抗菌肽及其使用方法

专利名称：：抗菌肽及其使用方法抗菌肽及其使用方法参照相关专利申请0001本申请要求于2004年12月15日提交的美国临时申请第60/636，220号的利益，所述临时申请被整体并入到本发明的内容中，而不与本发明矛盾。联邦政府资助研发的声明本发明获得了政府通过国家健康研究所提供的NIH基金第R01GM61855和R01A148717的支持。政府对本发明也享有部分权利。发明背景在临床上过量地使用传统抗生素己经引起许多医学上相关抗药性菌种的产生(1，2)。然而，在过去的四十年中，只有三种在结构上创新的抗生素被投入到临床实践中(恶唑垸酮类的利奈唑胺、链霉杀阳菌素和脂肽-达托霉素)，因此研发新类型抗生素具有重要意义。阳离子抗菌肽可以代表一类新型的抗生素(3-5)，虽然阳离子抗菌肽的作用模式还没有被确定，但是所有的阳离子两亲性抗菌肽都会与细胞膜相互作用，并且已经提出，细胞膜是某些抗菌肽的主要靶点，抗菌肽分子在细胞膜上的聚集会导致通透性的增加并使细胞膜丧失其屏障功能(6,7)。因此，针对这些膜活性的抗菌肽产生抗药性是几乎不可能的，原因是产生这种抗药性需要对微生物细胞膜脂成分的实质性改变。oc-螺旋型和p-折叠型抗菌肽是最主要的两大类阳离子抗菌肽(3，4，8，9)。p-折叠型抗菌肽包括由分子内二硫键固定的环形多肽，例如防卫素(10)和保护素(11)，以及具有N末端到C末端的共价键的多肽，例如短杆菌肽S(12)和短杆菌酪肽(13)。与P-折叠型抗菌肽不同，a-螺旋型抗菌肽是更加线性的分子，其在水介质中以无序结构存在，但它们通过与疏水细胞膜相互作用，呈两亲螺旋状态，例如蛾血素(14),马加宁(15)和蜂毒肽(16)。关于这些多肽，我们已经探究了可能与抗菌活性相关的某些重要因素。公认的是，无论抗菌肽作用机理解释或假说最终如何修正，本发明的组合与方法依然有效、实用。对于一些a-螺旋型或(3-折叠型多肽，人们已经作了许多尝试以描绘其与抗真核细胞活性或毒性相应的特征以及与抗菌活性相应的特征。根据溶血活性所检测的，高两亲性(17-20)、高疏水性(17，20-22)及高螺旋性和p-型折叠结构(20，23，24)与高的毒性相关。相反，与溶血活性不同，抗菌活性对这些因素不那么依赖(17-21，23-25)。这里，可以通过三个途径增强对细菌的特异性(或者被定义为溶血性与抗菌活性的比值的治疗指数(Tl)):提高抗菌活性；降低溶血活性并保持抗菌活性；或者在增加抗菌活性的同时降低溶血活性。本发明的发明人发现了这类抗菌肽，其是基于控制改变a-螺旋型抗菌肽的疏水性/亲水性、两亲性及螺旋性，可以产生具有有用的或者增强的抗菌活性和特异性(例如提高的治疗指数)的肽的前提。这里的例子是抗菌肽衍生自26个氨基酸的抗菌肽序列的肽，其中所述26个氨基酸的序列为Ac-KWKSFLKTFKSAVKTVLHTALKISS-amide(V681，SEQIDN0:1).。"衍生于"或者"衍生物"的概念是指发明的抗菌肽在大小上与V则抗菌肽一样或者比V6^抗菌肽短，并且发明的抗菌肽具有一个或者多个氨基酸被取代，或者二者兼备；这里还描述了进一步的变化。抗菌肽化合物V6w被用作框架来研究通过在多肽序列的特定位置取代一个或几个氨基酸残基，而引起的多肽疏水性/亲水性及螺旋性的改变，对抗菌肽生物活性的影响，例如，对抗菌活性和溶血活性的影响。这些取代位点包括位于两亲螺旋分子极性面和非极性面的中心或者近中心的位点，以及其它位点。拔蘑淑ggj被公在一个实施方式中，本发明提供了涉及从SEQIDNO:2，414和1625以及这里所公开的(例如实施例中所公开的)其它肽所组成的组的抗菌肽的组合物和方法。注意，SEQIDNO:1，即肽V681，与SEQIDNO:3和15多肽为同一序列。表1中包含在非极性面X-13的位点上与在极性面X-11的位点上具有取代的肽。参见表2包含其它肽类似物。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在优选的实施方式中，所述分子(肽)在疏水环境中呈螺旋结构。我们己经利用圆二色谱CD监测了抗菌肽分子在50。/o三氟乙醇中的a-螺旋结构，50%三氟乙醇是对细胞膜疏水环境的模拟。在一个实施方式中，成功的抗菌肽是具有期望的生物学活性的螺旋类似物，通过圆二色谱CD检测，该抗菌肽在温和环境(非变性介质，如含有100mM氯化钾，PH7的50mM磷酸缓冲液，)中具有很少的a-螺旋结构的螺旋。在一个实施方式中，该结构特征对许多可能的机理中的一种或者多种机理有重要性，例如a)降低在温和环境中形成二聚体的能力(根据这里所描述的进行检测的)；b)允许抗菌肽分子更容易穿过细胞壁到达微生物的细胞膜。并且，在温和环境中对a-螺旋结构的破坏，仍然可以允许带正电的抗菌肽被吸引到微生物的带负电的细胞壁上(如脂多糖)，然而，特定结构的缺少可以降低细胞壁表面对抗菌肽的亲和作用，从而允许抗菌肽更易于通过细胞壁，进入到细胞膜的疏水与亲水的中间区域，在该区域抗菌肽与膜表面呈平行状态。在膜内，抗菌肽可以被细胞膜的疏水环境诱导成a-螺旋结构。由于此a-螺旋结构，我们猜测抗菌肽的非极性面可以和细胞膜的疏水部分相互作用，而其极性面上的极性基团和带正电的基团可以和细胞膜表面上磷脂带负电的基团相互作用。这里，氨基酸后面的下标字母D代表该氨基酸是D-型氨基酸；与此相同的，下标L代表该氨基酸是L-型氨基酸。在抗菌肽名称中，大写母D-(非下标)表示除特指位点外，该抗菌肽全部由D-型氨基酸所组成(例如D-NA^代表该抗菌肽除了含有非极性表面中心的L-丙氨酸取代之外全部由D-型氨酸所组成，非极性表面用大写字母N代表)。表中被框起来的氨基酸残基表示在非极性表面的中心13号位点上的不同取代序列(见图1)。本实施方案中的抗菌肽对革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌均具有广谱抗菌活性。关于革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌的具体描述详见参考文献MedicalMicrobiology(1991),第3版，由SamuelBaron编辑，ChurchillLivingstone,NewYork。对抗菌肽敏感的细菌包括但不限于大肠杆菌(Esc/7en'c/7/aco//)、鼠伤寒沙门氏菌(Sa/more〃afypAj/mtv〃'"m)、绿脓杆菌(Psetvafomo/iasae/i/g/'nosa)、金黄色葡萄球菌(Step/7y/ococcusat/厂eus)、表皮葡萄球菌(Sfaphy/ococct/sep/ctem7/d/s)、枯草杆菌(8ac///wsswM//s)、粪肠球菌(￡/7teracocct/sfeeca//s)、干燥棒状杆菌(Co/ynebacteriumxeras/s)和炭疽杆菌(8ac/7/usanfhrac/'s)。本发明的抗菌肽对上述革兰氏阳性及阴性细菌的抗菌活性己经被证实，因为在本领域中熟知这些细菌被认为是革兰氏阳性及阴性细菌的模式生物，因此对这些模型细菌的生物活性可以被认为是对整个革兰氏阳性及阴性细菌家族的生物活性。本发明的抗菌肽可以作为杀菌试剂或者抑菌试剂用来阻止传染、杀死微生物或者抑制微生物生长及其它功能，并因此可以有效治疗或者控制由这些微生物引起的感染或者造成的污染。同时，这些抗菌肽也可以做为治疗药物或者其他活性的药物组合物，适合人类、牲畜、农业及药业使用，其包括本发明的抗菌肽中的一种或者多种以及药物上可以烤受的载体。这些药物组合物可以根据本领域中己知的，进行配制和给药例如口服、注射或外用给药应用以控制和/或抑制包括革兰氏阳性及阴性细菌的宽范围微生物的感染。在本发明的实施方式中，这里所描述的这些抗菌肽的体外抗菌活力可以精确代表其体内的抗菌活力。药物组合物可以包含一种或更多种有治疗效用的抗菌肽及相应适当的载体。抗菌肽的治疗效用可以按本领域熟知的方法进行测定。例如，抗菌肽的使用量会根据感染的严重性、患者的年龄、身高、体重、感染的菌种和给药的途径等而变化。本发明涉及包含杀菌有效量的一种或者多种本发明的抗菌肽以及药物上可以接受的载体的组合物。这些组合物也可以包含表面活性剂。在抗菌肽成分中添加表面活性剂有助于增强抗菌肽的抗菌效用。虽然可以使用任何适当的表面活性剂，但目前优选的表面活性剂包括非离子表面活性剂Tween20或者1。/。NP40。这些抗菌药用成分可以按不同剂型进行使用，如表皮及静脉注射、口服或者外用。本发明中的抗菌肽在这些组合物中按重量可以占到由0.0001%~50%。在一个实施方式中，用本发明的抗菌肽阻止细菌生长的方法还可以包括利用这些抗菌肽与其它抗菌试剂(例如传统抗生素)进行联合治疗或者协同治疗。这样所给药的抗菌肽的量通常依赖于细菌对抗菌肽的敏感度，诸如该细菌是革兰氏阴性还是革兰氏阳性，这对于本领域技术人员来说是容易分辨的。在一个实施方式中，本发明还提供了一种组合物，其包含有效杀微生物量的抗菌肽以及适当的载体。这类组合物可以以多种方式用于消灭微生物，例如本领域中熟知的家庭或实验室的使用载体的制剂。在一个实施方式中，抗菌肽序列KWKSFLKTFK旦AbKTVLHTALKAISS(SEQIDN0:40)，其中旦和b指L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸及D-赖氨酸。在一个实施方式中，该抗菌肽不包括SEQIDN0:1。在一个实施方式中，本发明提供了这里所描述的多肽组合物，其含有多肽的片段；其中该片段的长度为至少大约14个氨基酸的连续片段、至少大约17个氨基酸的连续片段、至少大约20个氨基酸的连续片段、至少大约23个氨基酸的连续片段、至少大约24个氨基酸的连续片段或至少大约25个氨基酸长度的连续片段。在一个实施方式中，本发明提供了一种多肽组合物，其中所述组合物与这里所描述的多肽序列有至少大约70%的相似性、大约80%的相似性、大约90%的相似性或大约95%的相似性。在一个实施方式中，本发明提供了编码所述多肽的核酸序列。在一个实施方式中，本发明的肽不包括下列多肽序列中的一种或者多种SEQIDNO:1，SEQIDNO:3，SEQIDNO:15及SEQIDNO:26。在一个具体的实施方式中，本发明的多肽不包括SEQIDNO:1多肽。如果这些多肽被用作抗菌药物的话，则它们可以被配制在缓冲水介质中，该水介质含有各种盐和缓冲液。这些盐的离子包括但不限于卤化物、磷酸化合物和硫酸化合物，例如氯化纳、氯化钾或硫酸钠。可以用的不同缓冲液包括柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、HEPES、Tris或者任何能够被治疗患者的生理条件接受的缓冲液。如果这些肽被配制为冻干粉的形式，则可以使用不同的辅料及添加剂，用于溶液中的后继应用。辅料可以包括各种多醇、惰性粉末及其它添冲剂。本文所使用的"治疗有效的"是指在可选用的药学上可以接受的载体中的药剂、组合物或试剂的量，即可以使被治疗患者或动物症状好转的充分剂量。"好转"是指在治疗中降低或减轻患病状态所带来的负面效应。在一个实施方式中，抗菌肽被给药给需要治疗的患者。用于给药的药物上可以接受的载体制剂包括灭菌的水溶液、非水溶液、悬浮液、乳化液。常用的非水溶剂是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油)、注射用有机酯(如油酸乙酯)。水质载体包括水、醇水溶液、乳化液或者悬浮液如盐水或缓冲液。注射用载体包括氯化纳溶液、Ringer右旋糖、右旋糖和氯化纳、乳酸盐化的Ringer油或不挥发性的油。活性治疗成分通常与药用辅料共同使用并与其它活性成分相匹配。合适的辅料包括水、盐水、右旋糖、甘油和乙醇或者是几种物质的混合物。静脉注射介质包括流质和营养补充剂、电解补充剂，例如常用的Ringer葡萄糖溶液等。也可含有防腐剂和其它添加剂，例如抗氧化剂、螯合剂或者惰性气体等。抗菌肽的实用剂量、配方或成分根据不同患者的身高、体重、年龄和健康状况的情况而定，本领域技术人员可以使用描述确定临床剂量的方法和技术的下列教导以及其他已知的现有技术来确定应用的适当剂量(SpikerB.，GuidetoClinicalStudiesandDevelopingProtocols,RavenPress,Ltd.,NewYork,1984，pp.7-13,54-60;SpikerB.,GuidetoClinicalTrials,RavenPress,Ltd.,NewYork1991,pp.93-101;C.Craig,andR.Stitzel,eds.，ModernPharmacology,2ded.,Little,BrownandCo.,Boston,1986,pp.127-133;T.Speight,ed,,Avery'sDrugTreatment:PrinciplesandPracticeofClinicalPharmacologyandTherapeutics,3ded.,WilliamsandWilkins,Baltimore,1987,pp.50-56;R.Tallarida,R.RaffaandP.McGonigle,PrinciplesinGeneralPharmacology,Springer-Verlag，newYork,1988,pp.18-20)。在另一个实施方式中，本发明可以做为食品保鲜剂或者用来处理食品以控制、降低或消除潜在的致病微生物及污染物。本发明中的抗菌肽也可以用来作为消毒剂与其它灭菌产品一起使用。在一个实施方式中，应用本发明抗菌肽的治疗至少部分控制感染和污染。在一个实施方式中，也可以将抗菌肽加入或者分散到不期望微生物生长或者出现病毒的材料中、设备上或者对象上(例如在可及表面上)来阻止细菌生长与存活，以作为通过为设备或对象施加杀菌或抑菌有效量的肽而杀菌或抑制细菌生长的方法。在一个实施方式中，这些设备和对象包括但不限于亚麻布、布料、塑料或乳胶纤维、天然橡胶、可移植设备、物体表面及贮藏设备。在一个实施方式中，本发明提供了一种在物体表面消毒的方法，该方法包括为所述表面施加有效量的组合物的步骤，其中所述组合物包含至少一种本发明的抗菌肽。在一个实施方式中，本发明提供了消毒液，其包含本发明的至少一种抗菌肽，以及可以选择的可接受载体。图1表明在本研究中使用的主体多肽Vew(SEQIDN0:1)的氨基酸序列及螺旋轮和螺旋网的图形。被框起来的氨基酸残基位于螺旋的极性/亲水表面，被圈起来的氨基酸残基位于非极性/疏水表面。在螺旋轮中，疏水表面用空心的弓形表示，亲水表面用实心的弓形表示。取代位点是位于亲水表面的11号位点和疏水表面的13号位点(用三角形表示)。在多肽序列中，XL和Xo分别指L-型和D-型的取代氨基酸。P指亲水表面，N指疏水表面。Ac指N端乙酰化amide指C端酰胺化。氨基酸残基用单字母编码表示。图3表示在PH7.4，5'C，包含100mMKCI的50mM磷酸缓冲液的条件下抗菌肽V训，D-V681(图3A)和抗菌肽D-NKd，NKL(图3B)及抗菌妝NAd，D-NAl(图3C)的圆二色谱(CD)图谱。在图中，实心符号代表抗菌肽在不含三氟乙醇水溶液中的圆二色谱CD图谱，空心符号代表含有50。/。三氟乙醇溶液中的图谱，使用的符号有圆圈代表L-型多肽V6W，NKl和NAd;菱形代表D-型多肽，D-V681,D-NKD，D-NAl。图4表示抗菌肽V6w温度变性的圆二色谱CD图谱。图4A表示在疏水介质中由5。C到80'C的温度范围内V6w螺旋构象的变化。实验在含有50o/o的三氟乙醇的0.05。/。三氟乙酸溶液(pH2)中进行。不同温度下的圆二色谱CD图谱以不同的线形代表；图4B:表示抗菌肽V6W温度变性中的圆二色谱CD稳定性曲线。图5表示抗菌肽V68,及其类似物的反相高效液相色谱温度曲线。实验条件高效液相色谱反相柱，narrowboreSB—C8柱(150X2.1mm内径；5pm粒径；300A孔径)，A-B线性洗脱梯度为1。/。乙腈/min，洗脱速度为0.25ml/min。其中，A流动相为含有0.05%三氟乙酸的水，B流动相为含有0.05X三氟乙酸的乙腈。在5。C至U80。C的温度变化范围内，每升温3。C收集一次实验数据。图中空心标识表示L-型氨基酸取代后的Vew温度变化曲线(图5A表示极性面取代多肽，图5C表示非极性面的取代的多肽)；实心标识表示D-型氨基酸取代后的抗菌肽V6w温度变化曲线(图5B表示极性面取代抗菌肽，图5D表示非极性面的取代的抗菌肽)。在所有图中，抗菌肽V6w的位点取代，无论是极性面还是非极性面上，氨基酸都采用如下标识圆圈代表Val,方块代表Leu，菱形代表Ala，三角代表Ser，反相三角代表Lys，叉(X)代表Gly。无序结构肽C1作为对照，用加号(+)表示。图6表示多肽V6w及其类似物的反相高效液相色谱温度曲线的校正曲线。温度曲线都以无序结构肽C1的保留行为为标准进行校正。分析柱和实验条件见图4。抗菌肽的保留行为都通过如下公式来进行校正抗菌肽(fRt-fRS)-无序结构肽C1(fRt-fR5)。W表示抗菌肽或者无序结构肽C1在特定温度条件下的保留时间；^s表示5。C条件下的保留时间。空心标识表示L型氨基酸取代后的抗菌肽V6w温度变化曲线(图6A表示极性面取代多肽，图6C表示非极性面的取代的多肽)；实心标识表示D型氨基酸取代后的抗菌肽V6w温度变化曲线(图6B表示极性面取代多肽，图6D表示非极性面的取代的多肽)。在所有图中，多肽Vew的取代位点，无论是极性面还是非极性面上，氨基酸都采用如下标识圆圈代表Val，方块代表Leu，菱形代表Ala，三角代表Ser，反相三角代表Lys，叉(X)代表Gly。0052]图7代表更多的采用不同的方法产生的抗菌肽类似物:取代位点，取代特性，多位点取代，序列截短或者重组。图7A表示特定的多肽序列，图7B表示非极性面上氨基酸残基的序列重组，图7C表示极性面上氨基酸残基的序列重组。图8表示抗菌肽的保留行为随着反相高效液相色谱温度升高的变化。实验条件如下反相高效液相色谱，narrowboreSB—C8柱(150X2.1mm内径；5[jm粒径；300A孔径)，A-B线性洗脱梯度为0.5。/。乙腈每分钟，洗脱速度为0.35毫升每分钟。其中，A流动相为含有0.2X三氟乙酸的水，B流动相为含有0.2X三氟乙酸的乙腈。图8A表示多肽的保留时间随着温度改变的变化。图8B表示通过公式fet-feS校正以后的抗菌肽的保留时间，W表示多肽或者无序结构肽C1在特定温度条件下的保留时间；fR5表示5。C条件下的保留时间。图8C表示通过公式多肽(fRt-feS)-无序结构肽C1(fRt-fR5)校正以后的多肽的保留时间。在所有图中，都采用如下标识圆圈表示Vew和D-V6M，菱形表示NAd和D-NAl，方块表示NKL和D-NKD,三角表示无序结构肽C。图11表示多肽NK^及其不同亮氨酸取代的类似物的非极性面螺旋网状图。非极性面上的疏水氨基酸残基用框来表示。取代的亮氨酸残基为红色，其中参与/'—/+3和/—/'+4疏水作用的亮氨酸为黄色。通过/—/'+3和/—/'+4疏水作用用黑色条带表示，图中数字表示非极性面上疏水相互作用的数目。氨基酸用单字母简称表示。图13表示抗菌肽V6w和V13KL的空间填充模型。位于螺旋的非极性面上的疏水氨基酸为绿色；位于螺旋的极性面上的亲水氨基酸为灰色；多肽骨架为白色。位于螺旋的非极性面上的13位点的取代赖氨酸(V13KD为蓝色。模型图片采用PyMOL0.98版本制作。发明详述总体来说，这里使用的术语和短语都有它们在本领域中被认可的含义，这可以通过引用标准教科书、杂志文献及本领域技术人员知道的知识而被发现。提供下面的定义以澄清它们在本发明中的具体应用。这里所使用的术语"氨基酸"是指任何自然或非自然的氨基酸，无论是自然的还是人工合成的，其包括任何L-型和D-型的。该术语也包含在多肽类似物或类肽中所使用的氨基酸类似物。该术语还包括被修饰的、非自然的氨基酸、或合成的氨基酸衍生物，如二氨基丁酸和二氨基丙酸等。本发明的抗菌肽是由以肽键连接的氨基酸构成的。在疏水条件下，抗菌肽一般呈a-螺旋构象。抗菌肽的序列一般是按照从氨基端到羧基端。除非特别提出，氨基酸是L-型氨基酸，当多肽全部由L-型氨基酸所组成称为L-对映异构体。当多肽全部由D-型氨基酸所组成称为D-对映异构体。术语"最低溶血浓度"(MHC)是指抗菌药物或抗菌肽在一定条件下造成血细胞溶血所需的最低浓度。MHC可以利用包括人血红细胞(hRBC)在内的不同种族的血红细胞(RBC)来测定。术语"抗微生物活性"是指本发明的多肽改变目标微生物的功能或生理过程的能力，例如部分影响微生物的复制、赘生物的生长、毒素的产生、存活、休眠状态的生活力或其它属性。在实施方式中，本发明中这个定义是指抑制微生物生长。在具体的实施方式中，抗微生物活力是指本发明中的多肽杀死至少一种细菌的能力。在具体的实施方式中，所述细菌是从由革兰氏阳性或阴性细菌所组成的组中选出的。在实施方式中，该术语可以本发明中该术语可以表示为杀死微生物或者抵制微生物的生长。[C)068]短语"增强生物特性"是指按照本发明所描述的方法或者其它常规实验方法操作的，实验抗菌肽与对照抗菌肽(如Vew)相比较展现出具有低的溶血活性伴随/或者高的抗菌活性，或者高的抗菌活性伴随/或者低的溶血活性。一般来说，抗菌肽的"增强生物特性"反应在"治疗指数"(Tl)中，其治疗指数较对照抗菌肽为高。术语"微生物"宽泛地指细菌、真菌、病毒和原生动物。特别的，该术语可以指具有脂双层结构的细胞或结构组分的微生物。在具体的实施方式中，所述膜是细胞膜。通常包括本领域中已知的病原菌、真菌、病毒和原生动物。细菌包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌及柔膜细菌家族如支原菌属(Mycop/asA7a)和无胆甾原体属(Ac/70tep/asma)的种类。一些可能敏感的革兰氏阳性细菌的具体例子包括但不限于大肠杆菌(Eschen'c/7/aco//)、绿脓杆菌(Pseuctomonasaerugr/'nosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Sa/moAe〃a)、嗜血杆菌(〃emop/7/7usZn/Zwenza)、奈瑟菌(A/e/'sse〃'a)、霍乱弧菌(V/'b〃'oc/7o/erae)、副溶血性弧菌(V7Jb〃'opara/aemo/yf/'ct/s)和幽门螺旋杆菌(We//co/acterpy/on')。可能敏感的革兰氏阳性细菌的例子包括但不限于金黄色葡萄球菌(Stephy/ococcwsai/rews)、表皮葡萄球菌(Step/7y/ococct/sep/oterm/s)、无乳链球菌(Step/7y/ococcusasfa/acf/ae)、A组链球菌、酿脓链球菌(Sfreptococo/spyogenes)、粪肠球菌(Enteracoccusfaeca//s)、B组革兰氏阳性链球菌、干燥棒状杆菌(Co/yAebacter/iy/T7xeras/s)和单核细胞增多性李司氏菌(Uster/amonocytogenes)。可能敏感的真菌的例子包括酵母如白色念珠菌(Cancf/'c(aa/b/cans)。可能敏感的病毒的例子包括麻疹病毒，单纯疱疹病毒(HSV-l和HSV-2)、疱疹家族成员(HIV)、丙型肝炎病毒、带状疱疹病毒、绵羊髓鞘脱落病毒、细胞巨化病毒。敏感的原生动物包括贾第虫属(G&WZa)。"治疗有效的"是指在药学上可以接受的载体中的制剂、组合物或试剂或者生理上可以接受的活性化合物的盐的量，即是指可以使被治疗患者、动物、物质或客体的不良状态好转的足够剂量。"好转"是指在接受治疗的过程中，降低或减轻病症所带来的负面效应或者降低感染。本发明中的抗菌肽自身具有抗菌活性，或者当它们以共价键或以其它方式偶联或者结合其它分子(例如聚乙二醇或载体蛋白如牛血清白蛋白)时具有抗菌活性，只要抗菌肽能够接触靶微生物细胞的表面，它们依然具有抗菌活性。在不破坏或大规模改变抗菌活性的前提下，依据本领域中己知的方法可以对抗菌肽分子进行修饰，只要其抗菌活性不被破坏或者基本上不受到破坏。由于大多数多肽类似物是由在V681的极性或非极性表面利用单一氨基酸取代得来的，多肽可能分为两大类，N-多肽(非极性表面取代)和P-多肽(极性表面取代)。每个多肽均用它的取代氨基酸来命名，例如，在V681非极性表面带有L-亮氨基酸取代的多肽叫Nk。值得注意的是，由于在非极性表面的L-缬氨酸与极性表面的L-丝氨酸是Vew原有的氨基酸(图1)，多肽NVL和PSL与V681事实上是同一多肽。在利用高效液相色谱反相柱温度监控来衡量多肽聚合能力时，一个呈无序结构的多肽(多肽C)被作为对照多肽。如前期研究所示(29)，这个序列为乙酰-ELEKGGLEGEKGGKELEK-酰胺(SEQIDNO:26)的18个残基多肽，即使在低温5℃和强α-螺旋诱导剂5%三氟乙醇(TFE)存在的条件下，依然呈无序结构([e]222=-3,950)。为了测定不同环境下的多肽二级结构，我们在近生理PH和离子长度条件下(100mMKCI的50mM磷酸缓冲液pH7)及含有50%三氟乙醇的溶液来模拟细胞膜的疏水环境的条件下对多肽类似物进行圆二色谱(CD)的测定。天然多肽Vsw不含50。/。三氟乙醇的缓冲液环境中呈现较低的oc-螺旋构象，而在50。/。三氟乙醇的环境中呈现很高的螺旋构象，艮P[e]222由-12，900变化到50%丁「￡中的-27，300,代表着cc-螺旋成分由45%增加至94%(表3)。表3中，在温和条件下，D-型氨基酸取代的肽通常比L-异构体的oc-螺旋度低得多。正如我们模型多肽的前期研究所示(26)，D-型多肽可以忽略的二级结构的特性所表现出的极少量螺旋结构反映了单一D-型氨基酸取代的螺旋破坏特性。在非极性表面，原有的L-缬氨基酸对维持cx-螺旋结构极为重要。用疏水性较低的氨基酸(L-Ala，Gly，L-Ser和L-Lys)来取代L-Val显著降低了ot-螺旋结构(NVl,的问222数值为-12,900而NSL,NKl,NG和NAL的数值为-1,300至-3,450)(表3)。即使利用L-Ala，20种氨基酸中具有a-螺旋倾向性最高的氨基酸(34)来取代也无法稳定a-螺旋结构。这表明维持非极性表面的疏水性对于维持cc-螺旋结构至关重要。相反，在非极性表面用疏水性更强的氨基酸来取代(用L-Leu取代L-Val)可以大幅度增加oc-螺旋结构([e222由NVl的-12，900增至限[_的-20,600)。值得注意的是，在非极性表面，温和缓冲液中L-多肽的螺旋程度与取代氨基酸的疏水性有关，即NLL>NVL>NAL>NSL，NKL又一次证实了非极性表面的疏水性对于保持a-螺旋结构的重要性。在非极性表面，由于它们的螺旋破坏性，在温和介质中D-Val和D-Leu取代多肽的螺旋结构比它们的L-对映体多肽有大幅度降低，然而，在非极性表面，无论用D-或L-氨基酸进行取代，在含有50y。TFE条件可诱导出很强的螺旋结构，呈现膜的疏水性和ot螺旋诱导性(表3)。从表3，很清楚的，尽管D-氨基酸取代的多肽在50XTFE中被强烈诱导成螺旋结构，但它们的螺旋性仍然较其L-对映体为低，这表明即使在疏水环境中D-氨基酸与它们的L-对映体相比，依然对a-螺旋结构有破坏作用。表3多肽V681类似物的圆二色谱数据_温和条件b50%三氟乙醇V[9]222%螺旋率°[8]222%螺旋率°[B]222%螺旋率°222%螺旋率°-20,60071-7，35025-28,25098-25，75089Nyf-12,90045-2,80010-27'30094-26，00090NA-3,45012-2,85010-28，950100-24，60085NS-1,3004-1,7006-27,55095-22，20077NK-1,4505-2,0007-26,25091-23'60082NG-2,2508-24,35084PL-10，85037-2,95010-28，55099-26,10090PA-13,60047-3,05011-27'60095-27，30094-PSr-12,90045-2,80010-27,30094-26,00090PV-7,55026-2,4008-23,05080-20，80072PK-5，95021-2，5009-27,35094-27，80096PG-4,5501690a.多肽根据5。C相对于亲本类似物V681的疏水性排序。N表示非极性表面；P代表极性表面(图1)。b.主要氨基酸残基摩尔椭圆率，222,(deg.cm2.draol-1),25。C在温和缓冲液(lOOmMKC1,50mMP04pH7.0)中于220nm波长处测量。c.多肽的螺旋含量(百分数)表示多肽类似物与NAL在50%三氟乙醇中的摩尔椭圆率的相对比值。d.主要氨基酸残基摩尔椭圆率，[8]222,(deg.cm2.dmol-l),25。C在以三氟乙醇(TFE)1:1(v/v)稀释的温和缓冲液中于222nm波长处测量。e.XL和XD分别表示L-和D-氨基酸取代。f.NVL和PSL与亲本肽V681为同一种物质。222是-20,600)不同于P1^([e]222是-10,850)，表明Leu在非极性表面可以稳定a-螺旋结构而在极性表面则破坏螺旋结构。同样地，Val在极性表面也会破坏螺旋结构；另一方面，与其它氨基酸取代相比，Ala和Ser在非极性表面破坏螺旋结构，而在极性表面取代时稳定a-螺旋结构。综上所述，虽然Ala在所有氨基酸中具有最高的a-螺旋倾向性(34)，它的高螺旋倾向性也无法满足非极性表面对疏水的需求([e]222对于多肽NA^为-3,450而对于Nk为-20,600);而在极性表面，多肽PAt在温和环境中相对于PI^表现出强螺旋结构([6]222対PLl为-13,600，対于PLl为-10，850)(表3)。值得注意的是，在极性表面Val和Leu的取代在降低螺旋两亲性的同时增强了疏水性；然而，与原有PSl相比螺旋含量较低，表明对于增加螺旋含量而言有一个两亲性与疏水性的平衡。与非极性表面的取代相似，在温和介质中，所有极性表面的D-氨基酸取代物均破坏螺旋的稳定性；然而，添加50。/。TFE可以诱导产生高螺旋性。如表3所示，非极性表面取代物较极性表面类似物在温和条件的摩尔椭圆度值上表现出更大的范围，这表明非极性表面上的氨基酸残基的螺旋对于多肽的二级结构比极性表面上的氨基酸残基扮演更重要的角色。意料之中的是，由于Gly的低a-螺旋倾向性(34)，无论在极性或非极性表面它均破坏a-螺旋结构。为了鉴定在不同环境中D-对映异构体的二级结构，我们在温和条件(100mMKCI，50mMKH2P04/K2HP04，pH7.4，叫做KP缓冲液)以及50%三氟乙醇(TFE)中(模拟细胞膜的疏水环境)中圆二色谱CD测定这些多肽类似物的圆二色谱CD。如图3所示，亲本多肽V训在KP缓冲液中只呈部分螺旋；多肽NKt和NAo分别由于在疏水表面引入亲水氨基酸L-赖氨酸和D-丙氨酸的螺旋破坏作用在KP缓冲液中呈现可以忽略的二级结构。然而，在含有50。/。TFE时，全部3个L-多肽均充分折叠成a-螺旋结构并显示出相似的摩尔椭圆度和螺旋性(表4)。意料之中的是，D-多肽图谱与L-多肽图谱呈完全镜像关系，其摩尔椭圆度也呈正负关系的相近数值(表4)。表4多肽类似物的生物物理数据<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>a.多肽序列见表1。b.将多肽按照其总的疏水性，即在pH2条件下，在5。C和80。C时，RP-HPLC中的保留时间(tR)的降低顺序进行排列。c.在5。C条件下，在222nra波长处通过圆二色谱分别测定在温和条件(IOO福KC1,50mMP04pH7.0)或含有50%三氟乙醇的温和缓冲液中的主要氨基酸残基摩尔椭圆率，222,(deg.cn^.draor')。摩尔椭圆率为负值表示左手螺旋，正值表示右手螺旋。d.多肽的螺旋含量(百分数)表示多肽类似物与N&在50%三氟乙醇中的摩尔椭圆率的相对比值eA表示在RP-HPLC温度曲线中，每种多肽的二聚常数。在温度变化范围内,.用最大的保留时间差值即((k'-tR5嫘旋肽)-(tR'-tR5对照组无序结构肽C))来表示，其中，(tn'-t^)表示多肽在特定温度W时与在5°C条件下的保留时间差.实施例1的实验方法。多肽的RP-HPLC分析一一采用安捷伦1100系列液相色谱进行多肽产物的分析(UttleFalls,DE)。实验条件如下Zorbax300SB-C8柱(150X2.1mm内径；5|jm粒径；300A孔径)，AB线性洗脱梯度(1。/。乙腈/min)，洗脱速度为0.25ml/min。其中，A流动相为含有0.05%TFA的水溶液，B流动相为含有0.05%TFA的乙腈。在5°C到80°C的温度变化范围内，每升温3。C收集一次实验数据。螺旋结构的表征一一利用JascoJ-720圆二色谱(CD)仪(Jasco，Easton，MD),在25°C温和条件下(50mMKHzPOVKzHPCVlOOmMKCI,pH7)，分别测定抗菌肽的平均残基摩尔椭圆度系数，和含有50%cc-螺旋诱导试剂2，2，2-三氟乙斷TFE)的溶液(50mMKH2PO4/K2HPO4/100mMKCL,pH7缓冲溶液/50。/。TFE)。将500nM的多肽类似物储存母液经过10倍稀释以后加入到0.02cm石英测试管中，通过190到250nm的扫描得到产物多肽的椭圆度系数。在222nm波长下测定得到的多肽的摩尔椭圆度系数被用于评估多肽的a-螺旋性。抗菌肽V681温度变性的CD研究一—将多肽V681溶解在pH2，含有0.05%TFA和50%TFE的水溶液中，然后加入到0.02cm石英管中分别在5，15，25，35，45，55，65和80。C温度条件下，从190到250nm进行扫描得到产物多肽的椭圆度系数。不同温度下的谱图被用于模拟多肽在反相高效液相色谱温度曲线分析中构象的改变。多肽在特定温200580047492.9说明书第47/59页度(t)和5°c时的摩尔椭圆度的比值即([et-[e]u)/([e]5-[e]u)相对于温度作图即可得到多肽的热变性曲线，其中，[e]5和[e]u分别表示多肽全折叠和完全变性状态下的摩尔椭圆度。[e]u表示多肽在8M尿素条件下测定的摩尔椭圆度，其值为1500degxm2.dmor1，代表一个完全无序结构(31)。转换温度(7"m)表示a—螺旋多肽具有50%的结构被变性时的温度，即u)/([e]5-[eu=o.5)，这被用于评价多肽的a—螺旋的稳定性。抗菌活性的测定一一最小抑菌浓度(MICs)是在含有10g/L胰蛋白胨和5g/L的酵母抽提液的无盐的LB(Luria-Bertani)介质中，通过一个标准的微量稀释方法测定的。主要实验方法简要如下，37。C条件下，细胞在LB培养基中生长过夜并用相同的培养基进行稀释。分别将10(VI不同浓度的多肽加入到微孔培养板中，随后加入10ti1细菌使其终浓度为5x105CFU/ml。培养板在37°C条件下培育24小时，MICs为抑制细菌生长的最低浓度。作为替代，最小抑菌浓度也可以通过另一种标准的微量稀释方法Mueller-Hinton(MH)介质中来实现。主要实验方法简要如下，37。C条件下，细胞在MH培养基中生长过夜并有相同的培养基进行稀释。分别将10(^1不同浓度的抗菌肽加入到微孔培养板中，随后加入1(^1细菌使其终浓度为1x105CFU/ml。培养板在37°C条件下培育24小时，最低抑菌浓度为抑制细菌生长的最低多肽浓度。但是，在检测临床分离的假单胞菌属绿脓杆菌时，最低抑菌浓度测定采用脑心浸液(BH1)来替代MH肉汤，此外，细菌的最终稀释浓度为1x106CFU/ml。治疗指数的计算(MHC/MIC比率)一一最低抑菌浓度和最低溶血浓度都是采用倍比稀释的办法测定的。因此，对于个别细菌和个别多肽的治疗指数会有所不同，治疗系数最大可能相差4倍；如果具有很弱的溶血活性或者没有溶血活性，治疗系数的变化主要来源于最低抑菌浓度的不同(最大达到2倍)。00143]蛋白酶水解稳定性的测定一一多肽的胰蛋白酶水解稳定性主要在摩尔比例为1:20，000(trypsin:肽-0.1ijM:2mM)条件下测定。反应体系为pH7.4的50mMNH4HC03。多肽和胰蛋白酶的混合物在在37°(:条件下进行保温。分别在0,5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，1,2,4，8小时的时间点取样，加入20%的三氟乙酸水溶液中止反应并用反相高效液相色谱对多肽的降解进行检测。实验条件如下Zorbax300SB-C8柱(150X2.1mm内径；5IJm粒径；300A孔径，安捷伦公司)，AB线性洗脱梯度为1%乙腈/分钟，洗脱速度为0.25ml/分钟。其中，A流动相为含有0.2W三氟乙酸的水，B流动相为含有0.2X三氟乙酸的乙腈。多肽的峰面积的变化用来监控随着时间的变化多肽的降解程度。实施例2.多肽的类似物及其不同位点的取代为了评价不同位点取代形成的多肽类似物的生物活性，我们使用多肽NKd乍为结构框架，用疏水的亮氨酸残基替代螺旋结构中非极性面上丙氨酸残基，来系统的改变多肽的疏水性。多肽序列见表13。表13.多欣NKl类似物的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>a.多肽序列采用氨基酸残基的单字母编码；Ac-表示N端乙酰化，而-amide代表Ca端酰胺化；在序列中，粗体的字母代表在N1^非极性表面取代的氨基酸(详细见表1)。图12代表亮氨酸取代的多肽类似物的螺旋网状图。由于三个Ala残基分别位于多肽V13Kl非扱性面上12，20和23号位点，因此在位点12、20和23得到三个单一Leu取代的多肽类似物Ala—Leu，两个双位点亮氨酸取代的多肽(A12L/A23L和A12L/A20L)以及一个三位点亮氨酸同时取代的多肽(A12L/A20L/A23L)被用来增强多肽的疏水性。在图12中，i—i+3和i—i+4位点之间的疏水相互作用用黑条带表示。图中清楚的显示，单一位点的亮氨酸取代多肽类似物，三种多肽中利用这些取代所产生的疏水作用数目顺序为A20l^A12I^A23L(分别表示9，8和6疏水性相互作用)；对于双取代亮氨酸残基形成的多肽类似物，A12L/A20L比A12UA23L具有更强的疏水相互作用("对应8疏水性相互作用)；多肽A12L/A20UA23L在i—i+3和i—i+4之间具有最高疏水相互作用数目(12疏水性相互作用)，所有的多肽类似物性质都与设想的一样。在本研究中，多肽用亮氨酸取代位点进行命名。对于Leu-取代的多肽，其溶血活性定义为最大浓度的肽与人红细胞接触，在37。C条件下培育18小时，没有发现溶血现象。它们的抗菌活性通过不同的临床分离的假单胞菌属绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa进行检测。绿脓杆菌Pseudomonas是一类自1990年以来对抗生素的抗药性越来越强的细菌，它同时产生蛋白水解酶，因此它对抗菌肽也有一定的抗性(58-60)。本研究中使用的绿脓杆菌菌株Pseudomonasaeruginosa对环丙沙星的敏感性差异较大(64倍的差异)(表14)。抗药性最强的绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa为CP204,—种从囊性纤维化病人身上临床分离出来的细菌，相反，它在本研究中对抗菌肽最为敏感。这证明抗菌肽的抗菌活性与抗生素的抗药性没有直接的关系。对6种绿脓杆菌的最低抑菌浓度的几何平均数见表14,用来对不同疏水性的抗菌肽的抗菌活性提供系统的评估。[Q0150]表14多妝NKl类似物的生物学活性_<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>a.表示相对于亲本肽NK^，多肽的溶血活性身高的倍数。溶血活性(作用18小时以后不导致溶血现象发生的最大多肽浓度)是通过人血红细胞测定的。b.MIC表示抑制6种临床分离的绿脓杆菌生长的最低多肽浓度。c.表示肽对6种绿脓杆菌的最低抑菌浓度几何平均值。d.表示相对于亲本肽NKL,多肽的抗菌活性(几何平均值)提高的倍数。e.不同绿脓杆菌对环丙沙星的相对感受性，数字1表示敏感性最强的品系多肽的疏水性对其生物活性的影响见图13。通常被接受的概念认为，随着两亲性的ot-螺旋肽非极性面疏水性的增加，其溶血活性和抗菌活性都随着升高(5-8)。在本研究中，清楚的表明多肽的疏水性与多肽的溶血活性相关，疏水性越强，其溶血活性也就越强，这是与以前的实验结果相符合的(53，64-66)。而抗菌活性的测试结果令人吃惊，多肽的疏水性对抗菌活性的影响主要表现在两个方面当疏水性处于低水平时，抗菌肽疏水性的增加会引起抗菌活性的升高直到达到一个最适的疏水性；在此之后，随着抗菌肽疏水性的进一步升高超过最适疏水性，多肽的抗菌活性开始显著的减弱，在本研究中，甚至出现完全丧失抗菌活性的现象如多肽A12L/A20L/A23L(SEQIDN0:7)(图12)。实施例3.各种不同带电氨基酸取代形成的多肽类似物不同的评定标准得到不同的数值。对本发明中的多肽，按照我们的评价标准，计算其疏水表面的氨基酸残基的疏水系数总和具有重要的意义，产生具有生物学活性的多肽表面的疏水性变化范围是大约176到大约224。表16.系数值_<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>按照我们的评价标准，NKiJ太极性表面上的疏水性数值可以用K1,K3，S4,K7,T6,K10，S11,K14,T15，H18,T19，K22，S25禾QS26的疏水值的总和来表示。产生的具有生物学活性的多肽的表面亲水性变化范围是大约-33到大约~48。实施例7.相似的单一疏水氨基酸取代形成的多肽类似物本发明中更多的多肽是通过单一位点相似的疏水性氨基酸残基的取代来形成的多肽类似物。采用具有类似疏水性侧链的氨基酸来进行单个疏水性氨基酸的取代通常会产生具有生物学活性的多肽。例如，表17中列出了在多肽NKl和NAd(分别为SEQIDN0:6和9)的非极性表面上可能被取代的每一个氨基酸残基。表17.单一位点取代的氨基酸残基<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>实施例8.NAd禾BD-NAL的多肽类似物提供了可以用来使多肽NAD和D-NAL的溶血活性随着其非极性表面上总的疏水性的降低，而进一步降低的更多的组合物和方法。见参考文献Kondejewski,L.H.，etal.2002,丄Biol.Chem.277:67-74。例如，V16被取代成为A16;或者L17被取代成为A17;或者同时将V16，L17替换成为A16,A17。在位点13上的取代同样可以使溶血活性随着疏水性的降低而降低。多肽的疏水性降低大致顺序为Nk>NVL>NAL>NG>NSL>'NKL，与之相关的溶血活性Oig/ml)降低，其中NLL(7.8),NVL(15.6),NAL(31.2)，NG(125),NSL(125)和NKL(未检测到活性)。我们己知，存在一个疏水性临界值，过分的降低多肽的疏水性会导致其抗菌生物活性的降低。关于所引入的文献和变更的声明然有个别引入的参考资料的个别部分与本申请不完全相符，但是本申请中所包含的参考资料，例如专利文件包括已发表的或已授权的专利或相对应的资料；专利申请公开物;及非专利文字材料或其它源材料；已经与本申请完整地整合成一个整体(例如，参考资料被引入本发明中，除了其与本申请不相符的个别部分未被本申请采用外)。参考资料中的附属部分以说明书或者附图的形式被引入到本申请中。这里使用的"包含"、"包括"、"被包含"、"包含中"等术语，它们应被解释成针对所述的特征、整体、步骤或组分的出现的详细说明，但不是排除存在或者加入一种或更多种的特征、整体、步骤、组分或组合。通过参考各种具体的优选的实施方式和技术，己经对本发明进行了描述。然而，需要理解的是，可以对本申请进行变更和修改，而保持本申请的精髓和范围。对于本领域技术人员清楚的是，除了在本发明中具体描述的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术以外，其它不同于这里具体描述的常规、广泛使用的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术在正常进行实验的前提下均可以应用到本发明中，而不需要借助额外的实验。本发明还将包含所有其它已知的、常规的组合物、方法、设备、设备部件、材料、步骤和技术。然而，如果本发明中声称包含了已存在的确定的内容和相关己经合法取得创新资格的内容，这并不是预期的；若有声明该内容被包含在我们发明范围之内，我们所指的发明范围并不包含这些内容。只要公开了一个范围，则其所有子范围和单个数值也均被包含在其中。本发明不局限于所述的实施方式，还包括但并不局限于以实例或说明形式出现在图形或详细说明中的全部内容。参考资料1，Neu,H.C.(1992)Sc/ence257,1064-10732.Travis,丄(1994)Sc,ence264,360-3623.Hancock,R.E.(1997)Lancef349,418-4224.Andreu,D.,andRivas，L(1998)8/'opo/>wers47，415-4335.Sitaram，N.,andNagaraj，R.(2002)Cty/rP/7am7Des8,727-7426.Hancock,R.E.,andLehrer,R.(1998)7>encteIB/'otecrtno/16,82-887.Duclohier，H.,Molle,G.,andSpach,G.(1989)B/0p/7ysJ56,1017-10218.van'tHof，W.，Veerman，E.C.，Helmerhorst,E.丄，andAmerongen，A.V.(2001)8/'o/C/7抓382,597-6199.Devine,D.A.,andHancock,R.E.(2002)CuArP/7am7Oes8,703-71410.Ganz,T.，andLehrer,R.I.(1994)CurrOp/'n/Anmtvno/6，584-58911.Steinberg,D.A.,Hurst,M.A.,Fujii,C.A.，Kung,A.H.,Ho,丄R，Cheng,F.C.,Loury,D.丄，andFiddes,丄C.(1997)>Anft>n/'crajb/\genteChemo仿er41，1738-174212.Khaled,M.A.,Urry,D.W.,Sugano,H,，Miyoshi,M,,andlzumiya,N.(1978)8/'oc/j抓/'sfry17,2490-249413.Mootz,H.D,,andMarahiel,M.A.(1997)J8acte〃'o/179，6843-685014.Christensen,B.，Fink,丄，Merrifield,R.B.,andMauzerall，D.(1988)PracA/afMcadSc.L/S/\85,5072-507615.Zasloff，M.(1987)Proc/VaW4caofScZ〃S/A84,5449-545316.Andreu,D.，Ubach,丄，Boman,A,,Wahlin,B.,Wade,D.，Merrifield,R.B.,andBoman,H.G.(1992)FaSS乙eft296，190-19417.Dathe，M.,Wieprecht,T"Nikolenko,H.,Handel,L,Maloy,W.L.,MacDonald，D.L.,Beyermann,M.,andBienert,M,(1997)F￡8SLeff403,208-21218.Blondelle，S.E.，andHoughten,R.A.(1992)S/oche/n/sf/y31,12688-1269419.Lee,D.L,andHodges,R.S.(2003)8/opo/ymers71,28-4820.Kondejewski,L.H.,Jelokhani-Niaraki,M.,Farmer,S.W.,Lix,B.，Kay,C.M.，Sykes，B.D.,Hancock,R.E.'andHodges,R.S.(1999)J8/0/Ch柳274,13181-1319221.Oren,乙，Hong,丄，andShai,Y.(1997)J8/0/CA7柳272,14643-1464922.Kondejewski,L.H.，Lee,D.L.，Jelokhani-Niaraki,M.，Farmer,S.W.,Hancock,R.E.,andHodges,R.S.(2002)J8/0/C/em277,67-7423.Shai，Y.,andOren,Z.(1996)J8/0/C/em271，7305-730824.Oren,Z.,andShai,Y.(1997)8/ocAe/n/sfry36,1826-183525.l_ee，D.L,Powers,丄P.,Pflegerl,K.,Vasil，M.L,Hancock,R.E.,andHodges,R.'S.(2004)JPepf尺es63,69-8426.Chen,Y.,Mant,C.T.,andHodges,R.S.(2002)JP印fRes59，18-3327.Zhang,L,Falla,T.,Wu,M.,Fidai，S.,Burian,丄，Kay,W.，andHancock,R.E.(1998)8/'och柳S/opftysResCommun247,674-68028.Zhang,L，Benz,R.,andHancock,R.E.(1999)8/oc/)柳/'s叶38,8102-811129.Mant，C.T.,Chen,Y.,andHodges,R.S.(2003)JC/)romatogrM1009，29-4330.Lee，D,L,Mant，C.T.,andHodges,R.S.(2003)J8/0/C/7em278,22918-2292731.Monera,O.D.,Sereda,T.丄，Zhou,N.E.，Kay,C.M.，andHodges,R.S.(1995)Jo訓a/ofpep她sc/ence1,319-32932.Eisenberg，D.,Weiss,R.M.，andTerwilliger，T.C.(1982)A/aftv/e299,371-37433.Carver,T.,andBleasby，A.(2003)B/'o/nfo/maf/'cs19,1837-184334.Zhou,N.E.，Monera,O.D.,Kay,C.M.,andHodges,R.S.(1994)PratedPepft'cteLeft1,114-11935.Mclnnes，C.,Kondejewski,LH.,Hodges,R.S.,andSykes，B.D.(2000)J8/0/Cftem275,14287-1429436.Mant，C.T.，Zhou,N.E,，andHodges,R.S.(1993)inT/7e/Amp/7/》a仿,.c〃e/,x(Epand,R.M.,ed)，pp.39-64,CRCPress,BocaRaton37.Mant,C.T.，andHodges,R.S.(2002)J0>romatogfr/\972,61-7538.Mant，C.T.,andHodges,R.S.(2002;JC/7ramatogfr/A972,45-6039.Zhou,N.E.，Mant,C.T.，andHodges,R.S.(1990)PepfRes3,8-2040.Blondelle，S.E,,Ostresh,丄M.，Houghten,R.A.,andPerez-Paya,E,(1995)8/op/7ysJ68,351-35941.Purcell,A.W.,Aguilar,M.I.,Wettenhall，R.E.，andHearn，M.T.(1995)PepfRes8,160-17042.Mant,C.T"Tripet,B.，andHodges,R.S.(2003)JChromatogr/\1009,45-5943.Mant,C.T.,andHodges,R.S.(eds)(1991)HP/_Cofpep〃ctesandprate/'ns,separator,sns/ys/s3ndconfom3ton,CRCPress,B0c3Raton,Fl_44.Shai,Y.(1999)8/.oc//'m8/op/7ys/\cte1462,55-7045.Ehrenstein，G.，andLecar，H.(1977)QRev8/op/7ys10，1-3446.Pouny,Y.，Rapaport,D.,Mor,A,,Nicolas,P.,andShai，Y.(1992)8Zoc/e/TH'sfAy31,12416-1242347.Salgado,丄，Grage，S.L,Kondejewski,LH.，Hodges,R.S.,McElhaney,R.N,，andUlrich，A.S.(2001)J8/omo/A/M尺21,191-20848.Uu，F.，Lewis,R.N.,Hodges，R.S.,andMcElhaney,R.N.(2004)S/'op/7ys/'ca/v/ot/ma/,inpress49.Liu，F.，Lewis,R.N.,Hodges,R.S,,andMcElhaney,R.N.(2004)SZocrtem/s^y43，3679-36850.Liu,F.,Lewis,R.N.，Hodges,R.S.，andMcElhaney,R.N.(2002)8/oc/柳/sfry41，9197-920751.Daum,G.(1985)8歸Zm8Z0p/7ysActe822,1-4252.Devaux，RF.,andSeigneuret,M.(1985)S/'och/Vr8/op/7ys/\cte822，63-12553.Chen,Y.,Mant，C.T.,Farmer,S.W.,Hancock,R.E.,Vasil,M丄.andHodges,R.S.(2005)Rationaldesignofalpha-helicalantimicrobialpeptideswithenhancedactivitiesandspecificity/therapeuticindex.JB/o/Chem280:12316-1232954.Kovacs,丄M.,Mant,C.T.andHodges,R,S.(2006)Determinationofintrinsichydropfiilicity/hydrophobicityofaminoacidside-chainsinpeptidesintheabsenceofnearest-neighbororconformationaleffects.8Zopo/ymers(PepWctesc/'encejinpress55.Dolan，丄W.(2002)Temperatureselectivityinreversed-phasehighperformanceliquidchromatography.JC/7ramatogfr/\965:195-20556.Powers,丄P,，Rozek，A.andHancock,R.E.(2004)Structure-activityrelationshipsforthebeta-hairpincationicantimicrobialpeptidepolyphemusini.8/oc/)//r78/0p勿ys>Acfa1698:239-25057.Wade,D.，Boman，A.，Wahlin，B.,Drain,C.M.，Andreu,D.，Boman,H.G.andMerrifield，R.B.(1990、All-daminoacid-containingchannel-formingantibioticpeptides.Prac/Vaf/iAcadSc/'"87:4761-476558.Hoiby,N.andKoch,C.(1990)Cysticfibrosis.1.Pseucfomonasaenvg/nosainfectionincysticfibrosisanditsmanagement.Thorax45:881-88459.Elkin,S.andGeddes,D.(2003)Pseudomonalinfectionincysticfibrosis:Thebattlecontinues.ExpertReiMW/nfeC7Ter1:609-61860.Pierce,G.E.(2005)Psei/cfomonasaenyg/nosa,cand/cfaato/cans,anddevice-relatednosocomialinfections:Implications,trends,andpotentialapproachesforcontrol.J/nd緣crab,'o/B,'otechno/32:309-31861.Obritsch,M.D.，Fish,D.N.,Maclaren,R.andJung,R.(2005)Nosocomialinfectionsduetomultidrug-resistantpseudomonasaeruginosa:Epidemiologyandtreatmentoptions.P/7amaco仿erapy25:1353-136462.Al-Bakri，A.G.,Gilbert,P.andAllison,D.G_(2005)Influenceofgentamicinandtobramycinonbinarybiofilmformationbyco-culturesof8w次/7o/cte〃'acepac/aandPset/ctomonasaenvg/'nosa.J8as/.cA^craib/'o/45:392-39663.Bodmann，K.F.(2005)Currentguide卩nesforthetreatmentofseverepneumoniaandsepsis.C/7emof/7erapy51:227-23364.Avrahami,D.andShai，Y.(2002)Conjugationofamagaininanaloguewithlipophilicacidscontrolshydrophobicity,solutionassembly,andcellselectivity.8/'ochem/'s^y41:2254-226365.Wieprecht,T.,Dathe,M.,Beyermann,M,，Krause,E.,Maloy，W丄.，MacDonald,D丄.andBienert,M.(1997)Peptidehydrophobicitycontrolstheactivityandselectivityofmagainin2amideininteractionwithmembranes.S/0c/7em/sfry36:6124-613266.Kustanovich，I.,Shalev,D.E.,Mikhlin，M,,Gaidukov,LandMor,A.(2002)Structuralrequirementsforpotentversusselectivecytotoxicityforantimicrobialdermaseptins4derivatives.J8/0/Crtem277:16941-1695167.Tachi,T.，Epand,R.F.，Epand,R.M.andMatsuzaki,K.(2002)Position-dependenthydrophobicityoftheantimicrobialmagaininpeptideaffectsthemodeofpeptide-lipidinteractionsandselectivetoxicity.8/oc/em/s//y41:10723-1073168.Lugtenberg,B.andVanAlphen,L(1983)Moleculararchitectureandfunctioningoftheoutermembraneofescherichiacoliandothergram-negativebacteria.8/bch/'mB/ophys>Ac/a737:51-11569.Zilberstein,D.,Schuldiner,S.andPadan,E.(1979)Protonelectrochemicalgradientin￡sc/7e〃.c/i/'aco/,'cellsanditsrelationtoactivetransportoflactose.B/'ochem,'sfry18:669-67370.Boman,H.G.(2003)Antibacterialpeptides:Basicfactsandemergingconcepts.J/ntem/Vfec/254:197-21571.Dathe，M.，Schumann,M.，Wieprecht,T.,Winkler,A.,Beyermann,M.,Krause，E,,Matsuzaki，K.，Murase,O.andBienert,M.(1996)Peptidehelicityandmembranesurfacechargemodulatethebalanceofelectrostaticandhydrophobicinteractionswithlipidbilayersandbiologicalmembranes.8Zochem/'sf/y35:12612-1262272.Wieprecht,T.,Dathe,M.,Krause，E.,Beyermann,M.，Maloy,W丄.，MacDonald,D丄.andBienert,M.(1997)Modulationofmembraneactivityofamphipathic，antibacterialpeptidesbyslightmodificationsofthehydrophobicmoment.F￡8SLeft417:135-14073.Blondelle,S.E.andHoughten,R.A.(1991〉Hemolyticandantimicrobialactivitiesofthetwenty-fourindividualomissionanaloguesofmelittin.S/oche/ro'sf/y30:4671-467874.Kiyota,T.,l_ee,S.andSugihara,G.(1996〉Designandsynthesisofamphiphilicalpha-helicalmodelpeptideswithsystematicallyvariedhydrophobic-hydrophilicbalanceandtheirinteractionwithlipid-andbio-membranes.SZocrtem/'s^y35:13196-1320475.Blondelle,S.E,,Lohner，K.andAguilar,M.(1999)Lipid-inducedconformationandlipid-bindingpropertiesofcytolyticandantimicrobialpeptides:Determinationandbiologicalspecificity.8/'oC8/op/7ysActe1462:89-10876.Hancock,R.E.andRozek,A.(2002)Roleofmembranesintheactivitiesofantimicrobialcationicpeptides.FOWSM,'crobZo/Leff206:143-14977.Sitaram,N.andNagaraj,R.(1999)Interactionofantimicrobialpeptideswithbiologicalandmodelmembranes:Structuralandchargerequirementsforactivity.8/'oc/7/mB/ophysAc/a1462:29-5478.Shai，Y.(1999)Mechanismofthebinding,insertionanddestabilizationofphospholipidbilayermembranesbyalpha-helicalantimicrobialandcellnon-selectivemembrane-l"icpeptides.8/.oc/7/m8/'op/7ys/Acte1462:55-7079.Matsuzaki,K.(1999)Whyandhowarepeptide-lipidinteractionsutilizedforself-defenseMagaininsandtachyplesinsasarchetypes.S/'ocWmS/ophysAcfa1462:1-1080.Chen,Y.，Mehok,A.R.,Mant,C.T.andHodges,R.S.('2004)Optimumconcentrationoftrifluoroaceticacidforreversed-phaseliquidchromatographyofpeptidesrevisited.JC/7ramatogf厂A1043:9-1881.Reddy,K.V.,Yedery，R.D.andAranha,C.(2004)Antimicrobialpeptides:Premise^andpromises,/n"AnWmZcrab/Agente24:536-54782.Brogden,K.A.(2005)Antimicrobialpeptides:PoreformersormetabolicinhibitorsinbacteriaA/af尺ev.M/craiWo/3:238-25083.Bland,丄M.,DeLucca,A.丄，Jacks,T.丄andVigo,C.B.(2001)AII-D-cecropinb:Synthesis,conformation,lipopolysaccharidebinding,andantibacterialactivity.Mo/Ce//S/'ocftem218:105-11184.DeLucca,A.丄，Bland,丄M.,Vigo,C.B.,Jacks,T.丄，Peter,丄andWalsh,T.丄(2000)D-cecropinb:Proteolyticresistance,lethalityforpathogenicfungiandbindingproperties.301-30885.Cribbs,D.H.,Pike,C.丄，Weinstein,S丄.，Velazquez,P.andCotman,C.W.(1997)M-D陽enantiomersofbeta-amyloidexhibitsimilarbiologicalpropertiestoall-L-beta-amyloids.J8/0/Crtem272:7431-743686.Hamamoto,K.,Kida,Y.,Zhang,Y.,Shimizu,T.andKuwano,K.(2002)AntimicrobialactivityandstabilitytoproteolysisofsmalllinearcationicpeptideswithD-aminoacidsubstitutions./WcrobZo//mmuno/46:741-74987.曰mquist,A.andLangel,U.(2003)InvitrouptakeandstabilitystudyofpVECanditsall-Danalog.BZo/C/7em384:387-39388.Hong,S.Y.，Oh,丄E.andLee,K.H.(1999)EffectofD-aminoacidsubstitutiononthestability,thesecondarystructure,andtheactivityofmembrane-activepeptide.8/'oc/jemP/7armac0/58:1775-178089.Wakabayashi,H.,Matsumoto,H.，Hashimoto,K.,Teraguchi，S.,Takase，M.andHayasawa，H.(1999)N-acylatedandDenantiomerderivativesofanonamercorepeptideoflactoferricinBshowingimprovedantimicrobialactivity.>Anf''m/'crab匆enteChemo仍e厂4'3:1267-126990.Guo,D,，Mant,C.T.，Taneja,A.K.,Parker,丄M.R.andHodges,R.S.(1986)Predictionofpeptideretentiontimesinreversed-phasehigh-performanceliquidchromatography.I.Determinationofretentioncoefficientsofaminoacidresiduesusingmodelsyntheticpeptides.JC/7ramatogr359:499-51891.ZhangL，RozekA,HancockRE.Interactionofcationicantimicrobialpeptideswithmodelmembranes.JBiolChem.2001276:35714-22.美国专利文件6906035,6818407，6747007,6465429,6358921，6337317,6297215，6288212，6191254，6172185,6057291，6040435,5877274,5789377，5707855,5688767,5593866,20030228324，20030021795,6872806.权利要求1.一种具有抗微生物活性的多肽，所述多肽具有从SEQIDNO1衍生的序列，并具有比SEQIDNO1改进的一种或者多种生物性能，其中所述的一种或者多种生物性能选自由抗菌活性、溶血活性、稳定性和针对微生物的治疗指数所组成的组。2.根据权利要求1中所述的多肽，其中所述的多肽选自由SEQIDNO:2,4-14,16-25，27-39SEQIDNO:及本申请中提到的其它多肽所组成的组；这里所述的其它多肽不包括SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:15及SEQIDNO:26的多肽。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽的整体表面疏水性范围为大约176~大约224。4.根据权利要求1~3中任一项所述的多肽，其中所述多肽的整体表面亲水性为大约-33~大约-48。5.根据权利要求1~4中任一项所述的多肽，其中所述的多肽长度为大约23~大约26个氨基酸。6.根据权利要求1~5中任一项所述的多肽，其中所述的多肽具有核心序列KSFLKTFKSAKlKTVLHTALKA(SEQIDNO:51)。7.根据权利要求1~5中任一项所述的多肽，其中所述的多肽具有核心序列KSFLKTFKSAKdKTVLHTALKA(SEQIDNO:52)。8.根据权利要求17中任一项所述的多肽，其中所述的多肽呈D-型构象。9.根据权利要求1~8中任一项所述的多肽，其中所述的多肽选自由SEQIDNO:6、SEQIDNO:SEQIDNO:9、SEQIDNO:SEQIDNO:24和SEQIDNO:SEQIDNO:25所组成的组。10.—种具有抗菌活性的多肽，所述多肽包括具有通式KWKSFLKTFK且A^(TVLHTALKAISS(SEQIDN0:40)的序列，其中§和&是选自由L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸所组成的组。11.根据权利要求10所述的多肽，其中b为L-赖氨酸或D-丙氨酸。12.根据权利要求10所述的多肽，其中b为D-赖氨酸，其它氨基酸均为D-型对映异构体。13.根据权利要求10所述的多肽，其中b为L-丙氨酸，其它氨基酸均为D-型对映异构体。14.多肽D-NKo(SEQID24〉。15.—种用于控制由微生物所引起的感染的治疗组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的至少一种权利要求114任一项所述的抗菌多肽的和药剂学上可以接受的载体。16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述的多肽选自由权利要求10~14所述的多肽所组成的组。17.根据权利要求15所述的组合物，其中所述的微生物选自由细菌、真菌、病毒和原生动物所组成的组。18.—种控制微生物的方法，其包括给药治疗有效量的组合物的步骤，其中所述的组合物包括至少一种权利要求114任一项所述的抗微生物多肽。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述的微生物选自由革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌所组成的组。20.根据权利要求要求18或19所述的方法，其中所述的控制是抑制所述微生物的生长、复制或感染。21.根据权利要求18~20中任一项所述的方法，其中所述的抗微生物多肽选自由权利要求1114所述的多肽组成的组。22.—种治疗有需求的对象或预防由微生物引起的对象感染的方法，其中所述方法包括为所述对象注射治疗有效量的组合物的步骤，其中所述组合物包括至少一种权利要求1~14中任一项所述的抗微生物多肽和药剂学上可以接收的载体。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的抗微生物多肽是选自由权利要求10~14所述的多肽所组成组的一种多肽。24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述的微生物选自由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌所组成的组。25.根据权利要求22~24中任一项所述的方法，其中所述的微生物是革兰氏阳性细菌。26.根据权利要求22~24中任一项所述的方法，其中所述的微生物是革兰氏阴性细菌。27.—种消毒物体表面的方法，所述方法包括将有效量的组合物应用到所述表面的步骤，其中所述组合物包括至少一种权利要求114任一项所述的抗微生物多肽。28.—种消毒溶液，其包含至少一种权利要求114任一项所述的抗菌肽以及可选择地包括可以接受的载体。29.—种多肽，其包括SEQIDNO:2。30.—种多肽，其其包括SEQIDNO:l的衍生物。31.—种多肽，其选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:414、和SEQIDNO:l&25所组成的组。32.—种多肽，其包括权利要求31所述的多肽的衍生物。33.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括至少一个氨基酸残基被取代。34.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括至少一个氨基酸残基的取代，但不包括SEQIDNO:l。35.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括在多肽序列的一端缺失至少一个氨基酸残基所产生的衍生物。36.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所述的衍生物包括在多肽序列的一端缺失至少两个氨基酸残基所产生的衍生物。37.要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用疏水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。38.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用亲水氨基酸残基取代疏水氨基酸残基。39.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用不同的亲水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。40.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用不同的亲水氨基酸残基取代亲水氨基酸残基。41.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用D-型氨基酸残基取代L-型氨基酸残基。42.根据权利要求33或34所述的多肽，其中所述的取代是用L-型氨基酸残基取代D-型氨基酸残基。43.根据权利要求30或32所述的多肽，其中所有的残基都是D-型氨基酸残基。44.一种多肽，其包括序列KWKSFLKTFKaAbKTVLHTALKAISS(SEQIDNO:40)其中a和b选自由下述氨基酸所组成的组L-亮氨酸、D-亮氨酸、L-缬氨酸、D-缬氨酸、L-丙氨酸、D-丙氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、D-丝氨酸、L-赖氨酸和D-赖氨酸。45.根据权利要求44所述的多肽，其不包括SEQIDNO:l。全文摘要本发明公开了具有可利用的、增强的或者优越性能的新型抗微生物多肽，如抗微生物活性、期望的溶血活性水平及针对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌以及其它带有脂双层膜的细胞成分或结构组分的微生物的广谱治疗系数。同时也提供了制造和使用这些多肽来控制微生物生长及用做药用成分来治疗或预防由这些微生物所引起的感染的方法。一些多肽被公开为是利用以抗微生物肽V₆₈₁为基础进行与结构相关的多肽设计而得到的，其包括在非极性表面或者极性表面的中心或附近位点进行单一的D-/L-氨基酸取代或带电氨基酸取代。还公开了带有一个或多个D-型氨基酸的多肽，包括所有氨基酸均由D-型氨基酸组成的多肽。这里所述的经过修饰的多肽可以被证实为据有以下特性的一个或多个，例如增强的抗微生物活性、抗微生物特异性、及抵抗降解的能力。这里所述的组合物具有作为广谱抗生素的临床应用潜力。文档编号A61K38/00GK101111256SQ200580047492公开日2008年1月23日申请日期2005年12月15日优先权日2004年12月15日发明者罗伯特E·W·汉考克,罗伯特S·霍金斯,苏珊W·法莫,迈克尔·瓦兹,陈育新申请人:科罗拉多大学