的易位。当重组位点被靶向至非同源染色体时，产生易位。依靠重组位点的相对方向，重组导致易位或双着丝粒或无着丝粒染色体。当重组位点以与它们各自的着丝粒相对的方向定向时，发生易位。如果，重组位点在相反的方向，重组将产生无着丝粒和双着丝粒染色体。本发明也包括在基因组中存在的假重组附着位点上的重组酶-介导的DNA插入。特异性重组酶的假重组或附着位点是在染色体上存在的天然序列，位点特异性重组酶能够识别并用于整合含有第一或第二重组位点的质粒DNA。在假重组位点上的整合比随机整合常常更频繁。这是一个单步骤的过程，在某种意义上，没有必要将重组位点引入基因组作为第一步骤。在假位点上的整合在基因和细胞治疗中都有应用。假加氾是在与WfP位点重组的基因组中存在的天然重组位点。假""P是在与a"B位点重组的基因组中存在的天然重组位点。因此，本发明提供了在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞将第一重组位点和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，产生重组位点之间的重组，其中重组酶多肽能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的重组，第一重组位点是aP或a"B，第二重组位点是假附着位点，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶。优选地，重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP卩c2重组酶、$Rvl重组酶和Bxbl重组酶。本发明还包括在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞，具有侧翼是第三重组位点和第四重组位点的多核苷酸序列；将重组酶位点与原核重组酶多肽接触，从而在重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导第一和第三重组位点以及第二和第四重组位点之间的重组，所述第一和第二重组位点是fl"P或加/B，第三和第四重组位点是flf氾或aWP，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻塘分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一和第二重组附着位点是W岀时，第三和第四重组附着位点是"HP，当第一和第二重组附着位点是加/P时，第三和第四重组附着位点是W氾。优选地，重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP(3c2重组酶、$Rvl重组酶和Bxbl重组酶。本发明的另一个实施方式提供了将感兴趣的多核苷酸以位点特异性的方式整合入转基因对象的基因组的方法，其中所述基因组包含第一重组或fl"P位点或假"WB或假W/P位点，所述方法包括引入包含感兴趣的多核苷酸和第二重组W/P或加氾位点的核酸；将第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，其中重组酶多肽能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组位点是fl"B或假W氾时，第二重组位点是a"P，当第一重组位点是加/P或假a"P时，第二重组位点是fl/出。优选地，重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPpc2重组酶、4)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。本发明的另一方法提供了在真核细胞中获得多位点特异性重组，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞，其具有第三重组位点和第四重组位点；将第一重组位点和第二重组位点与第一原核重组酶多肽接触，将第三和第四重组位点与第二原核重组酶多肽接触，从而导致第一重组位点和第二重组位点之间的重组，以及第三和第四重组位点之间的重组，其中第一重组酶多肽能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的重组，第二重组酶多肽能够介导第三和第四重组位点之间的重组，第一和第二重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是第一重组酶多肽和第二重组酶多肽是不同的。该方法还包括第五重组位点和第六重组位点以及第三重组酶多肽，其中所述第三重组酶多肽能够介导第五和第六重组位点之间的重组，条件是第三重组酶多肽不同于第一和第二重组酶多肽。本发明还涉及包含原核重组酶多肽或编码原核重组酶的核酸的真核细胞，其中所述重组酶能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，所述第二重组位点能够充当与第一重组位点重组的底物，其中第一重组位点是artP、假加P、诚B或假敏B，第二重组位点是a"B、假a"B、加P、假加P，重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组位点是加氾时，第二重组位点是fl"P或假"WP;当第一重组位点是假^氾时，第二重组位点是加/P;当第一重组位点是a"P时，第二重组位点是a"B或假加氾；当第一重组位点是假a"P时，第二重组位点是fl"B。优选地，重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPPc2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。细胞适于用本发明方法修饰的细胞包括原核细胞和真核细胞。原核细胞是缺少明确的细胞核的细胞。合适的原核细胞的例子包括细菌细胞、支原体细胞和古细菌细胞。特别优选的原核细胞包括各种类型的试验系统中有用的那些(下面有详细讨论)，或具有一些工业利用性的那些，诸如产酸克雷伯氏菌(幻efo/e/Zaojc少too/)(乙醇生产)、丙酮丁醇梭菌(C/oWrWwm(丁醇生产)禾卩类似物(参见，GreenandBennet,Biotech&Bioengineering58:215-221，1998;Ingram,etal,Biotech&Bioengineering58:204-206，1998)。合适的真核细胞不但包括动物细胞(诸如，来自昆虫、啮齿类动物、家牛、山羊、兔、绵羊、非人灵长类动物、人和类似动物)，而且包括植物细胞(诸如水稻、玉米、棉花、烟草、番茄、土豆和类似植物)。在下面详细论述了可应用于特定目的的细胞类型。本发明的还有另一个实施方式包括分离的遗传工程细胞。合适的细胞可以是原核细胞或真核细胞，如上所述。本发明的遗传工程细胞可以是单细胞生物或可以源自多细胞生物。关于源自多细胞生物的遗传工程细胞，"分离的"是指活体之外的细胞，无论是植物还是动物，并且是在人工环境中。术语"分离的"的使用并不意味着遗传工程细胞是唯一存在的细胞。在一个实施方式中，本发明的遗传工程细胞含有本发明的任一核酸构建物。在第二实施方式中，在感兴趣的核酸序列将被插入基因组的条件下，特异性识别重组序列的重组酶被引入遗传工程细胞，该遗传工程细胞含有本发明的其中一种核酸构建物。因此，遗传工程细胞具有修饰的基因组。引入此重组酶的方法是本领域熟知的，如上所述。来自多细胞生物的分离细胞可以具有类似的用处，包括昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞。可能有用的哺乳动物细胞包括那些衍生自啮齿动物、灵长类动物和类似物的细胞。它们包括中国仓鼠卵(CHO)细胞、HeLa细胞、小鼠神经干细胞、大鼠骨髓基质细胞、纤维原细胞来源的细胞，诸如VERO、3T3或CH0K1、HEK293细胞，或淋巴起源的细胞(诸如32D细胞)和它们的衍生物。此外，植物细胞诸如烟草BY2细胞也可用作宿主，与植物细胞相容的控制序列是可得的，诸如花椰菜花叶病毒35S和19S、胭脂氨酸合成酶启动子和多聚腺苷酸化信号序列和类似物。合适的转基因植物细胞可用于产生转基因植物。另一优选的宿主是昆虫细胞，例如来自果蝇幼虫。使用昆虫细胞作为宿主，可以使用果蝇醇脱氢酶启动子(Rubin,Science240:1453-1459,1988)。作为选择，可以对杆状病毒整体进行工程改造，以在昆虫细胞中表达大量的由期望的核酸序列编码的肽(Jasny,Science238:1653,1987);Milleretal.，In:GeneticEngineering(1986)，Setlow，J.K.,etal"eds"Plenum,Vol.8，pp.277-297)。本发明的遗传工程细胞还可以用作筛选物质的工具，所述物质能够调节由感兴趣的核酸片段编码的蛋白质的活性。因此，本发明其他的实施方式包括筛选方法，该方法包括将本发明的遗传工程细胞与试验物质接触；并监控同没有与试验物质接触的试验细胞相比，细胞在细胞表现型、细胞增殖、细胞分化、蛋白质的酶活性或蛋白质和蛋白质的天然结合伴侣之间的相互作用方面的变化。使用本发明的遗传工程细胞，可以评价各种测试物质，包括肽、蛋白质、抗体、低分子量有机化合物、衍生自例如真菌或植物细胞的天然产物和类似物。"低分子量有机化合物"是指分子量通常500-1000以下的化学物质。试验物质的来源是本领域技术人员熟知的。利用细胞的各种分析方法也是本领域技术人员熟知的。这些方法包括例如，酶活性分析(Hirth,etal,美国专利5,763,198，1998年6月9日出版)、试验物质与遗传工程细胞表达的蛋白质结合的分析、报道基因转录活化的分析和类似的分析。由本发明方法修饰的细胞可以维持在这样的条件下，例如(i)维持它们存活但是不促进生长，(ii)促进细胞生长，和/或(iii)使细胞分化或去分化。细胞培养条件典型地允许重组酶在细胞中发挥作用，尽管对重组酶活性的调控可以被培养条件调节(例如，提高或降低细胞培养温度)。对于给定细胞、细胞类型、组织或生物，培养条件是本领域己知的。转基因植物和非人动物在另一个实施方式中，本发明包括转基因植物和非人转基因动物，利用本发明的方法和组合物，其基因组已被修饰。利用本发明的方法，可以产生转基因动物，以充当模型系统，用于研究各种紊乱和筛选调节此种紊乱的药物。"转基因"植物或动物指遗传工程改造的植物或动物，或遗传工程改造的植物或动物的子代。转基因植物或动物通常含有来自至少一个不相关生物，诸如来自病毒的物质。在转基因生物上下文中，所用的术语"动物"指人之外的所有物种。它也包括所有发育阶段的单个动物，包括胚胎阶段和胎儿阶段。农业动物((例如，鸡、猪、山羊、绵羊、牛、马、兔、和类似动物)、啮齿动物(诸如小鼠)和家养宠物(例如猫和狗)包括在本发明的范围之内。在优选的实施方式中，动物是小鼠或大鼠。术语"嵌合的"植物或动物用来指其中发现异源基因的植物或动物，或其中异源基因在某些但不是在植物或动物的所有细胞中表达。术语转基因动物也包括生殖细胞系转基因动物。"生殖细胞系转基因动物"是一种转基因动物，在其中本发明方法提供的遗传信息已被吸收并整合入生殖细胞系细胞中，从而赋予将信息转移给子代的能力。如果该子代，实际上，拥有一些或所有那些信息，那么它们也是转基因动物。产生转基因植物和动物的方法是本领域已知的，并可以与本申请的教导联合使用。在一个实施方式中，本发明的转基因动物通过如下产生向单细胞胚胎引入核酸构建物，所述构建物包括能够与第二重组位点重组的第一重组位点和感兴趣的核酸片段，所述第二重组位点在从其获得细胞的生物基因组内发现，以感兴趣的核酸片段被稳定整合入成熟动物的生殖细胞系细胞的DNA的方式进行，并以正常孟德尔方式遗传。在该实施方式中，感兴趣的核酸片段可以是前述任一片段。作为选择，感兴趣的核酸序列能够编码异源产物，该异源产物中断或干涉感兴趣的内源产生蛋白的表达，产生感兴趣蛋白的表达减少的转基因动物。有多种方法可以用于产生转基因动物。本发明的核酸构建物可以在雄性和雌性前核融合之前被注射入受精卵的前核或细胞质，或在细胞分化起始之后被注射入胚胎细胞的核(例如双细胞胚胎的核)中(Brinster，etal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:4438,1985)。胚胎可以用病毒，尤其是逆转录病毒感染，用fl"D重组位点和感兴趣的核酸序列修饰。如上所述地，细胞还可以用位点特异性重组酶处理，以促进感兴趣的核酸序列整合入基因组。仅仅作为例子，为了制备转基因小鼠，对雌性小鼠诱导使其排卵过度。在允许交配之后，通过用C02窒息或断颈的方式杀死雌性小鼠，并从切除的输卵管回收胚胎。去除周围的堆积细胞。然后洗涤前核胚胎并保存，直到注射之时。随机循环成年雌性小鼠与切除输精管的雄性小鼠配对。受体雌性小鼠与供体雌性小鼠在相同的时间交配。胚胎然后通过手术转移。产生转基因大鼠的程序与小鼠类似。参见Hammer,etal.,Cell63:1099-1112,1990)。适合于转基因实验的啮齿动物可以从标准的商业来源获得，诸如CharlesRiver(Wilmington,Mass.)、Taconic(Germantown,N.Y.)、HarlanSpragueDawley(Indianapolis,Ind.)，等等。操纵啮齿动物胚胎的程序和将DNA显微注射入受精卵的前核中的程序，是本领域普通技术人员熟知的(Hogan，etal.，见上文)。对鱼类、两栖类卵和鸟的显微注射的程序在HoudebineandChourrout,Experientia47:897-905,1991)中被详细描述。将DNA导入动物组织的其他程序描述在美国专利4，945,050(Sandfordetal.，Jul.30，1990)中。源自胚胎的内细胞团的、并在培养基中稳定的全能或多能干细胞在培养基中进行操作，以利用本发明方法整合核酸序列。通过注射入胚泡，然后植入代孕母本并允许达到分娩期，从而可以由这样的细胞产生转基因动物。培养干细胞的方法和随后通过将DNA引入干细胞产生转基因动物的方法也是本领域普通技术人员熟知的，其中将DNA引入干细胞所使用的方法诸如电穿孔、磷酸钙/DNA沉淀、显微注射、脂质体融合、逆转录病毒感染和类似方法。参见例如TeratocarcinomasandEmbryonicStemCells,APracticalApproach,E.J.Robertson,ed.,IRLPress,1987)。用于将异源DNA显微注射入哺乳动物(小鼠、猪、兔、绵羊、山羊、牛)受精卵的标准头'验室程序的综述包括Hoganetal.,ManipulatingtheMouseEmbryo(ColdSpringHarborPress1986);Krimpenfortetal.，1991，Bio/Technology9:86;Palmiteretal.，1985，Cell41:343;Kraemeretal"GeneticManipulationoftheEarlyMammalianEmbryo(ColdSpringHarborLaboratoryPress1985);Hammeretal.,1985,Nature,315:680;Purceletal.,1986,Science,244:1281;Wagneretal.;美国专利5,175,385;Krimpenfortetal.，美国专利5,175,384，它们各自的内容并入本文作为参考。程序的最后阶段是将靶向的ES细胞注射入胚泡，并将胚泡转移入假孕雌性中。培育得到的嵌合动物，通过Southern印迹分析子代，以鉴定携带转基因的个体。产生非啮齿动物哺乳动物和其他动物的程序已经被其他文献公开(参见HoudebineandChourrout，supra;Pursel，etal"Science244:1281-1288，1989;禾口Simms,etal.,Bio/Technology6:179-183，1988)。携带转基因的动物可以通过本领域熟知的方法鉴定，例如通过点印迹或Southern印迹。本文所用的术语转基因还包括任何生物，其基因组已经通过早期胚胎或受精卵的体外操作或通过诱导特异性基因敲除的任何转基因技术而被改变。如本文所用，术语"基因敲除"指伴随功能丧失的体内基因靶向中断，这已经通过使用本发明载体而实现。在一个实施方式中，具有基因敲除的转基因动物是那些动物，在它们中，通过靶向位于基因序列中的假-重组位点，通过靶向待被致使无功能的基因的插入，已使得目标基因没有功能。基因治疗和紊乱本发明进一步的实施方式包括在需要此治疗的对象中治疗紊乱的方法。在本方法的一个实施方式中，对象的至少一个细胞或细胞类型(或组织，等等)具有重组位点。该细胞(许多细胞)用核酸构建物("寻靶构建物")转化，该核苷酸构建物包括第二重组序列和一个或多个感兴趣的多核苷酸(典型地是治疗基因)。向同一细胞，引入特异性识别重组序列的重组酶，在感兴趣的核酸序列通过第一重组位点和第二重组位点之间的重组事件插入基因组的条件下进行。使用本发明的方法可以处理的对象包括人和非人动物。这样的方法利用本发明的寻靶构建物和重组酶。通过利用本发明的方法，可以治疗各种紊乱，包括单基因紊乱、感染疾病、获得性紊乱、癌症和类似紊乱。示例性单细胞紊乱包括ADA缺陷、囊肿性纤维化、家族性高胆固醇血症、血友病、慢性青光眼病、杜兴氏型肌营养不良、范可尼贫血、镰刀状细胞贫血、高歇氏病、亨特氏综合征、X-连锁SCDD和类似紊乱。通过利用本发明的方法可以治疗的感染性疾病包括由各种类型的病毒引起的感染，病毒包括人T-细胞嗜淋巴细胞病毒、流感病毒、乳突淋瘤病毒、肝炎病毒、疱疹病毒、Epstein-Bar病毒(埃巴二氏病毒)、免疫缺陷病毒(HIV和类似病毒)、巨细胞病毒和类似病毒。也包括由其他病原性生物引起的感染，诸如结核分枝杆菌、肺炎支原体(Afyco/to"wp"e歸om》e)和类似生物，或寄生虫诸如P/aswacf/wm_/i7/c,》flram禾口类似寄生虫。本文所用的术语"获得性紊乱"指非先天性紊乱。这样的紊乱通常被认为比单基因紊乱更复杂，并可能由一种或多种基因不适当的或不必要的活性所致。这样的紊乱的例子包括外周动脉疾病、风湿性关节炎、冠心病和类似疾病。通过利用本发明的方法可以治疗的一组特定的获得性紊乱包括各种癌症，包括实体肿瘤和血源性肿瘤，诸如白血病和淋巴瘤。通过利用本发明的方法可以治疗的实体肿瘤包括癌症、肉瘤、骨瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤和类似肿瘤。具体的癌症包括乳腺癌、脑癌、肺癌(非小细胞和小细胞肺癌)、肠癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌、膀胱癌、肾癌、头颈癌和类似癌症。在基因组中特定位置的合适性，部分地取决于正被治疗的特定紊乱。例如，如果紊乱是单基因紊乱，并且期望的治疗是加入治疗性核酸——编码被认为是紊乱的成因剂的非突变形式的核酸，那么合适的位置可以是这样的基因组区域，其不编码任何已知的蛋白并且允许加入的核酸产生合理的表达水平。在基因组中鉴定合适的位置的方法是本领域熟知的，并在下面的实施例中有进一歩的描述。在该实施方案中使用的核酸构建物还包括一个或多个感兴趣的核酸片段。在该实施方案使用的优选的感兴趣核酸片段是治疗性基因和/或控制区域，如前所定义。对核酸序列的选择将依据待被治疗的紊乱的特性。例如，旨在治疗血友病B的核酸构建物，可以包含编码功能因子IX的核酸片段，其中血友病B由凝集因子IX的缺乏而引起的。旨在治疗阻塞性外周动脉疾病的核酸构建物可以包含编码刺激新血管生长的蛋白质的核酸片段，诸如例如血管内皮生长因子、血小板-衍生的生长因子和类似物。本领域技术人员将容易地认识到哪种感兴趣的核酸片段将在特定紊乱的治疗中是有用的。使用各种方法，核酸构建物可以被给予正被治疗的对象。给予可以体内或离体进行。"体内"，它是指在动物的活体内。"离体"，它是指细胞或器官在体外被修饰，这样的细胞或器官通常被返回到活体。核酸构建物的治疗性给予的方法是本领域熟知的。核酸构建物可以用阳离子月旨类(Goddard,etal，GeneTherapy,4:1231-1236,1997;Gorman,etal，GeneTherapy4:983-992,1997;Chadwick,etal，GeneTherapy4:937-942,1997;Gokhale,etal,GeneTherapy4:1289-1299，1997;Gao,andHuang,GeneTherapy2:710-722,1995，所有文献并入本文作为参考)、使用病毒载体(Monahan,etal，GeneTherapy4:40-49，1997;Onodera，etal,Blood91:30-36,1998，所有文献并入本文作为参考)、通过"裸露DNA"的吸收和类似方法来传递。本领域熟知的、用于细胞转染的技术(参见上面的讨论)可以用于核酸构建物的离体给予。根据患者的状况，个体医师可以选择准确的配方、给予途径和剂量(参见例如Fingletal.,1975,in"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",Ch.1pl)。总体而言，在紊乱治疗中，被靶向用于基因组修饰的细胞中至少1-10%应该被修饰。因此，对方法和给予途径将作最佳选择，以便每次给予修饰至少0.1-1%的目标细胞。这样，给予的数量可以维持在最小水平，以便增加治疗的效率和方便性。取决于正被治疗的特定症状，可以配制这样的试剂并全身性地或局部给予。配制和给予的技术可以参见"Remington'sPharmaceuticalSciences,"1990，18thed.，MackPublishingCo.,Eastern,Pa。合适的途径可以包括经口、直肠、经皮、阴道、经黏膜或肠内给药；肠胃外递送，包括肌内、皮下、骨髓内注射，以及胸内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射，等等。正被治疗的对象还将给予重组酶，该重组酶特异性地识别经选用的第一和第二重组序列。通过包括作为核酸构建物的一部分的、编码重组酶的核酸，或作为被基因组待被修饰的细胞吸收的蛋白质，特定的重组酶可以被给予。对于包含重组序列和感兴趣核酸序列的寻靶构建物的给予，给予的方法和途径与上述的方法和途径相似。对于感兴趣核酸序列的整合，可能仅在有限的时间段里需要重组酶蛋白质。因此，如果作为重组酶基因引入，携带重组酶基因的载体将缺少介导延长的保留的序列。例如，常规的质粒DNA在大部分哺乳动物细胞中快速衰变。重组酶基因也可以装备有限制其表达的基因表达序列。例如，可以使用诱导型启动子，以便通过有限地暴露于诱导剂，重组酶表达可以被临时性地调节。一组这样的示例性启动子是脱皮激素应答性启动子，其表达可以通过使用脱皮甾酮或其他非-固醇类激动剂进行调节。另一组启动子是四环素-应答性启动子，其表达可以通过使用四环素或多四环素进行调节。实施例通用方法本文中应用的标准的重组DNA和分子克隆技术是本
技术领域：
众所周知的，并描述于下述文献中，Sambrook,J.,Fritsch，E.F.和Maniatis,T.Mo/ecw/arC7om力g.'爿丄060W07Mawwo/;ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)(Maniatis);T.J.Silhavy，M.L.Bennan禾QL.W.Enquist，Zx/e〃'me她wz'A尸ww'ora，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.(1984);以及Ausubel,F.M.etal.，Cw^reWJVo/oco/s/"A/oZecw/arGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)。适合于维持和培养细菌培养物的材料和方法是本
技术领域：
熟知的。适用于下述实施例的技术可以参见Phillipp,G.etal.，Ma聰a/o/M"/zo^yGewera/5a"en'o/ogy,AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,DC.(1994)或Brock，T.D.Jrex/6oo)feo//"t/wW"'a/Mcro6zWogy,SecondEdition,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1989)。除非另外说明，用于培养和维持宿主细胞的所有试剂、限制性酶和材料获自NewEnglandBiolabs(Beverly,MA)，InvitrogenCorporation(Carlsbad,CA)、■StratageneCorporation(LaJolla，CA)、PromegaCorporation(Madison,WI)、DIFCOLaboratories(Detroit,MI)或Sigma/AldrichChemicalCompany(St.Louis,MO)。遗传序列和比对的操作以及多核苷酸和多肽序列的比较可以用得自InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA(VectorNTIsoftwareversion8.0)、DNASTAR，Inc.,Madison,WI(DNASTARsoftwareversion6.0)或GeneticsComputerGroupInc.,Madison,WI(WisconsinPackageVersion9.0)的程序组来完成。縮写的含意如下"h"指小时，'VL"指微升，"mL"指毫升，"L"指升，"^iM"指微摩尔浓度，"mM"指毫摩尔浓度，"ng"指纳克，"吗，'指微克，"mg"指毫克，"A"指腺嘌呤或腺苷，"T"指胸腺嘧啶或胸苷，"G"指鸟嘌呤或鸟苷，"C"指胞嘧啶或胞苷，"nt"指核苷酸，"aa"指氨基酸，"bp"指碱基对，"kb"指千碱基对，"k"指千，V微，"O"指Phi，"p"指beta，"SE"指标准误差，"Luc"指萤火虫荧光素酶，"RLuc"指iem7/fl荧光素酶，"'C"指摄氏度。下面的实施例表明，源自枯草芽孢杆菌噬菌体SP(k2、化脓性链球菌噬菌体SF370.1、耻垢分枝杆菌噬菌体Bxbl、单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体A118和结核分枝杆菌噬菌体O)Rvl的位点特异性重组酶系统在真核细胞中发挥作用。这些实施例被提供用以举例说明而不是限制本发明。实施例1:重组酶基因的设计、合成和克隆以及分子内重组试验质粒在分析了出版的文献和在Genbank中可得的序列后，选择并分析了大量位点特异性重组酶用于哺乳动物和植物细胞的DNA整合、切除、倒位和置换。从GenBank获得大的位点特异性丝氨酸家族重组酶的氨基酸序列(Smit1^M.C.andH.M.Thorpe2000Diversityintheserinerecombinases.Mol.Microbiol.,44:299-307)，并反向翻译成DNA。因为重组酶的来源来自细菌和细菌病毒，我们优化在哺乳动物细胞中用于重组酶表达的DNA序列，而不改变编码的氨基酸序列。使用用于高水平的人类和小鼠表达的密码子，以及用于克隆的方便的限制酶位点，完整地合成基因。此外，如果可能，避免极高(〉80。/。)或极低(〈30。/。)GC含量的区域。此外，在优化期间，避免下述顺式作用序列基序，以优化RNA稳定性和翻译-内部TATA-盒，chi-位点和核糖体进入位点-富含AT或富含GC的序列段-重复序列和RNA二级结构-(隐蔽)剪接供体和受体位点，分支点-多聚(A)位点密码子和RNA优化导致在天然(即，在Genbank获得的DNA序列)和合成基因之间具有20-30%的序列差异。将编码重组酶的合成基因克隆入哺乳动物和获自StratageneCorporation(LaJolla，CA，编号214501)的大肠杆菌表达质粒pDual中。pDual表达载体指导异源基因在哺乳动物和原核细胞中表达。对于在哺乳动物细胞中的组成型表达，载体含有人巨细胞病毒(CMV)即时早期基因的启动子/增强子。重组酶基因克被隆在CMV启动子和SV40终止子序列之间存在的独特Earn1104I限制性酶位点上。当合成基因序列时，我们将Eam1104I限制酶识别位点添加在基因的起始(在起始密码子ATG之前)和末端处(终止密码子之后TAG)，以帮助用Earn1104I酶消化，并在克隆在pDual质粒的同一位置。使用标准DNA克隆程序(Sambrook，J.,E.F.Fritsch,etal.1989.Mo/ecw/orC7ow'"g..爿/"Zw。^yA^mwo/.ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,NY)，进行合成基因的克隆、克隆的测序，以确认克隆入pDual载体之后的基因序列。下面给出了表达质粒的描述。1.1SPbc2重组酶表达质粒:遵照Stratagene(LaJolla,CA)推荐的程序，将合成的DNA序列(SEQIDNO:l)克隆入pDual表达载体的Earn1104I限制性位点，该合成的DNA序列(SEQIDNO:l)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并且编码枯草芽孢杆菌噬菌体SPpc2的位点特异性DNA重组酶yokA(SEQIDNO:2，Genbank登录号T12765，Lazarevic,V.,A.Dusterhoft，etal.1999，Nucleotidesequenceofthe5fl"'〃mssm&船temperatebacteriophageSP卩c2.Microbiology145:1055-67)。1.2SF370.1重组酶表达质粒:遵照Stratagene(LaJolla，CA)推荐的程序，将合成DNA序歹iJ(SEQIDNO:3)克隆入pDual表达载体的Earn1104I限制性位点，该合成的DNA序列(SEQIDNO:3)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并且编码化脓性链球菌噬菌体SF370.1的推定重组酶(SEQIDNO:4,Genbank登录号T12765,Canchaya,C,F.Desiere,etal.2002，GenomeanalysisofaninducibleprophageandprophageremnantsintegratedintheStreptococcuspyogenesstrainSF370.Virology302:245-58)。1.3Bxbl重组酶表达质粒:遵照Stratagene(LaJolla，CA)推荐的程序，将合成的DNA序列(SEQIDNO:5)克隆入pDual表达载体的Earn1104I限制性位点，该合成的DNA序列(SEQIDNO:5)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并且编码耻垢分枝杆菌噬菌体Bxbl的推定重组酶(SEQIDNO:6，Genbank登录号AAG59740,Mediavilla，J.,S.Jain,etal.2000,GenomeorganizationandcharacterizationofmycobacteriophageBxbl.Mol.Microbiol38:955-70)。1.4A118重组酶表达质粒:遵照Stratagene(LaJolla,CA)推荐的程序，将合成的DNA序列(SEQIDNO:7)克隆入pDual表达载体的Earn1104I限制性位点，该合成的DNA序列(SEQIDNO:7)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并且编码单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体A118的推定重组酶(SEQIDNO:8，Genbank登录号CAB53817,Loessner,M.J.,R.B.Inman,etal.2000,Completenucleotidesequence,molecularanalysisandgenomestructureofbacteriophageA118ofListeriamonocytogenes:implicationsforphageevolution.Mol.Microbiol35:324-40)。1.5O)Rvl重组酶表达质粒:遵照Stratagene(LaJolla，CA)推荐的程序，将合成的DNA序列(SEQIDNO:9)克隆入pDual表达载体的Earn1104I限制性位点，该合成的DNA序列(SEQIDNO:9)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并且编码结核分枝杆菌噬菌体ORvl的推定重组酶(SEQIDNO:10，Genbank登录号CAB09083,Bibb,L.A.andG.F.HatfUll2002,IntegrationandexcisionoftheMycobacteriumtuberculosisprophage-likeelement,phiRvl.Mol.Microbiol45:1515-26)。1.6A118重组酶植物表达质粒:将合成的DNA序列(SEQIDNO:7)克隆入植物表达质粒pILTAB358的木薯叶脉花叶病毒启动子NOS和终止子序列之间，该合成的DNA序列(SEQIDNO:7)的密码子经优化以用于动物细胞表达，并编码单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体AU8的推定重组酶(Verdaguer，B.,A.Kochkoetal.1998,Functionalorganizationofthecassavaveinmosaicvirus(CsVMV)promoter.PlantMol.Biol.37:1055-67)。pILTAB质粒DNA获自DonaldDanforthCenterforPlantResearch,St.Louis,MO。除了CMV启动子和SV40终止子分别用木薯叶脉花叶病毒启动子和35S终止子替换外，构建物与在动物细胞中使用的A118表达质粒类似。分子内重组试验质粒的设计和构建为了测定重组酶在哺乳动物和植物细胞中的活性，开发出瞬时试验。简而言之，该试验由以下组成将重组酶基因克隆入表达质粒，制备相应的分子内重组试验质粒，通过转染将两质粒DNA引入细胞，并分析荧光素酶的活性。重组酶试验质粒包含CMV启动子一""P:STOP:加B—荧光素酶报道基因—终止子序歹廿。STOP序列是转录终止信号序列。在重组不存在时，荧光素酶报道基因的表达被在启动子和报道基因之间存在的STOP基因阻止。由于引入的重组酶所引起的""P和a/氾位点之间的重组，导致STOP序列的删除和报道基因的活化。因为它是由关闭到开启的形式，该试验是灵敏且强大的，并且通过用发光计检测荧光素酶发出的光，荧光素酶报道蛋白的数量可以容易地分析。图1中用图描述了试验形式。瞬时转染和荧光素酶试验在37°C，5%C02，将细胞维持在DMEM或所示的其他培养基中，其中DMEM补充以10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(获自Invitrogen，Carlsbad,CA)。在转染的那天，根据使用的细胞类型，细胞以不同的密度铺板。根据制造商的说明书(Invitrogen,Carlsbad,CA)，使用Lipofectamine2000，细胞单独用分子内重组试验质粒或用分子内重组试验质粒和变化数量的重组酶表达质粒DNA转染。组成型表达的&w'〃。荧光素酶报道质粒(pRL-CMV，来自Promega，Madison,WI)进行双转染(2ng/孔)，并用作内部对照以使数据标准化(归一化)。在转染之后24或48小时(取决于细胞系)，弃除培养基，细胞用被动裂解缓冲液(passivelysisbuffer)(Promega，Madison,WI)裂解。然后在装配有注射器(DynexTechnologies,Chantilly,VA)的板式读数器(platereader)上，使用双荧光素酶分析试剂盒(DualLuciferaseAssaykit)(Promega,Madison,WI)，分析提取物。显示的数据是荧光素酶(乙1!(0和/^"///0荧光素酶(111^(0活性的比率，除非另外指出。当Luc活性(相对光单位)被比较时，观察到类似的结果(数据未显示)。因为重复的数量和实验随不同的构建物和细胞系而变化，标准误差被用于指示实验差异。2.1在人HEK293细胞中的瞬时分子内重组试验细胞(20，000细胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子内重组试验质粒和0、10、25或75ng相应的重组酶质粒转染，并温育24小时。细胞用50pl被动裂解缓冲液裂解，并分析25nl提取物。进行6至20次重复试验，对Luc/RLuc的比率(平均值)±SE作图。图2中显示在竖条之上的值是诱导倍数(foldinductions)(重组酶质粒存在下的荧光素酶活性与重组酶质粒不存在下的荧光素酶活性的比率)。如图2所示，仅仅用分子内重组试验质粒进行的转染显示没有或极少的荧光素酶活性(作为Luc/RLuc的比率给出)。增加数量的A118重组酶表达质粒(10、25或75ng)和Al18分子内重组试验质粒的转染增加荧光素酶活性。对于SF370.1、SP卩c2、(DRV1和Bxbl，也观察到类似的结果。这些结果清楚地表明重组酶在人HEK293细胞中发挥功能。重组酶介导它们的a"P和W氾位点之间的重组，并删除分子内重组试验质粒上的STOP序列，激活荧光素酶基因的表达。2.2在小鼠NIH3T3细胞中的瞬时分子内重组试验细胞(5,000细胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子内重组试验质粒和0、10、25或75ng相应的重组酶表达质粒转染，并温育24小时。细胞用50pl被动裂解缓冲液裂解，并分析25^提取物。进行2至14次重复试验，对Luc/RLuc的比率(平均值)iSE作图。图3中显示在竖条之上的值是诱导倍数。图3显示了单独用分子内重组试验质粒或用分子内重组试验质粒和增加数量的(IO、25或75ng)重组酶表达质粒转染NIH3T3获得的数据。重组酶质粒和分子内重组试验质粒的共转染将荧光素酶活性增加许多倍。例如，当与用25ngBxbl分子内重组试验质粒单独转染相比，用25ngBxbl分子内重组试验质粒和75ngBxbl重组酶表达质粒进行的转染增加荧光素酶活性66倍。与Bxbl类似，重组酶A118、SF370.1、SP|3c2和0RV1也增加荧光素酶活性(图3)，显示了这些重组酶在小鼠NIH3T3细胞中具有功能，并且对于重组它们的fl"P和fl/氾位点是有效的。2.3在中国仓鼠卵(CHO)细胞中的瞬时分子内重组试验细胞(15，000细胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子内重组试验质粒和0、10、25或75ng相应的重组酶表达质粒转染，并温育24小时。细胞用50pl被动裂解缓冲液裂解，并分析25nl提取物。进行2至8次重复试验，对Luc/RLuc的比率(平均值)士SE作图。图4中显示在竖条之上的值是诱导倍数。如图4所示，仅仅用A1181、SF370.1或ORV1的分子内重组试验质粒进行的转染显示没有或极少的荧光素酶活性。与增加数量的相应的A118、SF370.或0RV1重组酶表达质粒的共转染增加荧光素酶活性。这些结果清楚地表明重组酶在CHO细胞中发挥功能。重组酶介导它们的"/伊和"/氾位点之间的重组，并删除分子内重组试验质粒上的STOP序列，激活荧光素酶基因的表达。2.4在人HeLa细胞中的瞬时分子内重组试验细胞(15,000细胞/孔，在96-孔板中)用25ng分子内重组试验质粒和0、10、25或75ng相应的重组酶表达质粒转染，并温育24小时。进行2至8次重复试验，对Luc/RLuc的比率(平均值)士SE作图。图5中显示在竖条之上的值是诱导倍数。如图5所示，仅仅用A1181、SF370.1或(DRV1的分子内重组试验质粒进行的转染显示没有或极少的荧光素酶活性。与增加数量的相应的A118、SF370.1或(DRV1重组酶表达质粒的共转染增加荧光素酶活性。这些结果清楚地表明重组酶在HeLa细胞中发挥功能。2.5在大鼠骨髓基质细胞中的瞬时分子内重组试验在转染前一天，来自大鼠的初级骨髓基质细胞以4000细胞/cm2的密度铺板，并培养在培养基中，所述培养基含有50%基本培养基a培养基((iMEM)、50%F12Hams、10%FBS、1%Pen/Strep(100U/ml青霉素G和100mg/ml硫酸链霉素)。细胞用25ng分子内重组试验质粒和0、50、100或200ng相应的重组酶质粒转化，并温育48小时。细胞用50pl被动裂解缓冲液裂解，并分析25^1提取物。进行8次重复试验，对Luc/RLuc的比率(平均值)士SE作图。图6中显示在竖条之上的值是诱导倍数。图6显示了单独用分子内重组试验质粒或用分子内重组试验质粒和增加数量的(50、100或200ng)相应的重组酶表达质粒转染大鼠骨髓基质细胞获得的数据。分子内重组试验质粒和重组酶质粒的共转染将荧光素酶活性增加许多倍。例如，当与用25ngBxbl分子内重组试验质粒单独转染相比，用25ngBxbl分子内重组试验质粒和200ngBxbl重组酶表达质粒进行的转染增加荧光素酶活性501倍。与BxM类似，重组酶A118、SF370.1、SP^c2和0RV1也增加荧光素酶活性(图6),显示了这些重组酶在大鼠骨髓基质细胞中具有功能，并且对于重组它们的fl"P和加氾位点是有效的。2.6在小鼠神经千细胞中的瞬时分子内重组试验小鼠神经干细胞C17.2(mNSCs)获自Dr.EvanSnyderofTheBurnhamResearchInstitute,LaJolla，CA，并使用推荐的方案维持(Ryder,E.F.,E.Y.Snyder,etal.1990.Establishmentandcharacterizationofmultipotentneuralcelllinesusingretrovirusvector-mediatedoncogenetransfer.J.Neurobiol.，21:356-75)。在转染—ilj一天分开细胞，并以120,000细胞/孔的密度铺48-孔板。过夜温育之后，培养基用无血清培养基替换。根据制造商的说明书(Invitrogen,Carlsbad，CA)，使用Lipofectamine2000，细胞单独用50ng分子内重组试验质粒或用50ng分子内重组试验质粒和0、25、50、100或200ng重组酶表达质粒DNA转染。组成型表达的iem'/Za荧光素酶报道质粒(pRL-CMV，来自Promega，Madison,Wl)进行双转染(4ng/孔)，用作内部对照，以使数据标准化(归一化)。在转染之后2天，弃除培养基，细胞用75pl被动裂解缓冲液(Promega,Madison，WI)裂解。然后在装配有注射器(DynexTechnologies,Chan仙y,VA)的板式读数器上，使用双荧光素酶分析试剂盒(DualLuciferaseAssaykit)(Promega，Madison，WI)，分析提取物(50nl)的荧光素酶活性和iem7/o荧光素酶活性。图7中显示的数据是荧光素酶(Luc)和Wew7/fl荧光素酶(RLuc)活性的比率，它是每次处理4个转染的平均值。误差条代表标准误差。类似于在HEK293、NIH3T3、CHO、HeLa和大鼠骨髓基质细胞中观察到的结果，重组酶A118、SF370.KSPpc2、ORV1和Bxbl在mNSCs中具有功能，并增加荧光素酶活性(图7)。增加数量的(25、50、100或200ng)重组酶表达质粒与相应的分子内重组试验质粒(50ng)的共转染产生较高的荧光素酶活性，诱导倍数在72-5349范围内。2.7在烟草BY2细胞中的瞬时分子内重组试验烟草(7Wco"a"tfto6acwm)BY2的细胞悬浮培养物在黑暗中维持在MS培养基中，并传代培养数周(Nagata，T.,T.Nemoto，andS.Hasezawa.1992.TobaccoBY-2celllineastheHelacellinthecellbiologyofhigherplants.Intl.Rev.Cytol.，132:1-30)。将从培养3天的培养物制备而得的原生质体悬浮在0.4M甘露醇中，并分配入35mm皮氏培养皿中，于lmL等分试样中(5x105细胞)。将原生质体与质粒DNA混合，并使用携带Petripulser电极的方波电穿孔系统(BTX,SanDiego，CA，USA)，以0.56K伏特电穿孔80p秒。细胞用10吗分子内重组试验质粒和0或10pg重组酶表达质粒转染。电穿孔之后，原生质体用lmL2x原生质体培养基稀释(Watanabe，Y.，T.Meshi,andY.Okada.1987.InfectionoftobaccoprotoplastswithinvitrotranscribedtobaccomosaicvirusRNAusinganimprovedelectroporationmethod.Virology,192:264-272)，等分为1mL培养物，并在27'C温育17小时。通过冷冻融化并加入250pL5x被动裂解缓冲液(Promega,Madison,WI，USA)，使原生质体裂解。在装配有注射器的板式读数器上，使用双荧光素酶分析试剂盒(DualLuciferaseAssaykit),分析20pL细胞提取物的荧光素酶活性。图8显示的数据是由荧光素酶引起的相对光单位。所示的值是22个重复的平均值，并且误差条是标准误差。如图8所示，仅仅用A118分子内重组植物试验质粒转染BY2细胞显示没有或极少的荧光素酶活性。与A118重组酶植物表达质粒的共转染导致荧光素酶活性增加364倍。数据清楚地表明重组酶在植物细胞中重组a"P和o/氾位点。实施例3:含有加P或抓B序列的质粒DNA稳定整合入含有加B或加P位点的HEK293染色体在两步过程中完成对质粒DNA在染色体fl"P或加氾位点上的整合的分析。在第一步骤中，产生含有每一酶的单拷贝flttP或加氾位点的稳定细胞系，并鉴定。在第二步骤中，在重组酶表达质粒存在下，将含有fl"P或W氾位点的质粒分别整合在染色体a"B或ci"P。在染色体中产生具有加P或加氾序列的稳定HEK293克隆遵照制造商推荐的程序，在获自Invitrogen[Carlsbad,CA(目录编号R750-07)]的Flp-In-293细胞中，将每一重组酶的单拷贝加P或加B序列(SEQID号11、13-21)引入FRT位置。在Flp-InTM-293细胞中，FRT位置具有CMV启动子、Flp重组酶的FRT整合位点和zeocin抗性以及|3-半乳糖苷酶融合基因。这些细胞在zeocin抗生素存在下生长，并表达p-半乳糖苷酶标记基因。在CMC启动子和BGH终止子序列之间存在的多克隆位点区域，每一酶的加/P或加/B序列被克隆入pcDNA/FRT质粒(Invitrogen,Carlsbad，CA,目录编号V6010-20)。在潮霉素基因之前，pcDNA/FRT克隆质粒具有FRT位点。潮霉素基因缺少启动子和ATG起始密码子。因此，将含有加fP或W氾位点的pcDNA/FRT质粒转染入哺乳动物细胞中不会赋予潮霉素抗性。只有在用Flp重组酶表达质粒(pCG44，Invitrogen,Carlsbad,CA)共转染之后，pcDNA/FRT质粒的整合发生在Flp-In-293细胞的FRT位置。整合导致获得潮霉素抗性，失去zeocin抗性和p-半乳糖苷酶表达。该程序如图9所图示。将含有加P或加B的pcDNA/FRT质粒DNA整合入Flp-In-293细胞，并针对每一a"P或加氾位点，在含有潮霉素的培养基上选择克隆系。如所期望地，这些细胞丧失p-半乳糖苷酶活性并对zeocin敏感。在FRT位置含有或aB序列的pcDNA/FRT质粒的存在也得到PCR证头'(图10)。在PCR分析中，通过使用结合""P或加氾的引物，和结合相邻FRT位置序列的另一引物，我们检测flWP或W/B序列在基因组FRT位置上的整合。因此，只有如果加/P或fl/氾位点被整合入染色体，克隆将是PCR阳性的。如所期望地，选择的克隆系对于加/P或^氾是阳性的。对于每一测试的重组酶，PCR没有扩增分离自Flp-InTM-293细胞的基因组DNA的特定带(图10中，图面C，泳道P)，但是扩增了分离自整合有含W/P或a"B的pcDNA/FRT质粒的细胞的DNA的带(图10中，图面C，泳道I)。携带加P或位点的稳定的293细胞被用于分别整合含有或""P位点的质粒。将质粒DNA整合在染色体flfaP或加氾位点通过将每一重组酶的加/P或加/B序列置于紧靠嘌呤霉素抗性基因之前，构建整合试验质粒。在质粒中，嘌呤霉素基因没有自己的启动子。然而，染色体上的fl,/P和整合试验质粒上的a"B(或染色体上的加B和试验质粒上的加P)之间的重组将嘌呤霉素基因整合至CMV启动子旁边，CMV启动子存在于紧靠上面产生的Flp-In-293细胞中的fl"P或加/B位点之前(图9)。整合将导致嘌呤霉素基因表达，并导致这样的细胞在嘌呤霉素抗生素存在下生长。并不期望试验质粒的随机整合提供对嘌呤霉素的抗性。使用标准方案，含有序列的Flp-InTM-293稳定细胞系，用含有a/氾位点的整合试验质粒转染，用或不用相应的重组酶表达质粒。在另一例子中，产生具有稳定整合的加/B序列的Flp-InTM-293稳定细胞系，并用于整合含aP的整合试验质粒。含染色体"rtP或W氾位点的Flp-In-293细胞(l50,000至300,000个细胞)用100ng整合试验质粒和400ng重组酶表达质粒转染。然后在含有嘌呤霉素抗生素的培养基上选择细胞。如果重组酶有功能，那么含有加氾序列的质粒倍期望整合在染色体的加fP位点上，或反之亦然。在3个独立的实验中，在用含有加/P-或加氾-的整合试验质粒和相应的重组酶表达质粒共转染之后，从含有加氾或flrtP位点的Flp-In-293细胞获得的大量嘌呤霉素抗性克隆显示在下表1和3中。在缺少重组酶质粒时，没有观察到嘌呤霉素抗性克隆。这些结果清楚地显示，重组酶促进染色体fl"P或a"B位点和质粒或aWP位点之间的重组，导致质粒DNA整合入染色体。通过从嘌呤霉素抗性克隆分离染色体DNA,我们也确认质粒整合，并检测染色体上a"L和加/R位点的存在。加B和加P之间的重组导致产生W/L和位点，其是fl"B和"/P之间的杂合位点。使用fl"L或加R特定引物的PCR扩增仅在试验质粒整合之后的嘌呤霉素抗性克隆中扩增期望的特定带(图10，图面A和图面B的泳道I)，但是在含有flWP或W氾的、用于整合的亲本细胞中没有扩增(图10，图面A和图面B的泳道P)。表1.含有""P的质粒整合入携带a/氾位点的染色体中<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表2:含有加B的质粒整合入携带加P位点的染色体中<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>实施例4:侧翼是加/P和加/B位点的染色体DNA的删除在两歩过程中，完成对位于染色体上的加P:STOP:加B序列的删除的分析。在第一步骤中，对于每一重组酶，产生含有单拷贝的CMV启动子-flrtP:STOP:加氾-荧光素酶基因-终止子构建物的稳定细胞系，并鉴定。在第二步骤中，重组酶表达质粒瞬吋转染入携带CMV启动子-加/P:STOP:加氾-荧光素酶基因-终止子的稳定细胞，并分析细胞的荧光素酶活性。如果重酶在哺乳动物中具有活性，那么染色体aP和W氾位点之间的重组将导致STOP序列的删除，以及荧光素酶表达的激活。试验形式用图形描述在图11中。在染色体中具有CMV启动子-fl"P:STOP:加氾-荧光素酶基因构建物的稳定HEK293克隆的产生将单拷贝的CMV启动子-加P:STOP:a"B-荧光素酶基因-终止子构建物导入Flp-InTM-293细胞的FRT位置，FIp-In-293细胞从Invitrogen,Carlsbad,CA(目录编号R750-07)得到，如上所述。将在瞬时分子内重组试验质粒(参见分子内重组试验质粒的设计和构建和图I)中存在的每一重组酶的加P:STOP:加B-荧光素酶基因序列，克隆入pcDNA/FRT质粒(Invitrogen,Carlsbad,CA,目录编号V6010-20)的多克隆位点区域上，该多克隆位点区域存在于CMV启动子和BGH终止子序列之间。使用FIp重组酶，将携带CMV启动子-加P:STOP:加氾-荧光素酶基因-终止子的、构建的pcDNA/FRT质粒，插入Flp-InTM-293细胞的FRT位置。该质粒的整合导致获得潮霉素抗性和失去zeocin抗性和P-半乳糖苷酶表达。Flp-In-293细胞用含有CMV启动子-加P:STOP:加氾-荧光素酶基因-终止子的pcDNA/FRT质粒以及Flp表达质粒(pCG44,Invitrogen，Carlsbad,CA)转染。选择并扩大对潮霉素有抗性的克隆(图11)。通过分析根据P-半乳糖苷酶活性而选择的克隆，也确认pCDNA/FRT的插入。选择的克隆丧失p-半乳糖苷酶活性。分离的克隆被用于使用重组酶表达质粒进行的转染。在稳定的细胞系中，STOP序列从染色体删除以及荧光素酶的活化在第二歩中，含有针对每一重组酶的CMV启动子-flZ/P:STOP:a"B-荧光素酶基因-终止子构建物的潮霉素抗性细胞用相应的重组酶表达质粒瞬时转染。细胞(15000细胞/孔，96-孔形式)用0、25、50、100或200ng重组酶表达质粒转染，并温育24小时。细胞用50pl被动裂解缓冲液裂解，并分析25W提取物。进行16次重复试验，对荧光素酶活性(相对光单位的平均值)±SE作图。如图12所示，增加数量的(O、25、50、100或200ng)每一重组酶表达质粒转染入其含有a"P:STOP:a"B的相应Flp-InTM-293克隆，增加了荧光素酶活性。这些结果显示，重组酶能够重组置于染色体上的aWP和加氾序列。重组导致侧翼是和W氾位点的序列的删除和荧光素酶基因的活化。实施例5:在HEK293细胞的染色体假附着位点上DNA整合通过用重组酶表达质粒和含有加P或加B位点和潮霉素抗性基因的相应的寻靶质粒共转染细胞，并在含有潮霉素抗生素的培养基上选择稳定的细胞，对含加P或加B重组位点的质粒在HEK293细胞中存在的天然假加B或假加P位点上的插入或整合进行分析。程序在图13中用图描述。在37°C,5%C02,将HEK293细胞维持在DMEM中，所述DMEM补充以10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素(获自Invitrogen,Carlsbad,CA)。在转染的那天，细胞以每个35mm皮氏培养皿750,000个细胞的密度铺板。根据制造商的说明书(Invi加gen,Carlsbad,CA)，使用Lipofectamine2000，细胞用50ng的含有加P或加B位点和泛蛋白C启动子-驱动的潮霉素抗性基因的寻靶质粒(图13)单独转染，或与4吗重组酶表达质粒一起转染。质粒的染色体整合将导致潮霉素基因的表达以及此细胞在潮霉素存在下生长。应该注意，寻耙质粒的随机整合(即在非-假位置)也能够导致潮霉素抗性克隆的产生。然而，当目标质粒与重组酶表达质粒一起导入细胞时，如果基因组含有假附着位点，潮霉素抗性HEK293克隆的数量有望较高。还有，例如，如果整合是由于基因组上的假flB位点和寻靶质粒上的""P位点之间的整合所致，那么寻靶质粒上的flP位点被精确地切除，并且质粒被插入基因组的假位点，导致产生假加L和假c/"R位点，它们能够被回收质粒(rescuedplasmid)的DNA测序鉴定。相反，随机整合通常在整合之后保持完整的W/P位点。根据本领域常见的程序，收集在重组酶表达质粒存在下获得的潮霉素抗性HEK293克隆，制备基因组DNA制备物，并用在整合的质粒外(即在pUCori和细菌选择标记基因之外)切除的限制性酶消化，消化的DNA自我连接，将连接的DNA转化入大肠杆菌，以回收含有相邻基因组DNA的整合的质粒(Thyagarajan，B.etal.(2001)Site-specificgenomicintegrationinmammaliancellsmediatedbyphageOC31integrase.Mol.Cell.Biol.21:3926-3934)。在40总体积中，在37'C，从潮霉素抗性克隆制备的基因组DNA(lO昭)用限制性酶BglII、Xbal、Eco01091、BanII、Styl、3soBI或Btgl消化3小时。在4'C，20的每一消化物在200总体积中连接过夜，然后纯化。通过电穿孔，将连接的DNA导入大肠杆菌，然后在含有抗生素的平板上选择氨苄青霉素抗性大肠杆菌克隆。从细菌克隆制备质粒DNA，然后对回收的质粒DNA测序。使用BLAST程序在Genbank,NIHLibraryofMedicine上(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，通过将回收的基因组序列与人基因组序列比对，用于鉴定回收的基因组DNA序列的染色体位置。当含有SF370.1或SP(k2重组酶的加/P位点的假位点寻靶质粒被导入HEK293细胞时，分别获得9和0个潮霉素抗性克隆(表3)。相反，寻靶质粒DNA与各自的SF370.1或SPPc2重组酶表达质粒一起共导入HEK293细胞时，在每一情况下获得100个以上的潮霉素抗性克隆(表3)。这些结果清楚地表明，在染色体假"r氾位点上的、重组酶介导的整合是高效的，在假位点上的整合比寻靶质粒的随机整合(即在重组酶不存在时的整合)高许多倍。从用SF370.1重组酶获得的、收集的潮霉素-抗性HEK293克隆分离基因组DNA,从基因组回收质粒，并通过对上述100个质粒DNA测序，鉴定假flrtB序列。测序的100个回收的质粒之中；有41个不同的假W氾位点，因为在一些假位点上有比其他假位点更多的整合。例如，100个回收的整合中的35个整合在单个位点上。该假W位点的核苷酸序列在图14中给出。这些结果表明，与其他位点相比，SF370.1重组酶优选地在该位点整合质粒DNA。表3:含加P的质粒整合入HEK293染色体假加B位点<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>[00226在使用SPPc2重组酶靶向含SPpc2加P的质粒之后，对获得的潮霉素抗性HEK293克隆作类似的分析，并对109个回收的质粒DNA测序。序列分析显示，107个整合中的105个在假a//B位点上，2个整合在随即位点上。在回收的105个整合位点中，有54个不同的假W/B整合位点。15个整合位点发生在一个假位点序列上，如图14所示。这些结果显示，使用我们发现的酶，人和真核染色体在假位点上充当精确的位点特异性整合的有效目标。这些位点形成用于整合的天然发生的目标，这可以用于许多生物技术和医学应用中。权利要求1.在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞；将所述第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，从而在所述重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一和第二重组位点之间的重组，所述第一重组位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，所述第二重组位点是attB或attP，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)噬菌体重组酶、化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)噬菌体重组酶、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，所述第二重组附着位点是attP；当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。2.在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞；将所述第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，从而在所述重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一和第二重组位点之间的重组，所述第一重组位点是""P或aB，所述第二重组位点是假附着位点，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻坭分枝杆菌噬菌体重组酶。3.权利要求1或2的方法，其中所述重组酶多肽选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP卩c2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。4.权利要求1或2的方法，其中所述编码重组酶的多核苷酸可操纵性地连接至启动子，所述启动子介导所述多核苷酸在所述真核细胞中的表达。5.权利要求1或2的方法，其中，通过编码所述重组酶多肽的多核苷酸的表达，所述重组酶多肽被导入所述真核细胞中。6.权利要求1或2的方法，其中所述重组酶多肽作为多肽被导入所述真核细胞中。7.权利要求1或2的方法，其中，借助编码所述重组酶多肽的信使RNA，所述重组酶多肽被导入所述真核细胞中。8.权利要求1或2的方法，其中所述位点特异性重组产生DNA的整合、删除、倒位、易位或交换。9.获得具有稳定整合的多核苷酸序列的真核细胞方法，所述方法包括将多核苷酸导入包含第一重组W氾或flP位点的真核细胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列和第二重组或""B位点；将所述第一和所述第二重组位点与原核重组酶多肽接触，其中所述重组酶多肽可以介导所述第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，并且所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当所述第一重组位点是W氾时，所述第二重组位点是flWP;当所述第一重组位点是a"P时，所述第二重组位点是加/B。10.获得具有稳定整合的多核苷酸序列的真核细胞方法，所述方法包括将多核苷酸导入包含第一重组假附着位点的真核细胞，其中所述多核苷酸包含核酸序列和第二重组W/P或加出位点；将所述第一重组位点和所述第二重组位点与原核重组酶多肽接触，其中所述重组酶多肽可以介导所述第一重组位点和所述第二重组位点之间的位点特异性重组，并且所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶。11.权利要求9或10的方法，其中所述重组酶多肽选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP(3c2重组酶、$Rvl重组酶和Bxbl重组酶。12.权利要求9或10的方法，其中所述编码重组酶的多核苷酸可操纵性地连接至启动子，所述启动子介导所述多核苷酸在所述真核细胞中的表达。13.权利要求9或10的方法，其中，通过编码所述重组酶多肽的多核苷酸的表达，所述重组酶多肽被导入所述真核细胞中。14.权利要求9或10的方法，其中所述重组酶多肽作为多肽被导入所述真核细胞中。15.权利要求9或10的方法，其中，通过编码所述重组酶多肽的RNA的表达，所述重组酶多肽被导入所述真核细胞中。16.在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点的真核细胞，具有侧翼为第三重组位点和第四重组位点的多核苷酸序列；将所述重组位点与原核重组酶多肽接触，从而在所述重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一和第三重组位点以及所述第二和第四重组位点之间的重组，所述第一和第二重组位点是""P或fl"B，所述第三和第四重组位点是W氾或加ZP，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当所述第一和第二重组附着位点是W氾时，所述第三和第四重组附着位点是fl//P，当所述第一和第二重组附着位点是""P时，所述第三和第四重组附着位点是加氾。17.权利要求16的方法，其中所述重组酶多肽选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPpc2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。18.权利要求16的方法，其中，所述重组酶多肽，通过编码所述重组酶多肽的多核苷酸的表达而被导入所述真核细胞中。19.权利要求16的方法，其中所述重组酶多肽作为多肽被导入所述真核细胞中。20.权利要求16的方法，其中，所述重组酶多肽，通过编码所述重组酶多肽的信使RNA而被导入所述真核细胞中。21.在真核细胞中获得多个位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组位点和第二重组位点以及第三重组位点和第四重组位点的真核细胞；将所述第一重组位点和第二重组位点与第一原核重组酶多肽接触，将所述第三和第四重组位点与第二原核重组酶多肽接触；产生在所述第一和第二重组位点之间的重组以及所述第三和第四重组位点之间的重组，其中所述第一重组酶多肽能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的重组，所述第二重组酶多肽能够介导所述第三重组位点和第四重组位点之间的重组，所述第一和第二重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是所述第一重组酶多肽和所述第二重组酶多肽是不同的。22.权利要求21的方法，还包括第五重组位点和第六重组位点以及第三重组酶多肽，其中所述第三重组酶多肽能够介导所述第五和第六重组位点之间的重组，条件是所述第三重组酶多肽与所述第一和所述第二重组酶多肽是不同的。23.进行位点特异性重组的方法，所述方法包括提供第一重组位点和第二重组位点；将所述第一重组位点和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，导致在所述重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一重组位点和第二重组位点之间的重组，所述第一重组位点是加fP或a"B，所述第二重组位点是""B或flwp，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻街分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当所述第一重组附着位点是fl"B时，所述第二重组附着位点是a"P，当所述第一重组附着位点是时，所述第二重组附着位点是24.载体，用于将多核苷酸序列位点特异性地整合入分离的真核细胞的基因组，所述载体包括感兴趣的多核苷酸和第二重组"/氾或加*位点，其中所述第二重组"//8或fl"P位点包括与处于所述分离的真核细胞基因组中的第一重组或加氾位点或假fl"P或假"/氾位点进行重组的多核苷酸序列，并且所述重组在位点特异性重组酶存在下发生，所述位点特异性重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当所述第一重组位点是W/B或假加B时，所述第二重组位点是抓P，当所述第一重组位点是抓P或假加P时，所述第二重组位点是加出。25.权利要求24的载体，其中所述重组酶选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SPpc2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。26.权利要求24的载体，其中所述感兴趣的多核苷酸可操纵性地连接至启动子，所述启动子介导所述多核苷酸在所述真核细胞中的表达。27.真核细胞，包括原核重组酶多肽或编码原核重组酶的核酸，其中所述重组酶能够介导第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，所述第二重组位点可以充当与所述第一重组位点进行重组的底物，以及其中所述第一重组位点是敏P、假加P、加氾或假加B，所述第二重组位点是ar/B、假fl"B、a"P或假加P，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当所述第一重组位点是加氾时，所述第二重组位点是W/P或假aP;当所述第一重组位点是假flB时，所述第二重组位点是a"P;当所述第一重组位点是aWP时，所述第二重组位点是""B或假加氾；当第一重组位点是假aWP时，所述第二重组位点是加氾。28.权利要求27的真核细胞，其中所述重组酶多肽选自A118重组酶、SF370.1重组酶、SP卩c2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。29.将感兴趣的多核苷酸位点特异性地整合入转基因对象的基因组中的方法，其中所述基因组包含第一重组加氾或加P位点或假W氾或假fl"P位点，所述方法包括引入包含感兴趣的多核苷酸和第二重组flWP或fl"B位点的核酸；将所述第一和所述第二重组位点与原核重组酶多肽接触，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一重组位点和第二重组位点之间的位点特异性重组，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组位点是a"B或假加氾时，所述第二重组位点是a"P，当所述第一重组位点是W/P或假W/P时，所述第二重组位点是加/B。30.权利要求29所述的方法，其中所述重组酶多肽选自A118重组酶、SF370.I重组酶、SPpc2重组酶、(J)Rvl重组酶和Bxbl重组酶。31.分离的多核苷酸序列，包括与选自下列的核酸序列具有至少90%同一性的核酸SEQBDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9，其中所述核酸具有重组酶活性。32.分离的多核苷酸序列，包括选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7和SEQIDNO:9的核酸序列。33.分离的多核苷酸序列，包括与选自下列的核酸序列具有至少90%同一性的核酸SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21。34.分离的多核苷酸序列，包括选自SEQEDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21的核酸序列。35.分离的多核苷酸序列，包括选自下述的核酸序列a)编码SPPc2重组酶的核酸序列；b)编码SF370.1重组酶的核酸序列；c)编码Bxbl重组酶的核酸序列；d)编码A118重组酶的核酸序列；和e)编码4)Rvl重组酶的核酸序列。全文摘要本发明提供了在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；将所述第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在所述重组附着位点之间产生重组，其中重组酶多肽能够介导第一和第二重组附着位点之间的重组，所述第一重组附着位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，所述第二重组位点是attB或attP，所述重组酶选自单核细胞增生李斯特氏菌噬菌体重组酶、化脓性链球菌噬菌体重组酶、枯草芽孢杆菌噬菌体重组酶、结核分枝杆菌噬菌体重组酶和耻垢分枝杆菌噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，第二重组附着位点是attP；当第一重组附着位点attP时，第二重组附着位点是attB。本发明也描述了用于产生转基因细胞、组织、植物和动物的组合物、载体和其使用方法。本发明的组合物、载体和方法也可用于基因治疗用途。文档编号C12N15/85GK101194018SQ200580047369公开日2008年6月4日申请日期2005年2月8日优先权日2005年2月2日发明者M·帕迪达姆申请人:英特拉克森公司