专利名称：三棱栎的胚状体诱导及培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种濒危植物三棱栎的胚状体诱导和培养方法。
背景技术：
三棱属(Trigonobalanus Forman)是现存壳斗科植物的原始类群，其中三棱栎(Trigonobalanus doichangensis(A.Camus)Forman被认为是该属3个种中最原始种类，是研究壳斗科植物系统演化及大陆漂移和环境变迁的重要材料，有极高的科学研究价值，为国家2级重点保护植物。三棱栎零星分布于我国云南的沧源、西盟、孟连和澜沧以及泰国北部的狭小范围内，其生境极度破碎化，种群脆弱，处于濒危状态。目前，三棱栎保护生物学方面已进行了较为深入的研究，而其组织培养和胚状体发生的研究尚未见报道。三棱栎是一种优良的薪炭树种和有广阔应用潜力的园林新植物，研制出三棱栎的组培快繁和胚状体诱导培养方法，对实现该物种种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体等方面均具有重要意义。
发明内容
针对现有技术未有濒危植物三棱栎的胚状体诱导和培养方法的报道，本发明的目的在于提供一种濒危植物三棱栎的胚状体诱导和培养方法，该方法为实现三棱栎种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体提供了具体可行的技术方案和方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案三棱栎的胚状体诱导及培养方法，取三棱栎坚果，浸泡后取出种胚消毒，冲洗，接种于无激素的MS种胚萌发培养基中培养，待胚萌发后转接于胚状体诱导培养基MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中，待愈伤组织表面出现颗粒状的胚状体并显绿色胚芽及微小的叶片分化时，将胚状体剥离，转接在分化培养基1/2MS+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或1/2MS+IAA0.1mg·L-1或1/2MS+IAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1中进行单体培养，待胚状体转绿形成完整的小植株，移栽。
上述方法中，坚果浸泡可选用蒸馏水浸泡2小时，种胚消毒可选用0.1％的HgCl2溶液消毒3～5分钟，用无菌水冲洗6～8次。
上述方法所用分化培养基可优选用MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。
实施例1取三棱栎(Trigonobalanus doichangensis(A.Camus)Forman坚果，用蒸馏水浸泡2小时后，取出种胚用0.1％的HgCl2溶液消毒3～5min，用无菌水冲洗6～8次，接种于无激素的MS种胚萌发培养基中培养，待胚萌发后转接于胚状体诱导培养基(1)MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或(2)MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中，待愈伤组织表面出现颗粒状的胚状体并显绿色胚芽及微小的叶片分化时，将胚状体剥离，转接在分化培养基(1)1/2MS+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或(2)1/2MS+IAA0.1mg·L-1或(3)1/2MS+IAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1中进行单体培养，待胚状体转绿形成完整的小植株，移栽。
下面用具体地试验方法、结果来说明本发明植物名称三棱栎(Trigonobalanus doichangensis(A.Camus)Forman材料类别种胚培养条件种胚萌发培养基无激素的MS；胚状体诱导培养基(1)MS+6-BA0.1mg·L-1+NAA0.05mg·L-1；(2)MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1；(3)MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1；(4)MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA1mg·L-1；(5)MS+2、4-D0.5mg·L-1；(6)MS+2、4-D1mg·L-1；(7)MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+2、4-D0.5mg·L-1；分化培养基(1)1/2MS+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1；(2)1/2MS+IAA0.1mg·L-1；(3)1/2MS+IAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1。以上培养基均加入2％蔗糖、0.7％琼脂，PH5.8。培养温度为(23±1)℃，光照时间12h·d-1，光照强度1000～1500lx。萌发情况将坚果放入蒸馏水中浸泡2h后，取出水底的坚果，在超净工作台上用手术刀剥去果皮，取出种胚(三棱栎的种子无胚乳)放入0.1％的HgCl2溶液消毒3～5min后，用无菌水冲洗6～8次，接种于种胚萌发培养基中进行培养，3d后胚开始萌发，胚根和下培轴迅速生长，一周后长出2片扇形子叶，但胚芽生长缓慢。种胚萌发率在95％以上，比土壤中播种的萌发率高出25％。
胚状体形成将萌发胚转接于胚状体诱导培养基(1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)中，在相同培养条件下，两周后子叶上形成愈伤组织，愈伤组织呈乳白色，随着愈伤组织的不断产生和累积，(2)和(3)培养基在愈伤组织的表面出现颗粒状的胚状体，肉眼可见绿色胚芽及微小的叶片分化；(4)(5)(6)(7)培养基产生大量的质地松软的愈伤组织，未见胚状体发生，愈伤组织老化较快；(1)培养基仅苗的基部有少量的愈伤组织，无胚状体产生，真叶伸出。
因此，胚状体诱导培养基选择用(2)MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或(3)MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1。
胚状体分化生长将胚状体剥离后转接在分化培养基(1)(2)(3)上进行单体培养，胚状体逐渐转绿形成完整的小植株状。在(2)培养基中胚状体分化率高于(1)、(3)培养基。因此，分化培养基选择用(2)1/2MS+IAA0.1mg·L-1。
本发明的有益效果三棱属(Trigonobalanus Forman)是现存壳斗科植物的原始类群，其中三棱栎是该属3个种中最原始种类，是研究壳斗科植物系统演化及大陆漂移和环境变迁的重要材料，有极高的科学研究价值，受国家2级重点保护。三棱栎零星分布于我国云南的沧源、西盟、孟连和澜沧以及泰国北部的狭小范围内，其生境极度破碎化，种群脆弱，处于濒危状态。现有技术对三棱栎保护生物学方面已进行了研究，而有关其组织培养和胚状体发生的研究尚未见报道。三棱栎是一种优良的薪炭树种和有广阔应用潜力的园林新植物，研究其组培快繁和胚状体诱导培养，对实现该物种种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体等方面具有重要意义。
权利要求
1.三棱栎的胚状体诱导及培养方法，其特征在于取三棱栎坚果，浸泡后取出种胚消毒，冲洗，接种于无激素的MS种胚萌发培养基中培养，待胚萌发后转接于胚状体诱导培养基MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1或MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.5mg·L-1中，待愈伤组织表面出现颗粒状的胚状体并显绿色胚芽及微小的叶片分化时，将胚状体剥离，转接在分化培养基1/2MS+6-BA0.1mg·L-1+IAA0.1mg·L-1或1/2MS+IAA0.1mg·L-1或1/2MS+IAA0.1mg·L-1+IBA0.1mg·L-1中进行单体培养，待胚状体转绿形成完整的小植株，移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于坚果浸泡选用蒸馏水浸泡2小时，种胚消毒选用0.1％的HgCl2溶液消毒3～5分钟，用无菌水冲洗6～8次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于分化培养基优选用MS+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.1mg·L-1。
全文摘要
提供一种濒危植物三棱栎的胚状体诱导和培养方法，该方法为实现三棱栎种质资源的有效保护、持续利用和人工获得遗传背景丰富的三棱栎群体提供了具体可行的技术方案和方法。
文档编号C12N5/04GK1899029SQ200610011069
公开日2007年1月24日 申请日期2006年7月24日 优先权日2006年7月24日
发明者孙卫邦, 罗桂芬, 向其柏 申请人:中国科学院昆明植物研究所