专利名称：三棱栎的组培方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种濒危植物三棱栎的组培繁殖方法。
背景技术：
三棱属(Trigonobalanus Forman)是现存壳斗科植物的原始类群，其中三棱栎(Trigonobalanus doichangensis(A.Camus)Forman被认为是该属3个种中最原始种类，是研究壳斗科植物系统演化及大陆漂移和环境变迁的重要材料，有极高的科学研究价值，为国家2级重点保护植物。三棱栎零星分布于我国云南的沧源、西盟、孟连和澜沧以及泰国北部的狭小范围内，其生境极度破碎化，种群脆弱，处于濒危状态。目前，三棱栎保护生物学方面已进行了较为深入的研究，而其组织培养的研究尚未见报道。三棱栎是一种优良的薪炭树种和有广阔应用潜力的园林新植物，研制出三棱栎的组培快繁方法，对大量苗木的需求、种质离体保存以及具有特殊观赏性状单株的利用，实现该物种种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体等方面均具有重要意义。
发明内容
针对现有技术未有濒危植物三棱栎的组织培养方法的报道，本发明的目的在于提供一种濒危植物三棱栎的组培繁殖方法方法，该方法为大量苗木的需求、种质离体保存以及具有特殊观赏性状单株的利用，实现三棱栎种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体提供了具体可行的技术方案和方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案三棱栎的组培方法，取三棱栎实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体，浸泡、冲洗、消毒，接种到不加激素的White启动培养基上，然后将无菌苗去掉基部叶片，切成茎段，接种在增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或White+6-BA 0.2mg·L-1+IAA0.1mg·L-1上，然后取增殖培养产生的丛芽接种于生根培养基White+IAA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1上进行诱导生根，待长出不定根小植株后移栽，以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH5.8，培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
上述方法中，外植体用1％肥皂水侵泡3-5分钟，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30秒，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4-7分钟，再用无菌水冲洗6-8次，接种到启动培养基上。
上述方法中，将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在增殖培养基上。
上述方法中，将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于生根培养基上。
本发明的更具体地方法是取2年生三棱栎实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体，用1％肥皂水侵泡3-5min，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30s，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4-7min，再用无菌水冲洗6-8次，接种到不加激素的White启动培养基上，观察顶芽或腋芽诱导和萌动情况，将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或White+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.1mg·L-1上，观察三棱栎增殖及生长情况，将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于生根培养基White+IAA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1上进行诱导生根，观察三棱栎生根情况，待30天后可获得2-3条不定根的小植株，移栽，以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH5.8，培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
具体实施例方式下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限制本发明。
实施例1取2年生三棱栎实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体，用1％肥皂水侵泡3-5min，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30s，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4-7min，再用无菌水冲洗6-8次，接种到不加激素的White启动培养基上，观察顶芽或腋芽诱导和萌动情况，将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或White+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.1mg·L-1上，观察三棱栎增殖及生长情况，将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于生根培养基White+IAA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1上进行诱导生根，观察三棱栎生根情况，待30天后可获得2-3条不定根的小植株，移栽，以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH5.8，培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
更具体地，上述方法可进一步描述为1、材料与方法以2年生实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体。用1％肥皂水侵泡3-5min，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30s，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4～7min，再用无菌水冲洗6-8次，接种到启动培养基上，观察顶芽或腋芽诱导和萌动情况；将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在不同培养基种类、不同激素和不同激素浓度配比的增殖培养基上进行增殖培养，观察三棱栎增殖及生长情况；将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于不同生长素和不同生长素浓度配比的生根培养基上进行诱导生根，观察三棱栎生根情况。
①启动培养基不加激素的White、1/2MS、1/4MS、MS和H五种培养基。
②增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1(单位下同)+IAA0.1；White+6-BA0.2+IAA0.1；White+6-BA0.5+IAA0.2；1/4MS+6-BA0.1+IAA0.1；1/4MS+6-BA0.2+IAA0.1；1/4MS+6-BA0.5+IAA0.2。
③生根培养基White+IAA0.5；White+IBA0.5；White+NAA0.5；White+IAA0.5+IBA0.5；White+NAA0.5+IBA0.5；White+IAA0.5+NAA0.5；White+IAA0.5+IBA0.5+NAA0.5。
以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH5.8。培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
2、结果与讨论(1)不同培养基对三棱栎生长的影响以下5种培养基中均不加激素。试验结果表明，White培养基较适宜三棱栎的生长。
顶芽和侧芽接种一周后，在MS培养基中褐化现象明显，外植体死亡率达25％。在1/2MS和H培养基中的外植体，基部开始形成乳白色的愈伤组织，愈伤组织不断长大后容易老化，最终变为褐色。此时，若不把愈伤组织切去转入新的培养基，芽条也会逐渐死亡，切去愈伤组织后转入新的培养基中的芽体，其基部很快又形成大量的愈伤组织。在White和1/4MS培养基中的芽条生长较好，基部产生的愈伤组织少，褐化现象不明显。分析White和1/4MS培养基成分，相对其它三种培养基而言，盐类要低一些，表明三棱栎的外植体适宜于低盐环境。
(2)不同激素及不同激素浓度对三棱栎增殖生长的影响试验结果表明，三棱栎增殖数量与细胞分裂素关系密切，三棱栎生长好坏与培养基中盐类有关。最佳的激素组合为6-BA0.1～0.2+IAA0.1；最佳的培养基为White。转接30d后增殖倍数达4.3，植株高度达3.2cm。随培养时间的延长和激素浓度的加大，愈伤组织形成速度也加快，而芽的生长明显受到抑制。
(3)不同激素及不同激素浓度对三棱栎生根的影响一般来说，木本植物扦插或组培生根都较草本困难，三棱栎也不例外。对生长势好、高2-3cm的三棱栎顶生芽条进行诱导生根，结果表明，低浓度生长素的培养基诱导生根较困难，而生长素浓度过高，其芽条基部容易产生愈伤组织。在White+IAA0.5+NAA0.5的培养基中生根效果最好，达到78％，约30天后可获得2-3条不定根的小植株。
3、本发明的有益效果在于通过对三棱栎离体培养可得出以下结论(1)三棱栎可以通过组培技术实现快速繁殖，满足园林绿化、三棱栎回归引种(Re-introduction)和种群人工重建(Populationrestoration)对苗木的需求。
(2)三棱栎可以利用组培技术对特定居群内关键个体种质进行离体保存。
(3)有关壳斗科植物组培快繁研究，国内仅见对栓皮栎Quercusvariabilis有过报道。本发明筛选出的丛芽增殖率为4.3、生根率为75％的三棱栎离体保存与组培快繁的培养基配方，以及三棱栎组织培养和离体保存方法，国内外没有资料报道。
(4)组培繁殖技术研究对三棱栎栽培的种子苗后代观察显示，三棱栎的单株间不但存在形态上的差异性，同时在生长发育方面(如生长速度等)也有所不同；另外，三棱栎虽可进行扦插繁殖，但从园林利用对大量苗木的需求、种质离体保存以及具有特殊观赏性状单株的利用等方面来讲，通过组培实现快繁更有意义。本发明以栽培的三棱栎实生苗的顶芽，对其组培繁殖及种质离体保存等进行了研制。实现了人工快繁，具有现实意义。
权利要求
1.三棱栎的组培方法，其特征在于取三棱栎实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体，浸泡、冲洗、消毒，接种到不加激素的White启动培养基上，然后将无菌苗去掉基部叶片，切成茎段，接种在增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或White+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.1mg·L-1上，然后取增殖培养产生的丛芽接种于生根培养基White+IAA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1上进行诱导生根，待长出不定根小植株后移栽，以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH 5.8，培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
2.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于外植体用1％肥皂水侵泡3-5分钟，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30秒，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4-7分钟，再用无菌水冲洗6-8次，接种到启动培养基上。
3.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在增殖培养基上。
4.根据权利要求1所述的组培方法，其特征在于将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于生根培养基上。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的组培方法，其特征在于取2年生三棱栎实生苗幼嫩顶芽或侧芽作外植体，用1％肥皂水侵泡3-5min，蒸馏水冲洗数次后，在超净工作台上用70％的酒精侵润30s，无菌水冲洗1次后，用0.1％的HgCl2溶液消毒4-7min，再用无菌水冲洗6-8次，接种到不加激素的White启动培养基上，观察顶芽或腋芽诱导和萌动情况，将启动培养获得的无菌苗在无菌条件下，去掉基部叶片，切成长2cm左右含1-2个腋芽的茎段，接种在增殖培养基White+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或White+6-BA0.2mg·L-1+IAA0.1mg·L-1上，观察三棱栎增殖及生长情况，将增殖培养产生的丛芽，选取2-3cm长的顶芽接种于生根培养基White+IAA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1上进行诱导生根，观察三棱栎生根情况，待30天后可获得2-3条不定根的小植株，移栽，以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH 5.8，培养温度为23±1℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000-1500Lx。
全文摘要
提供一种濒危植物三棱栎的组培繁殖方法方法，该方法为大量苗木的需求、种质离体保存以及具有特殊观赏形状单株的利用，实现三棱栎种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体提供了具体可行的技术方案和方法。
文档编号C12N5/04GK1899028SQ200610011068
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者孙卫邦, 周元, 向其柏, 罗桂芬 申请人:中国科学院昆明植物研究所