专利名称：晚春含笑的组织培养繁殖方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种木兰科植物晚春含笑的组织培养繁殖方法。
背景技术：
木兰科(Magonliaceae)是古老的被子植物类群，该种群植物日趋减少濒危。其中含笑属(Michelia)植物有许多是重要的园林观赏植物，并具有较高经济价值，从该属中分离出多种倍半萜内酯，有些具有抗癌活性；晚春含笑是以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的品种。树形优美、常绿、白色花有香味、灌木，是理想的庭园观赏树种；进行组织培养无性繁殖技术研究对保持它的杂交优势，新品种推广具有现实应用价值。目前，木兰科植物一般通过播种和嫁接来繁殖，扦插繁殖生根率低对母树伤害大，组织培养技术难度较大，现有技术中未有晚春含笑组织培养快速繁殖的方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种晚春含笑组织培养快速繁殖的方法，该方法取1-2年生晚春含笑幼龄树茎段作外植体，用幼龄树外植体建立起无菌系，增殖系数高，采用二步法生根使小苗健壮，繁殖过程畅通，生根效果好，移栽成活率可达到90％。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案晚春含笑的组织培养繁殖方法，主要包括诱导分化培养、继代增植培养、生根培养、移栽步骤，以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l为诱导分化培养基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l为继代增殖培养基，MS+NAA2mg/l为生根培养基进行二次生根。
上述方法中，诱导分化培养优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。
二次生根是将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养。
移栽所用基质优选过筛的红土和腐质土2∶1的混合基质，栽培场地优选玻璃钢温室。移栽所用基质进一步优选草莓土加红土1∶1的混和基质，过筛后500倍液白菌清消毒，初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
更具体地，本发明的技术方案优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基MS+NAA2mg/l中50-60天，将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养；然后将具有3条根的苗移栽入草莓土加红土1∶1的混和移栽基质，过筛后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
具体实施例方式下面用本发明的实施例来进一步说明本发明，但本发明内容不以实施例为限。
实施例1取以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基MS+NAA2mg/l中50-60天，将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养；然后将具有3条根的苗移栽入草莓土加红土1∶1的混和移栽基质，过筛后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
下面用本发明的详细试验过程和结果来进一步详细阐述本发明。
一.材料和方法取以球花含笑(M.sphaerantha)为母本，云南含笑(M.yunnanensis)为父本，属内种间杂交F1筛选培育出来的能开花结籽的晚春含笑成年树的当年生枝条，叶片；取扦插试验成活的晚春含笑1-2年生植株上萌发的枝条、叶片，作外植体诱导对象，取材时间分不同时期，成年树取材分基部和中部以上两种。
材料取回后将老叶剪去露出腋芽，去掉已木质化部分茎段，留下嫩茎、幼叶，用自来水冲洗一段时间，毛笔轻轻刷干净后，75％酒精浸泡30s，转入0.1％的HgCl2溶液消毒，叶片消毒5-6min，茎段消毒8-10min，然后用无菌水冲洗4-5次备用。培养基(1)MS+KT2mg/l(单位下同)+NAA0.2，(2)MS+KT1+NAA0.2，(3)MS+BA1+NAA0.2，(4)MS+BA0.8+NAA0.2，(5)MS+2，4-D1，(6)MS+BA1+NAA0.2+AC0.3g/l，(7)MS+BA0.8+NAA0.2+AC0.3g/l，以上培养基均加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％，PH5.6，50ml三角瓶作初次接种培养容器，高压锅蒸汽灭菌120℃、18min，培养室温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。生根培养(8)MS+IBA3，(9)MS+NAA3，将消毒好的茎段切为0.5cm带腋芽的小段，叶片切割为0.5cm2的片状，分别接种到以上(1)-(7)培养基中，放入培养室培养。移栽基质为过筛的红土和腐质土，混合物比例为2∶1，栽培场地为玻璃钢温室。
二.结果与分析1.叶接种在(1)(2)(3)(4)(5)培养基培养2-3周，在材料切口四周，叶背面的叶脉上，生长出许多愈伤组织，它们呈绿色颗粒状，有的呈白色粉状，其中(3)(4)(5)比(1)(2)生长快，4-5周后将它们转入相同的新鲜培养基中培养观察，愈伤组织能继续增多，但未见分化出苗，若不转瓶，在原培养基继续培养到6-8周，培养基褐化严重，材料也逐渐褐化死亡，成年树、幼树叶片培养表现基本一致无差别。
2.幼树茎段接种在(1)(2)(3)(4)培养基中，四种激素组合都能使茎段腋芽分化，但诱导出芽的外形差异较大，(1)(2)诱导出的芽叶子细长、硬，丛芽萌发少或不发，(3)(4)诱导出的形态较粗壮正常，丛芽数较多。经多次试验总结认为，(3)MS+BA1+NAA0.2，最适合作外植体诱导培养基。继代增殖培养采用(4)MS+BA0.8+NAA0.2效果较好。培养过程中，培养基有褐化现象，但与成年树的对照相比较，褐化基本不影响生长分化，在现有设定的培养条件下，75天可以扩大4-6倍，用加活性碳的(6)(7)培养基来继代培养，能减少褐化，但同时也会抑制丛芽的生长分化，活性炭的用量不高但抑制现象却很明显。
3.成年树不同部位茎段培养结果差异较大，本实验将50cm以下划为基部，50cm以上划为上部，经过不同时期多次试验小结表明，上部茎段外植体接到培养基上成活率极低，几乎全部褐化死亡，基部茎段培养情况好于上部，有8-10％接种存活，这一现象与木兰科枝条扦插生根实验报道有相似之处，接活的材料在后期培养中褐化严重，经多次转代增殖效果仍然很差。
4.取自不同时期、不同植株的茎段外植体，诱导分化表现出的差异很大。成年树和扦插成活的幼树茎段对比实验表明幼树材料比成年树材料容易接种成活，褐化现象较轻，诱导分化时间短，相反，成年树外植体褐化严重，诱导分化时间较长(见表1)，表1不同时期不同植株茎段外植体接种生长情况
从表中统计的数字可看出，幼树外植体诱导分化较容易，接种死亡的原因主要是由于污染，材料褐化死亡数极少，接种最低成活率在50％以上，受季节影响不大；相反，成年树材料褐化严重，接种成活率低，诱导时间长，受季节影响大，诱导时间长，12月接种情况稍好，8月表现最差，接种存活的无菌系在后期的继代培养中，褐化严重，难分化。而幼树材料诱导出的丛芽长势明显好于成年树，后期增殖培养也明显有5.二步法生根法，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基(8)MS+IBA3，(9)MS+NAA3两种培养，30天左右开始长根，60天后进行生根统计，生根率在82％-88％，两种培养基生根情况不同，(8)诱导出的根约有1-2条，较细颜色较深，(9)诱导出的根约有2-3条，较粗色白，相比之下(9)比(8)诱导出的苗健壮；以下实验都用(9)作生根培养基，第一次生根完毕，苗的长势及根的长短参差不齐，不便于栽种，因此采用二次生根，将已生根的苗统一取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基，3-4周可促发5-7条侧根，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，集中接入培养基再次生根培养；这样可大大提高生根率，可形成健壮整齐的试管苗，便于统一移栽管理，用二步法生根可使晚春含笑的整个组培法繁殖过程畅通。
6.移栽，一般取具有3条根以上的正常苗移栽，移栽基质采用草莓土加红土1∶1的混和基质，过筛后500倍液白菌清消毒可用；移栽初期放入温室，保80％以上的湿度、白天温度25℃夜间不低于5℃，移栽成活率可达到90％以上。
下面再详细说明晚春含笑的杂交过程晚春含笑球花含笑(Michelia sphaerantha)(♀)X云南含笑(M.yunnanensis)(♂)，在母本花朵还未张开时，轻轻扳开花被片，去掉雄蕊，用父本的花粉给其受粉，然后将花被片复原而包裹雌蕊群，并套袋，约1星期后去袋。杂交时间为上午8:00-9:00。未成功的一个月左右落果。种子成熟后采集果实并阴干后收集种子，洗去油质外种皮，在室温下保湿沙藏。第二年早春播种，适时分苗移栽。观察实生苗的适应性及形态形状。
母本球花含笑(Michelia sphaerantha)常绿大乔木，幼枝被褐色绒毛。叶革质，倒卵状长圆形，先端具骤尖头，叶上面无毛，下面被短柔毛，中脉在叶面凹下，侧脉网络致密；叶柄无托叶痕。花白色，下垂，不张开，花被片12，长6-7.5cm，宽1-2.5cm，狭倒卵形，雄蕊长约2cm，雌蕊群被短柔毛，花期4-5月。
父本云南含笑(M.yunnanensis)常绿灌木，枝叶茂密，高可达4米芽、嫩枝、嫩叶上面及叶柄、花梗密被深红色平伏毛。叶硬革质，倒卵形、狭倒卵形或狭倒卵状椭圆形，长4-10cm，宽1.5-3.5cm，先端圆钝或短急尖，基部楔形，上面深绿色，下面残留平伏毛；托叶痕为叶柄长的2/3或达顶端毛下面灰白色。花梗粗壮，花白色，张开成一个平面或呈杯状，芳香，花被片6-12(17)，倒卵形或倒卵状椭圆形，长3-3.5cm，内轮较狭小，雄蕊长0.5-1cm，雄蕊群及雌蕊群柄均被红褐色平伏细毛，花期3-4月。
晚春含笑常绿灌木至小乔木，从茎基部开始分枝，分枝多而密，呈塔形芽、叶柄、幼叶两面被棕色短绒毛。叶革质，倒长卵形或长圆形，长6.5-16cm，宽2.5-5cm，先端具骤尖头或稍圆钝，基部楔形，叶面深绿色，叶面无毛，背面残留棕色短绒毛，中脉在叶面凹下，侧脉每边9-11，叶柄上托叶痕为叶柄长的1/3。花乳白色，花被片(7)11-12，狭倒卵形或匙形，长3.5-6cm，宽1-2cm，呈3轮排列，张开呈钟形。花期4-5月。晚春含笑于1998年首次育成，此后多次培育出了该杂交种，2003年春首次开花。
晚春含笑已于2005年6月21日提出植物品种权申请，已受理。受理部门国家林业局植物新品种保护办公室，申请号20050039，申请日2005年6月21日。
三.结论晚春含笑组织培养快速繁殖外植体适宜选择1-2年生幼龄树茎段。诱导分化培养基MS+BA1+NAA0.2，继代增殖培养基MS+BA0.8+NAA0.2，生根培养基为MS+NAA3。采用二步法生根，可使整个繁殖过程畅通。
杂交F1新品种“晚春含笑”的组织培养繁殖研究表明叶片较容易诱导出愈伤组织，但愈伤组织难以分化出芽，茎段培养能诱导出丛芽。成年树茎段诱导时间长、褐化严重、后期继代增殖表现差，不适合作外植体，取1-2年生幼龄树茎段较容易诱导分化，用幼龄树外植体建立的无菌系增殖系数高，适宜作组织培养快速繁殖的外植体来源。MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l，以上两种培养基对诱导和增殖培养效果较好，将1cm以上的芽留2-3片叶剪下，放在MS+NAA2mg/l比MS+IBA2mg/l生根培养基上生根效果好，采用二步法生根能使小苗健壮，繁殖过程畅通，在条件适宜有保护设施条件下，移栽成活率达到90％以上。
权利要求
1.晚春含笑的组织培养繁殖方法，主要包括诱导分化培养、继代增植培养、生根培养、移栽步骤，其特征在于以MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l为诱导分化培养基，MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l为继代增殖培养基，MS+NAA2mg/l为生根培养基进行二次生根。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于诱导分化培养优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所说二次生根是将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基质优选过筛的红土和腐质土2∶1的混合基质，栽培场地优选玻璃钢温室。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于移栽所用基质优选草莓土加红土1∶1的混和基质，过筛后500倍液白菌清消毒，初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
6.根据权利要求1或2或3或4或5所述的方法，其特征在于优选晚春含笑1-2年生幼龄树茎段为外植体，洗净，洒精浸泡，转入0.1％的HgCl2溶液中消毒8-10分钟，再用无菌水冲洗4-5次，切为0.5cm带腋芽的小段，接种于已加入0.8％琼脂固化，蔗糖3％并在120℃条件中灭菌18分钟，PH为5.6的MS+BA1mg/l+NAA0.2mg/l培养基中培养，培养温度24±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h.d-1；培养4-5周后，转入MS+BA0.8mg/l+NAA0.2mg/l培养基中继代增殖培养，8-10周，待分化出丛芽后，将1cm以上的芽留2-3片叶切下，接入生根培养基MS+NAA2mg/l中50-60天，将已生根的苗取出，将根截短保留一小部分集中接入培养基3-4周，待长出5-7条侧根时，将未诱导出根的苗切掉底部愈伤组织，再接入生根培养基进行二次生根培养；然后将具有3条根的苗移栽入草莓土加红土1∶1的混和移栽基质，过筛后500倍液白菌清消毒，移栽初期放入温室，保持80％以上的湿度，白天温度25℃，夜间不低于5℃。
全文摘要
一种以球花含笑(M. sphaerantha)为母本，云南含笑(M. yunnanensis)为父本，属内种间杂交F
文档编号C12N5/04GK1887065SQ20061001106
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者郭瑞贤, 胡虹, 何学葵, 曾德禄, 王 华, 龚洵 申请人:中国科学院昆明植物研究所, 云南绿大地生物科技股份有限公司